연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

요약

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

초록

연골 엔지니어링은 기본 조직과 유사한 체외 기능 임플란트를 만드는 어려움으로 인해 도전 남아있다. 최근자가 교체의 개발을위한 탐구 접근 방법은 연골 세포로 줄기 세포의 분화를 포함한다. 이 연골, 필요한 줄기 세포의 압축 정도를 시작하려면; 따라서, 우리는 세포 어 트랙터로 소형화 자장 소스를 사용, 두꺼운 발판과 발판이없는 내 모두 자기 응축 세포의 가능성을 보여 주었다. 이 자기 방식도 집계 융합을 안내하고 비계가없는 조직 구축하는 데 사용 된, 3 차원 (3D)은 크기가 몇 mm를 어떤 조직이. 강화 된 크기를 갖는 외에, 자기 구동에 의해 형성된 융합 조직 콜라겐 II의 발현의 상당한 증가를 제공하고, 유사한 경향 aggrecan 발현이 관찰되었다. 네이티브 연골은 힘 t 하였다으로모자의 3 차원 구조에 영향을 동적 숙성도 수행 하였다. 기계적인 자극을 제공하는 생물 반응기에서는 21 일 동안 배양하여 자기 시드 지지체를 이용 하였다. 생물 반응기의 성숙은 크게 cellularized 지지체에 연골을 개선; 이러한 조건에서 얻어진 세포 외 기질은 콜라겐 II 및 aggrecan 풍부 하였다. 이 작업은 개선 된 연골 세포 분화, 양쪽 발판없고 내의 다당류 골격 용 생물 반응기에 표시된 줄기 세포의 자기 축합 동적 숙성 혁신적인 전위를 설명.

서문

자기 나노 입자는 이미 자기 공명 영상 (MRI)을위한 조영제로 병원에서 사용하고 있으며, 자신의 치료 응용 프로그램을 확대 유지. 예를 들어, 최근 표지 세포 주입 ^{1, 2, 3의} 정의 된 부위에서 외부 자기장을 이용하여 생체 내에서 조작 될 수 있고, 지시 된 수 및 / 또는 유지하는 것이 밝혀졌다. 재생 의학, 그들은 혈관 조직 ^{5, 6, 7,} 골 ^8, 연골 ^(9)를 포함하여 체외 ⁴ 조직 조직, 엔지니어링 할 수 있습니다.

관절 연골이 손상이 발생할 때 매우 제한된 세포 외 기질 성분의 수리를, 무혈성 환경 내에 침지된다. 이러한 이유로, researc 위해H는 현재 결함 부위에 이식 할 수 유리질 연골 대체의 기술에 집중된다. 다른 연골 ^{(12, 13)로} 분화하는 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 용량을 강조하면서자가 여분을 생성하기 위해, 몇몇 연구 그룹은 셀 소스 ^{(10), (11)자가} 연골 세포의 사용을 연구하고있다. 자신의 골수 채취가 매우 간단하고 자신의 표현형 ^(14)를 잃을 위험이 건강한 연골 세포의 희생을 필요로하지 않기 때문에 여기에 효과적으로 요약 이전의 연구에서, 우리는 MSC를 선택했습니다.

줄기 세포의 연골 분화를 시작하기에 필수적인 초기 단계는 자신의 응축이다. 셀 집계는 일반적으로 원심 분리 또는 micromass 문화 ^(15)을 사용하여 형성된다; 그러나, 이러한 방법은 축합 neitheR 두꺼운 발판이나 골재의 융합을 조절하는 세포 내 전위 클러스터를 생성 할 가능성을 제시한다. 본 논문에서는 MSC 자기 라벨 및 자기 인력을 이용하여 줄기 세포를 응축에 대한 혁신적인 접근 방식을 설명합니다. 이 기술은 밀리미터 크기의 연골 조직 ^(9)을 얻기 위해 서로 골재의 융합을 통해 비계가없는 3 차원 구조를 형성하기 위해 입증되었습니다. 두껍고 큰 비계의 자기 시드 또한 설계 조직의 크기를 증가 이식에 대한 더 쉽게 도움을 모양을 디자인하고, 연골 수리 임상 적용의 가능성을 다양 화의 가능성을 허용했다. 여기서, 천연 다당류, 풀루 란, 덱스 트란으로 이루어지는 다공질 지지체에 MSC 자기 시딩 우리 상세히 프로토콜은 비계 이전 줄기 세포 ^{(16) (17)를} 한정하기 위해 사용된다. 연골 분화하면 마지막이었다Y는 세포 고밀도 시드 골격의 매트릭스 코어에 연속 영양소 및 기체 확산을 위해 생물 반응기에서 수행 하였다. 세포에 영양분, 연골 세포 성장 인자, 가스를 제공하는 외에, 생물 반응기는 기계적인 자극을 제공했다. 전반적으로, 생물 반응기의 동적 숙성과 함께 줄기 세포를 한정하는 데 사용되는 자기 기술은 현저 연골 분화를 향상시킬 수있다.

프로토콜

마그네틱 장치 1. 건설

주 : 세포 접종에 사용하는 장치는 애플리케이션에 따라서 변경 (도 1). 자기 팁 (지름 750 μm의) 매우 얇아 야하므로 응집체를 형성하는 셀의 수는 2.5 × ¹⁰⁵ / 집합으로 제한된다. 1.8 / ^㎠ 7mm 두께 발판 종자, 자석은 크게 (직경 3mm)이어야하고, 지지체의 세공을 세포 이동을 보장한다.

1. 골재 형성을위한 미세 자석 장치의 구성 (도 1a)
   1. 알루미늄 판을 통해 0.8 mm의 드릴로 미세 구멍 (직경 3cm, 6 mm 두께)을 만든다.
   2. 플레이트의 각 구멍에 자기 팁 (지름 750 μm의)을 삽입한다.
   3. 포화 자화를 보장하는 영구 네오디뮴 자석, 이상이 디스크를 넣습니다.
2. 비계 파종위한 장치의 건설 ( 도 1b)
   1. 2.4 cm ² 제곱에 하드 컷 폴리스티렌.
   2. 1.6 cm ^(2)의 면적에 걸쳐 동일한 간격으로 9 개 작은 자석 (직경 3mm, 길이 6mm)을 _{삽입한다.}
   3. 영구 네오디뮴 자석을 통해이 장치를 놓습니다.

2. 줄기 세포의 라벨링

주 : 30 분 (5 ± 0.4 PG 철 / 셀) 시드 0.2 mM의 자성 나노 입자로 표지 동안 줄기 세포를 30 분 (2.6 ± 0.2 PG 철 / 셀) 집합체를 형성하기 위해 0.1 mM의 자성 나노 입자로 표지 된 비계. 이들 나노 입자의 농도 및 배양 시간은 이전에 사용하고 MSC 및 다른 셀 ^{(18, 19)으로} 제작하고,이 나노 입자는 세포 생존도 MSC이나 분화 능력에 영향을 판단되어왔다. 줄기 세포에 의해 혼입 된 철 질량 단일 CE 통해 측정LL의 자기 ^{19, 20.}

1. 근처까지 37 ° C, 5 % CO _2에서 완전한 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM) 문화 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 (~ 90 %)을 합류한다.
2. 글루타민없이 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RMPI)에서 변성 무 혈청 맥코이의 5A 배지 및 5를 포함하는 : 0.1 또는 0.2 밀리미터 마그 헤 마이트, 시트르산 피복 산화철 (8 nm의 직경 코어 γFe ₂ O _3)을 혼합하여, 자기 라벨 솔루션을 준비 mM의 시트르산 나트륨.
3. 상기 배지를 폐기 글루타민없는 무 혈청 RPMI 배지로 세포를 린스하고, 150 cm ² 배양 플라스크, 전체 셀을 커버하기 위해 필요한 최소 체적 당의 철 산화물 나노 입자 용액 10 mL를 넣고.
4. 37 ° C에서 30 분, 5 % CO ₂ 동안 배양 한 다음 나노 입자 용액을 버린다. 유모를 내면화하는 글루타민없이 무 혈청 RPMI 배지 5 분간 씻어oparticles 여전히 세포막에 부착.
5. RPMI 매체를 취소하고 플라스크 당 전체 MSCGM 매체의 25 mL를 넣어. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, 5 % CO _2.

3. 자기 셀 시드

1. 갓 50 μM L- 아스코르브 산 2 인산, 0.1 μM 덱사메타손 (dexamethasone), 1 mM 피루브산 나트륨, 0.35 밀리미터 L 프롤린, 1 % 범용 배양을 첨가하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) L 글루타민 높은 포도당을 이용하여 연골 매체를 준비 인슐린, 인간 트랜스페린 및 selenous 산 (ITS-프리믹스) 10 NG / ㎖ 형질 전환 성장 인자 베타 3 (TGF-β3)을 포함하는 보충.
2. 5 분 동안 260 × g에서 0.05 % 150 ^cm-2 배양 플라스크 당 트립신 EDTA 및 원심 분리기의 해리 된 세포를 8 mL로하여, 자기 세포 분리. 배지를 흡인하고, 세포를 재현 탁 계산.
3. 양 자기 소자의 상부에 유리 바닥 세포 배양 페트리 접시 (35mm)를 놓는다.
4. m으로agnetically 집합체 당 (증착 될 수있다 (16) 집계까지) 2.5 × ^{105 개} 표지화 된 세포를 포함하는 가능한 가장 작은 양 (더 8보다 μL)을 증착 부드럽게 페트리 접시에 연골 매체 3 mL를 첨가하고, 응집물을 형성한다. 이 구 상체를 형성 할 수 있도록하여 이동하지 않고 20-30 분 동안 배양 접시 두었다가 37 ° C, 5 % CO _2의 인큐베이터에, 16 응집체를 함유하는 페트리 접시를 포함하여 전체 장치를 배치했다.
5. 양식 제어 집계는 동일한 프로토콜을 다음과 TGF-β3없이 연골 매체 전체 매체를 교체합니다.
   1. , 3 차원 집계 구조를 생성 8 이중선을 형성하고 융합을 시작 8 일째에 접촉이 집계를 놓습니다. 하루 11, 4 네 쌍둥이를 형성하기 위해 2 개의 이중 병합합니다. 마지막으로, 최종 구조물을 얻기 위해 15 일에 4 네 쌍둥이 퓨즈.
   2. 동시에 × ¹⁰⁵ 2.5 원심 분리하여 응집체를 형성 (260)에서 줄기 세포를 표지(15); 또는 TGF-β3없이 연골 배지 1.5 mL를 15-㎖의 튜브에 5 분간 g (샘플 및 제어를위한 각각).
6. 종자 발판 자기 적하려면 페트리 접시에 각각 건조 발판을 놓습니다. 풀루 란 / 덱스 트란 ^(21)로 이루어진 다당류 다공성 지지체를 사용합니다. 각 지지체를 들어, TGF-β3없이 연골 배지 350 μL, 2 × ¹⁰⁶ 표지 줄기 세포를 희석 신중 지지체 상에 세포를 피펫.
   1. 골격 내의 전체 세포 침투를 허용하기 위해 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션 한 다음 부드럽게 또는 페트리 접시 (각각 시료 또는 제어를위한) TGF-β3없이 연골 배지 3 ㎖을 추가한다.
   2. 골격 기공 한정 통해 세포 이동을 허용하도록 _{2 내지} 4 일 동안 37 ° C CO에서의 자기 장치의 발판 cellularized 부화 5 %.
7. 동시에, 함께 발판을 시드 2 × 10 ⁽⁶⁾ 까지 표지 줄기 세포는 동일한 방법을 다음과 같이 양성 대조군 균일 시드 발판을 얻었다 마그넷없이 배양한다.

연골 세포로의 분화 (4)

참고 : 배양 4 일 후, 자석을 제거하고 연골 성숙 중 하나를 페트리 접시 (정적 상태) 또는 생물 반응기 (동적 조건)에서에 계속. 대조군 샘플은 TGF-β3없이 연골 매체 정적 조건에서 숙성된다.

1. 정적 조건에서, 같은 배양 접시에서 cellularized 비계 또는 집계를 유지한다. 이십일일을 위해 일주일에 두 번 연골 매체를 변경합니다.
2. 동적 상태에서 생물 반응기를 준비한다.
   1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 적절한 길이로 실리콘 튜브를 잘라.
   2. 500 ㎖의 배양 챔버, 튜브, 2 웨이 회전기 및 케이지 모든 재료를 압력솥.
   3. 멸균 microbio로 생물 반응기의 부품 배치논리적 안전 역. 제조업체의 지침에 따라 2 방향 회전기와 문화 챔버에 튜브를 연결합니다.
   4. 조심 멸균 주걱을 이용하여 살균 케이지로 cellularized 발판 옮긴다. 케이지 당 2 발판을 놓습니다. 새장 준비가되면, 더 회전시 이동을 유지하기 위해 뚜껑의 바늘에 삽입. 연골 배지로 배양 챔버를 채우고 케이지를 함유하는 뚜껑을 닫는다.
3. 연골 매체와 튜브를 채우기 위해 기포를 제거하기 위해 연동 펌프를 켭니다.
4. 두고 바이오 리액터의 모터로 채워진 챔버를 고정하고 암과 챔버 모두 회전을 제어하는 ​​컴퓨터를 켜.
5. 암부와 챔버 모두에 5 분당 회전 수 (rpm)의 회전을 적용한다. cellularized 비계의 연속 급지 10 rpm의 유속으로 연동 펌프를 조정한다.

5. RNA 추출 및 유전자 발현 분석

참고 : RNA 추출에 앞서, 효소 솔루션으로 발판을 소화.

1. 풀루 100 μL (40 U / ㎖) 및 무 혈청 DMEM 배지에 850 mL의 dextranase 50 μL (60 ㎎ / ㎖)을 첨가하여 효소 용액 1 ㎖를 준비한다.
2. , 무 혈청 DMEM 배지로 두 번 발판을 씻어 매체를 폐기하고, 비계 당 효소 용액 800 μL를 추가합니다. 부드러운 교반하에 37 ℃에서 15-30 분 동안 인큐베이션.
3. 발판이 완전히 용해 될 때 신중 매체 대기음, 10 분 동안 300 × g에서 ㄱ 1.5mL 용량 튜브에 세포를 포함하는 용액을 원심 분리 전송 × 1 멸균 인산 완충 식염수 (PBS), 원심 분리기의 회 씻어 300 × 10 분간 g 및 RNA 분리 용액으로 세포를 재 - 보류.
4. , 집계에서 RNA를 추출 RNA 분리 용액에 회전 타원체를 배치하고완전히 RNA 추출을 수행하기 전에 호모 게 나이저를 사용하여 분쇄.
5. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 추출을위한 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.
6. ,의 dNTP 믹스 1 μL (10 mM의 각), 40 U / ㎖의 RNase 억제제 랜덤 프라이머 250-ng를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사 효소를 이용하여 총 RNA의 400 ng의 보완적인 DNA 합성; 반응의 최종 부피는 20 μL이다. 반응의 끝에서 100 μL의 최종 용적을 수득 증류수 80 μL를 추가한다.
7. 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)의 경우, 10 배 희석 된 cDNA와 같은 aggrecan (AGC) 및 콜라겐 II (골 II) 등의 관심의 유전자의 상대적인 발현을 정량화하는 형광 시약을 포함하는 PCR 혼합물을 사용한다. 기준 유전자 리보솜 단백질 대형 P0 (RPLP0)으로 유전자 발현의 수준을 정상화. ^{ΔΔCT 식 -} 2로 계산을 수행, ΔΔCT = ΔCT 차별화 조건 곳 - 제어 ΔCT 조건을 의미하고, 각 ΔCT 관심 유전자의 CT 나타냄 - 참조 유전자 (RPLP0)의 CT.
8. 평균 값은 평균 (SEM)의 표준 오차를 ± 통계적 측정치를 결정한다. n 개의 ≥ 2 독립적 인 실험과 분석을 수행합니다. 원심 펠렛 자기 융합 (* p <0.05)의 통계적 차이를 분석하기 위해 스튜던트 t 검정을 사용한다. 제어 지지체 차별화 발판 사이와 통계적 차이 (* p <0.05)을 분석하는 크루스 칼 - 월리스 시험 (일방향 ANOVA의 비모수)와 중요도를 결정한다.

6. 조직 학적 분석

1. 멸균 1 × PBS로 cellularized 지지체 또는 응집체 린스 1 시간 동안 실온에서 10 % 포르말린 용액에 이들을 고정, 1 × PBS로 헹군다.
2. 의 PBS를 제거 최적의 해부 할에 샘플을 포함g 온도 화합물 OCT () 및 액체 질소에 침지 펜탄 욕이를 동결. -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 응집체 또는 cellularized 골격 12 μm의 8 μm의 저온부를 획득하기 위하여 저온 유지 장치로 샘플을 잘라.
3. 톨루엔을 사용하여 명확히, 100 % 에탄올로 탈수시키고, 수돗물로 헹구고, 2 분 동안 0.5 % 톨루이딘 블루 용액으로 저온부를 염색하고 광학 현미경위한 장착 매체 슬라이드 마운트.

결과

우선, 골재를 개별적으로 2.5 × ^{105 개} 표지 줄기 세포를 (도 2A)을 증착에 의해 미소 자석을 사용하여 형성 될 수있다. 이 하나의 집합체 (~ 크기가 0.8 mm)는 다음 순차적으로, 자기 유도 융합에 더 큰 구조 덕분에 융합 될 수있다. 예를 들어, 연골 성숙의 8 일째에, 집계는 이중선을 형성하는 한 쌍의 접촉에 넣고; 네 쌍둥이 2 이중선을 병합하여 11 일째에 ?...

토론

여기에 제시된 기술은 자성 나노 입자의 국제화에 의존하기 때문에 그들이 세포 내 지역화하면 첫째, 하나의 중요한 문제는 나노 입자의 결과이다. 이는 철 나노 입자 잠재 독성 또는 노광 ^{(19), (22)의} 크기, 코팅, 및 시간에 따라 손상 분화 능력을 트리거 할 수 있다는 사실이다. 캡슐화 철 나노 입자의 형태 magnetoferritin 생물학적 자성 나노 입자

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'