능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

요약

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 ⁺ 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

초록

다 능성 줄기 세포는 자기를 갱신하고의 연구 및 미래 당뇨병 치료에 사용될 수있는 췌장 선조 세포의 생성을위한 매력적인 소스 만드는 다중 계통으로 분화하는 능력을 가지고있다. 이 문서에서는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)에서 췌장 전구 세포를 생성하도록 설계된 4 단계의 분화 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 라인의 수에 적용 할 수있다. 췌장 전구 세포를 생성하기 위해 취해진 방식은 정확하게 췌장 개발의 주요 단계를 모델링 hESCs는 구별한다. 이것은 티빈 A, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF에) 및 CHIR990210의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 달성되는 최종 내배엽의 유도와 함께 시작된다. 섬유 아세포 성장 인자 10 (FGF10) 및 Dorsomorphin와 또한 차별화 및 패터닝 후방 foregut를 닮은 세포를 생성합니다. 레틴의 추가OIC 산, 소량는 SANT-1과 FGF10은 췌장 내배엽의 특성 세포로 후방 foregut 세포를 구별합니다. 마지막으로, 표피 성장 인자 (EGF)의 조합은, 니코틴 및 소량은 PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ 세포의 효율적인 생성을 이끈다. 유동 세포 계측법 췌장 개발의 주요 단계에서 특이 마커의 발현을 확인하기 위해 수행된다. 스테이지 (4)의 끝에 PDX1 ⁺ / ⁺ 췌장 선조 NKX6-1은 면역 결핍 마우스에 이식시 성숙한 β 세포를 발생시킬 수 있으며 상기 체외 인슐린 생성 세포를 생성하기 위해 구별된다. 따라서, PDX1의 효율적인 생성 ⁺ / NKX6-1 ⁺ 췌장 전구 세포,이 프로토콜에서 입증 된 바와 같이,이 시험 관내에서 인간의 췌장 개발을 연구하기위한 플랫폼을 제공하기 때문에 매우 중요하고 분화 잠재력 세포의 공급원을 제공한다 EV 수 β 세포entually 당뇨병 치료에 이용 될 수있다.

서문

당뇨병의 유병률은 증가하고 캐나다 당뇨병 협회에 따르면, 제 1 형 당뇨병 (T1D) ^1을 가진이 개인의 5 ~ 10 %로, 캐나다에서 만 11 이상의 개인이 당뇨병 또는 당뇨병 진단 전의 것으로 추정된다. T1D는 랑게르한스섬 내에 위치 인슐린 생성 β 세포의 파괴에 의해 야기 된자가 면역 질환이다. 현재 T1D 함께 사는 사람들은 ^{인슐린이의} 외인성 소스를 필요로한다. 인슐린 치료에서의 진보에도 불구하고, T1D 환자는 혈당 수치를 조절하는데 어려움이 있고 하이포 고혈당 모두 고생 계속합니다. 치료의 유망한 ^형태는 T1D에서 정상 혈당이 생체 내 및 시험 관내 ³ 모두 β 세포의 인슐린 생산의 무제한 공급을 생성하는데 사용될 수있는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)의 사용이다 복원 ^{4, 5, 6, 7까지.} hESCs는 차별화하는 β-같이하는 세포는 가능한 제 2 형 당뇨병에 대한 새로운 치료 표적의 식별을 허용, 시험 관내에서 당뇨병을 연구하고 T1D 환자에 이식 세포를 제공하기 위해 만들 수 있습니다.

체외에서 hESCs는에서 인슐린 생산 세포를 생성에서 가장 성공적인 시도는 췌장 개발 ^{4, 5시에} 발생하는 배아 이벤트를 요점을 되풀이하는 것입니다. 이것은 정확하게 현상 췌장의 주요 단계를 모델링 별개의 신호 경로의 조작을 포함한다. 췌장 개발은 CXCR4 및 CD117 (C-KIT) ^{8, 9의} 발현을 특징으로 최종 내배엽의 유도로 시작합니다. definit의 정확한 조절필자 내배엽 조직은 다음 전방 - - 후방 및 복부 - 등의 패턴 거쳐 창자 관의 형성이 필요합니다. 지느러미와 복부 췌장 싹이 췌장 개발 ^(10)에 필요한 췌장과 십이지장 호 메오 박스 유전자 (Pdx1)를 표현하는 후방 foregut의 영역에서 등장. 지느러미와 복부 싹 퓨즈는 광범위한 상피 리모델링 및 확장 ^(11)를 거쳐 췌장을 형성한다. 내분비 및 외분비 혈통에 의지가 표현하는 다 능성 전구 세포 (MPC와)의 생성을 동반, 다른 사람의 사이에서, 전사는 Pdx1, Nkx6.1 및 Ptf1a ^{12, 13 요인.} 내분비 및 유관 세포가 될 것이다 MPC와는 Ptf1a 식을 줄이면서 Nkx6-1을 표현하는 것을 계속한다. 이에 대하여, 외분비 혈통 세포는 expressio 잃게됩니다Nkx6-1의 n 및 Ptf1a 식 ^{(12)을 유지한다.}

전사 인자 Nkx6-1 특히 세포와 β 내분비 전구 세포의 분화 과정, 췌장 발달에 중요한 역할을한다. 이전 췌장 개발 ¹⁴ 중 β 세포 장애가 형성 Nkx6-1 결과, 결실 한 바와 같이. 따라서, 생체 외 및 생체 내 인슐린 생성 β 세포를 발생시키는 Nkx6-1의 효율적인 도입을 필요로한다.

우리는 최근에 효율적으로 hPSCs에서 PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ 췌장 전구 세포를 생성 할 수있는 프로토콜을 개발했다. 이 hPSC 파생 췌장 전구 세포는 면역 결핍 마우스 ^3에 이식에 따라 성숙 β 세포를 생성합니다. 1) 최종 내배엽 유도 : 분화 프로토콜 4로 분할 될 수 특징 스테이지2) 후방 foregut 패터닝, 3) 췌장 사양 및 4) NKX6-1 유도. 여기서 우리는 분화 방향의 각 단계에 대한 상세한 설명을 제공한다.

프로토콜

솔루션 및 미디어 1. 준비

주 : 무균 환경에서 세포 배양에 대한 모든 미디어를 준비합니다. 미디어 만든 즉시 사용할 수 있습니다. 시약 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 차별화 미디어
   1. 1 % 글루타민, 2 μM CHIR 99021, (100) NG / ㎖ 티빈 A, ¹⁰⁴ M MTG와 RPMI 매체 : 일 0 차별화 미디어를 준비합니다.
   2. 1 % 글루타민, 100 NG / ㎖ 티빈 A, ¹⁰⁴ M MTG, 5 NG / ㎖의 bFGF, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산으로 RPMI 매체 : 하루 1-2 차별화 미디어를 준비합니다.
   3. 1 % 글루타민, 1 % B27, ¹⁰⁴ M MTG, 0.75 μM Dorsomorphin, 50 NG / ㎖ FGF10로 RPMI 매체 : 하루 3-5 차별화 미디어를 준비합니다.
   4. 하루 6 ~ 7 차별화 미디어를 준비 : DMEM을 1 % 글루타민, 1 % B27, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산, 50 NG / ㎖ FGF10, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM 레티노 산, 50 NG / ㎖ 소량으로.
      참고 : 레티노산성 마지막 배지에 첨가되어야하며, 용지가 산화 분해 ^(15)을 방지하기 위해 빛으로부터 보호되어야한다.
   5. 일 8-12 차별화 미디어를 준비 : DMEM을 1 % 글루타민, 1 % B27, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산, 50 NG / ㎖ 소량, 100 NG / ㎖ hEGF, 10 mM의 니코틴 아미드와 함께.
2. PBS에서 10 % FBS, 마이너스 칼슘과 마그네슘 : FACS 버퍼를 준비합니다.

2. HESC 차별화

참고 : HESC는 해동 계대과의 bFGF ⁽¹⁶⁾ 보충 KOSR 기반 미디어의 존재에 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 확장됩니다. 세포가 80-95%의 포화 상태에 도달했을 때 hESCs는 차별화를위한 준비가되어 있습니다. 이 때 식민지 정의 테두리와 'domelike'구조 (그림 1A)와 커야합니다. 모든 세포 배양 평면 바닥 0.1 % 젤라틴으로 코팅 된 조직 배양 처리 된 플레이트에서 수행된다. 일반적으로, 세포 (6)에서 재배되거나각각 2 ml의 또는 1 ㎖의의 매체 볼륨의 12 웰 플레이트.

1. 0 일에서 일 0 차별화 미디어로 KOSR 기반 미디어를 대체하여 차별화를 시작합니다.
2. 일 1과 2에서 부드럽게 흡입하기 전에 단일 층에서 죽은 세포를 제거하기 위해 판을 흔들어. 주 1 ~ 2 차별화 미디어로 교체하십시오.
3. 3 일에, 유동 세포 계측법을위한 수확 세포. 세포가 90 % 이상 CXCR4 ⁺ / CD117 ^{+ 표현하면} 2.4 단계로 진행합니다.
4. 일 3, 5, 부드럽게 이전에 흡입에 단일 층에서 죽은 세포를 제거하기 위해 판을 흔들어. 하루 3-5 차별화 미디어로 교체하십시오.
5. 일 6, 7 일, 하루 6 ~ 7 차별화 미디어로 교체합니다.
6. 일 8, 10 및 12에서 하루 8-12 차별화 미디어로 교체합니다.
7. 날 13 일, 흐름에 대한 수확 세포는 세포 계측법 PDX1과 NKX6-1 식을 결정합니다.

유동 세포 계측법 분석 3. 수확 세포

1. 와 세포를 떼어 놓다제조 업체의 프로토콜과 3 분 동안 37 ° C에서 부화에 따라 1 배 상업 트립신 솔루션입니다.
2. 30 μL의 DNase의의 I. 1,000 μL FACS 버퍼에 단일 세포를 상용 트립신 용액을 제거하고 재현 탁
3. 미세 원심 분리 관에 35 ㎛의 나일론 메쉬 셀 스트레이너 및 전달을 이용하여 필터 셀.
4. 5 분 455 XG에 원심 분리기 세포. 어느 라이브 또는 고정 염색 세포를 준비합니다.

유동 세포 계측법 4. 염색

1. 3 일에 라이브 염색에 대비 흐름
   1. 1000 μL FACS 버퍼에 재현 탁 세포. 전송 200 μL (모두 흠 염색 샘플) 96- 웰 플레이트의 웰에 두 개 (약 1-3 × ¹⁰⁵ 세포).
   2. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
   3. APC 및 CD117 : 차 복합 항체, CXCR4으로 얼룩 PE는 3 (M의 aterials 표 참조)실온에서 0 분 빛으로부터 보호.
   4. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
   5. 100 μL FACS 버퍼에 재현 탁 샘플.
   6. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
   7. 1 ml의 마이크로 테스트 튜브 또는 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브 300-500 μL FACS 완충액에서 총 부피 각각의 샘플 및 전송을 재현 탁.
   8. ⁽¹⁷⁾ 흐름 cytometer에서 실행 샘플. 샘플을 즉시 실행할 수없는 경우, 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호.
2. 하루 (13)에 고정 염색에 대비 흐름
   1. 4 ℃에서 24 시간 동안 상업 고정 / permeabilization 솔루션에서 세포 펠렛을 Resuspend.
   2. 5 분 동안 455 XG에서 샘플을 원심 분리기. 400 μL 파마 / 세척 용액을 Resuspend.
   3. (TW)에 샘플 (약 0.5 × 10 ⁶ 세포)의 200 μl를 전송(IgG의 제어 및 PDX1 / NKX6-1 염색 용) 96 웰 플레이트의 O를하는 것은 우물. 2 분 동안 931 XG에 원심 분리기.
   4. 안티 PDX1 및 안티 NKX6-1 차 또는 이소 제어 항체를 포함하는 100 ㎕의 파마 / 세척 용액의 세포 펠렛을 재현 탁 (재료 표 참조). 4 ℃에서 밤새 품어.
   5. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. 100 μL 파마 / 세척 용액을 Resuspend 샘플.
   6. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
   7. 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 이차 항체를 포함하는 100 μL 파마 / 워시 샘플을 재현 탁.
   8. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
   9. 100 μL 파마 / 세척 용액에 재현 탁 샘플.
   10. 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
   11. 대표단계 4.2.9 및 4.2.10을 먹는다.
   12. 1 ml의 마이크로 테스트 튜브 또는 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브 300-500 μL FACS 완충액에서 총 부피 각각의 샘플 및 전송을 재현 탁.
   13. ⁽¹⁷⁾ 흐름 cytometer에서 실행 샘플. 샘플을 즉시 실행할 수없는 경우, 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호.

결과

도 1a에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 췌장 전구 세포의 효율적 생성, 분화 프로토콜 중 특정 신호 분자의 정확한 첨가하여 미분화 된 세포의 적절한 성장 및 유지에 의존한다. 0 일에서 미분화 세포 80-95% 합류를해야하며, 식민지 정의 가장자리 (그림 1A)를 가져야한다. 세포 사멸이 단계에서 매우 일반적이기 때문에 1 단계 동안, 미디어 가능성이 ...

토론

성공적으로 시험 관내에서 hPSCs에서 NKX6-1 ⁺ 췌장 전구 세포를 생성하는 췌장 개발 과정에서 중요한 발달 단계를 관리하는 특정 신호 전달 경로의 정확한 규정을 포함 hPSCs의 높은 품질의 문화와 감독 분화의 사용에 의존한다. 이전에 다음과 같은 고려가 이루어져야 NKX6-1 효율적인 생성을 위해, ^3이 나타내는 바와 같이 프로토콜 hPSC 라인의 다양한 걸쳐 NKX6-1의 강력?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419