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요약

이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다.

초록

이식에서 공여 항원에 대한 면역 반응의 측정은 성공적으로 감소 또는 면역 억제의 철수에 중요한 될 가능성이 높습니다. 혼합 백혈구 반응 (MLR), 제한 희석 분석 및 트랜스 생체 지연 형 과민 (DTH) 분석이 모든 문제에 적용되어 왔지만,이 방법은 예측 기능 및 / 또는 유용성을 줄이는 중요한 실용적인 한계를 제한. 이미징 유동 세포 계측법 계측법, 형광 현미경의 이미징 기능과 흐름의 양적 multiparametric 전력을 결합하는 기술이다. 최근 도너 항원 제시 세포 (APC를) 성숙한 면역 시냅스를 형성 할 수있는 수신자 T 세포의 비율을 정의하는 촬상 유세포 방식을 사용했다. 잘 특성화 된 마우스 심장 이식 모델을 사용하여, 우리는 결과에 의하면 T-APC의 membr 중 체외 면역 시냅스의 주파수메탄 연락처 이벤트가 강하게 동종 이식 거부, 허용 오차의 결과 및 이식 생존을 유도 규제 T 세포에 의존하는 상황을 예측했다. T-APC 연락처의 주파수는 급성 거부 반응 동안 마우스로부터 T 세포를 증가 alloantigen하는 응답 렌더링 마우스로부터 T 세포를 감소. 시험 관내 시스템 조절 T 세포의 첨가는 장기간 T-APC 접점을 감소시켰다. 결정적으로, 이러한 효과는 또한 자연적으로 인간형 마우스 모델에서 인체 조직의 거부 반응을 제어하기 위해 공지 된 조절 T 세포를 발생 확장 인간 polyclonally으로 보였다. 이 방법의 추가 개발은 이식의 alloreactive T 세포 구획의 깊은 특성을 허용 할 수있다. 향후 발전과 인간의 세포를 사용하여이 방법의 평가는 면역 최소화를위한 환자를 선택하기 위해 사용되는 분석의 기초를 형성 할 수 있고, tolerogen의 영향을 측정하는데 사용될 수있다IC는 병원에서 치료.

서문

고형 장기 이식은 신장, 간, 심장, 폐의 말기 질환 환자의 치료를 변형시켰다. 면역 억제제를 사용하지 않을 경우 크고 작은 조직 적합성 항원의 불균형으로 인해, 그러나, 동종 이식은 즉시받는 사람 T 세포에 의해 거부됩니다. 이러한 에이전트는 암과 장기 기능 장애에 대한 위험 등 다양한 부작용을 가지고있다. 주요 임상 목표는 동종 이식 거부 반응을 방지하기 위해 필요한 최소 수준으로 면역 억제제의 용량을 절감하는 것이다. 이 수준은 선천성 면역 시스템의 활성화 정도에 따라 달라질 가능성이 높습니다; 기증자받는 사람 alloantigen 불일치의 정도; 면역 기능, 약동학 및 약력학 및 환자 간 차이.

불행하게도, 이식 임상 정확하게 개별 환자의 1에 기증자의 반응성을 평가하기위한 어떤 도구를 필요가 없습니다. 혼합백혈구 반응 (MLR)의 도너 반응성을 검출 할 수 있지만, 확실 그래프트 결과 (2, 3)를 예측하지 못한다. 제한적인 희석 세이, 사이토 카인 ELISPOTs 및 트랜스 - 생체 분석 중 하나는 반응의 제한된 범위를 측정 또는 연산 오차 9, 10, 11에 관련된 4, 5, 6, 7, 8 개 .Gene 발현 프로파일 밝혀냈다 서명은 실용적이지 않다 (12)과 거부 13, 14, 15, 그러나 이들은 항상 인구 16에서 일반화 할 수없는 궁극적으로 개별 환자의 유용성을 제한 할 수 있습니다. 순서 기반 analyMLR 18 말초 혈액 17에서 증식 T 세포의 T 세포 수용체 (TCR)의 SES도 개발하지만 추가 검증을 요구하고있다.

개념적으로 도너 항원에 의해받는 T 세포 활성화에 필요한 초기 단계를 검출하는 분석을 갖는 것이 바람직하다. 유물을 소개 할 수 있습니다합니다 (MLR 같이) 일 동안 세포를 배양하기 때문에, 이러한 테스트는 이상적으로 이러한 확산 또는 이펙터 기능과 다운 스트림 이벤트의 측정을 필요로하지 않을 것입니다. 테스트는 순전히 기술적 인 평가하기 때문에, T - 세포 기능의 일부 요소에 의존하는 동등하게, 그러나, 그것은 또한 바람직 할 것이다 (예를 들면, TCR 시퀀싱) 아네 르기 기능적 T 세포를 구별 할 수 없을 수도있다.

수많은 연구들은 장기간 T-APC 연락 필수 최초 면역 시냅스의 형성에 필요한 것을 나타낼T 세포 반응 19, 20, 21, 22 단계를 포함한다. 마우스의 10 % CD4 + T 세포가 동종 골수 유래 수지상 세포 (BMDCs) (23) 오래 지속되는 접점을 형성 - 우리는 최근 체외 시간 경과 영상, 약 5 동적 동안, 보도했다. 장시간의 접촉 빈도가 마우스에서 이전에 동일한 항원에 대한 내성을 표현하는 반면, 그래프트 거부 동물이 증대하고, 그것을 쥐 untransplanted 23에서 볼 수준에서 유지되었다. 지속적인 상호 작용을받는 Tregs의 존재 하에서 환원들이 없을 증가, 우리는 인간 T 세포와 동종 단핵구 유래 수지상 세포 (MoDCs) (23)를 사용하여 유사한 현상이 관찰되었다.

그러나, 장기간의 콘택트의 열거는 폴리 클로 날 T 세포 populatio 이내에여기서 n은 시간과 노동 집약적이다. 따라서 우리는 이미지의 사용은 동종 면역 시냅스 형성을 검토하는 유동 세포 계측법했다. 이미징 유동 세포 계측법 계측법, 형광 현미경의 단일 셀 이미징 능력을 가진 종래의 흐름 multiparametric 데이터 획득 및 분석 기능을 포함한다. 이 기술은 단일 클론 T 세포 24, 26, 27 또는 초 항원 (28)의 존재 면역 시냅스 형성을 연구하기 위해 다른 연구자에 의해 사용되어왔다. alloreactive T 세포는 일반적으로 전체 T 세포 레퍼토리 29, 30, 31, 32 5-15 %를 차지하도록 예상되는 반면, 이러한 설정에서, 그러나, 응답 T 세포의 빈도는 30-100 %의 범위이다. 중요한 것은, 우리는 이미징 흐름 세포 계측법 AV를 생성 할 수 있음을 보여 주었다ERY alloreactive T 셀 (23)의 주파수 및 폴리 클로 날 T 세포 집단 내에서 시냅스 주파수의 변화 그래프트 결과 (23)의 예측되는 것을 비교 측정. 현재,이 방법은 원칙적으로 CD4 + T 세포의 직접 alloreactivity을 측정하기 위해 최적화되었지만, 또한 CD8 + T 세포와 간접 경로를 조사하기 위해 개발 될 수있다. 간접 alloreactivity는 이식 후 33 긴 시간에 점점 더 관련 될 것으로 추정된다. 우리는 현재 환자에서 테스트 할 수 있도록 인간의 세포를 사용하려면이 방법을 개발하고있다. 따라서, 미래에 전반적인 접근 방식은 이식 전에 이식에 T 세포 반응의 기능 평가에 유용 할 수있다; 즉시 이식 후; 그리고 장기적으로, 경우에 약물 최소화 중요한 목표된다.

프로토콜

1. 시약 및 재료 필요한 준비

  1. 2 % 소 태아 혈청 (FBS) ( "세정 완충액")을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 0.1 % 비이 온성 세제를 함유하는 2 % FCS와 PBS를 준비 ( "파마 세척 완충액"; 재료의 도표 참조). 1.5 %의 포름 알데히드 PBS를 준비합니다.
    참고 :주의! 포름 알데히드는 부식 및 잠재적 발암 및 적절한 개인 보호 장비를 착용하고있는 동안 처리해야합니다.
  2. PBS는 2 % FBS와 자기 세포 분리 ( "MCS 버퍼"), 0.5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유 준비한다.
  3. 준비 50 μg의 디메틸 술폭 시드 / ㎖ 팔로이 딘 - 형광 염료 (FITC-Phalloidin의) (DMSO). 1 ㎎ / ㎖의 핵 염색을 준비 (예를 들어 1 밀리그램 / DMSO 또는 비스 - benzimide 염료 용액에 7-aminoactinomycin의 D (7-AAD) 재료의 도표 참조) DMSO있다. 관심의 세포에 적합한 형광 색소 표지 항체를 준비하고촬상은 유동 세포 계측기.
  4. 항원 제시 세포 또는 전구 세포의 원천으로 T 세포와 동종 동물 조직 (예를 들면, 비장 및 골수)의 소스로 동물 조직 (예, 림프절 및 비장)을 얻었다.
  5. 세포 배양 배지 (예, 로스웰 파크 메모리얼 연구소 배지 (RPMI) 1640 또는 10 % FBS가 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)), 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 페니실린 및 스트렙토 마이신을 준비하고 수득 24 및 / 또는 96 세포 배양 플레이트 웰.

2. 항원 제시 세포를 준비

참고 : 이론적으로, 어떤 APC의 인구가이 방법으로 조사 할 수있다. 장갑차가이 경우에 소송을 제기했다으로 미성숙 마우스 골수 유래 수지상 세포. 다수의 프로토콜 (예를 들어, 34 및 35 참고) 이들 세포를 생성하기 위해 존재한다. 간단히, 다음과 같은 프로토콜이 사용되었다.

  1. RPM에 대퇴골과 경골에서 플러시 골수I 1640 또는 DMEM.
  2. 뼈와 이물질의 작은 조각을 제거하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁 합격.
  3. 원심 분리하여 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 염화 암모늄 완충액을 사용하여 적혈구를 용해시키기.
  4. 원심 분리 (400 XG, 5 분)에 의해 세포를 펠릿 세포 펠렛을 재현 탁.
  5. 원심 분리 (400 XG, 5 분)로 세척 완충액, 펠릿을 10 ㎖, 상기 세포 펠렛을 다시 일시 - 5 세포를 세척한다.
  6. 비 오티 닐화 된 항 -CD3 (5 ㎍ / ㎖), 항 B220 (5 ㎍ / ㎖), 항 MHC 클래스 II (1 ㎍ / ㎖) 및 항 -CD11b와 세포를 라벨링하여 세포 분리 컬럼 위에 조혈 전구체를 풍성 (5 ㎍ / ㎖) 항체.
  7. 원심 분리 (400 XG, 5 분간)에 의해 세포를 펠릿 세포 펠렛을 다시 일시.
  8. 10 분 동안 4 ℃에서 항 - 비오틴 자성 마이크로 비드 (재료의 도표 참조) 세포를 인큐베이션.
  9. 세척하고 세포 펠렛 (400 XG, 5 분)과 재 - suspenD들을 1 개 ㎖의 MCS의 버퍼에 큰 양성 선별을 이용하여 MCS 완충액 3 mL로 프라이밍과 자석의 위치 (LS), 자기 세포 분리 컬럼을 표지화 된 세포를 제거하기 전에. MCS 완충액 3 mL로 컬럼을 3 회 세척; 플로우 스루 원하는 세포를 포함 할 것이다.
  10. 문화 RPMI 1640 또는 DMEM 6 일 열을 통과 셀 2 NG / ㎖의 재조합 마우스 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 2- NG 보충 / 재조합 인간 형질 전환 성장 인자 β1의 ㎖ (TGFβ1) . 2 NG / mL의 GM-CSF와 TGFβ1를 포함하는 신선한 완전 배지로 2 일마다 절반 매체를 교체합니다.
    참고 : 인간 TGFβ1 마우스 세포의 활동이있다. 데이터는 이러한 미성숙 수지상 세포를 사용하여 생성되었다. 다른 세포 (예 : B 세포 및 성숙 수지상) 장갑차로서 적합 할 수 있지만,이 분석에서 시험되지 않았다.
  11. 혈청 90 % / 10 % DMSO 및 액체 질소에 보관에 수지상 Cryopreserve; 에 복구사용의 일. 사용하기 전에, 트리 판 블루 배제를 사용하여 혈구에서 가능한 수지상 세포의 수를 계산합니다. 적절한 밀도로 배양 배지에서 세포 펠렛을 재 - 정지 부 (4)에 사용하기 전에 (단계 4.1 참조).

3. T 세포를 준비

  1. 세포를 활성화 또는 억제 신호를 전달 실수 피하기 위해 음성 선별 방법을 사용한다.
    참고 :이 예에서, CD4 + T 세포 분석을위한 준비가되어 있습니다.
    1. 마우스 비장으로부터 CD4 + T 세포를 제조하기 위하여, 주사기의 플런저를 사용하여 70 ㎛의 세포 여과기를 통해 비장 매쉬. 세척 완충액으로 세포 여과기를 세척한다.
    2. 원심 분리하여 현탁 된 세포 (400 XG, 5 분) 한 후 펠렛을 실온에서 5 분 동안 염화 암모늄 버퍼에 펠렛을 재 - 현탁하여 적혈구를 용해시키기.
    3. 원심 분리 (400 XG, 5 분간)에 의해 세포를 펠릿 펠릿을 다시 일시.
    4. 셀을 세척(5) (S) - 원심 분리하여 세척 완충액 및 펠렛 10 ㎖ (400 XG, 5 분). 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    5. CD8, 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II (MHC II, 1 ㎍ / ㎖) 및 CD19 (5 ㎍ / ㎖)에 비오틴 화 항체로 세포를 염색. 4 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션.
    6. 원심 분리하여 세척 완충액 및 펠렛 10 ㎖ (400 XG, 5 분)으로 세포를 세척 하였다. 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    7. 제조자의 지시에 따라 안티 비오틴 자성 마이크로 비드 (재료의 도표 참조) 세포를 인큐베이션.
    8. 원심 분리 (400 XG, 5 분)로 세척 완충액 펠렛 10ml에 세포를 씻어; 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    9. MCS 완충액 1 ㎖에서 셀을 다시 중지 및 자석에 3 ㎖의 완충액으로 MCS 프라이밍 자기 세포 분리 컬럼 위에 CD4 + T 세포를 풍부. MCS 완충액 3 mL로 컬럼을 3 회 세척 하였다. 열 흐름을 통해이 풍부한 T 세포를 포함합니다.
  2. 표준 흐름 cytome으로음으로 선택한 셀 나누어지는을 사용하여 T 세포의 순도를 평가, 시도. 관심의 T 세포 집단 (이 경우 CD4)를 식별하고, 항체 또는 항체 (칼럼에서 제거 된 있어야만 비오틴 표지 된 세포를 식별하기 위해)을 형광 색소 - 스트렙 타비 딘 컨쥬 게이트를 사용하여 세포를 염색; ≥85 %의 순도가 허용 가능한 23이다.
    1. 트리 판 블루 배제 (≥90 % 생존이 가능)에 의해 혈구의 T 세포를 카운트.
      주 : MCS 버퍼 전에 분석을 제거해야 EDTA를 포함한다. 이를 위해, 원심 분리 (400 XG, 5 분)에 의해 세포를 펠릿 세척 완충액 1 ㎖로 세척 하였다. 다시 펠렛은 세포 (400 XG, 5 분)하고, 적절한 밀도로 배지에 다시 대기한다 (단계 4.1 참조).

4. T 세포와 수지상 세포를 공동 배양

  1. 종자에서 T 세포와 수지상 2 : 1 T : 24 웰 또는 96 웰 세포 배양 플레이트의 DC 비. 그 확인 최종 배양 부피는 ≤500 24- 웰 플레이트 또는 μL를 96 웰 플레이트 ≤50 μL이다.
    참고 : 작은 볼륨은 세포 - 세포 상호 작용을 장려하고 이후 고정 버퍼를위한 공간을 허용합니다.
    1. 경험적 정확한 세포 수를 조절하지만, 일반적인 지침으로서, 1 × 106 개 T 세포와 웰 (96- 웰 플레이트) 당 0.5 × 106의 DC를 사용한다. 적은 수의 세포를 사용하는 것이 어려운 면역 시냅스의 열거를 만들기 때문에 이것들은 세포의 최소 숫자를 고려하여야한다.
      1. 5 단계 (고정) 후 복제 우물과 풀을 설정, 세포 수를 증가합니다.
        참고 : 복제 우물을 설정할 때,이 우물의 모두 먼저 우물의 모든 다음 종자 T 세포에서 수지상 종자하는 것이 좋습니다; 이는 웰 배양 시간 간의 불일치를 최소화한다.
  2. 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 4 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
e_title "> 5. 접시에 세포를 수정

  1. 각 웰을 PBS에서 1.5 % 포름 알데히드의 3 배 배양 부피를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다; TT는 이전의 세포 - 세포 상호 작용의 중단을 최소화하기 위해 판에서 제거에 세포를 해결하는 것이 중요하다.
  2. 후속 세척 및 염색 튜브에 접시에 세포를 옮긴다. 이 단계에서, 단일 얼룩 컨트롤 추가 세포를 따로 설정합니다. 이들 외에도 대조군 전체 배양 항체 칵테일로 염색한다 (단계 4.1.1 참조).

6. 얼룩 세포

  1. 실온에서 30 분 동안 원하는 형광 색소 공역 항체 칵테일을 함유하는 세척 완충액 100 μL의 얼룩 세포, 빛으로부터 보호.
    주 : 칵테일 T 세포의 특정와 APC 특정 항체를 포함하고 있습니다. 형광 색소들은 이미징 구성의 유동 세포 계측기와 구별 될 수 있도록 선택되어야한다. t에서여기에 도시 된 그 실험 청색 형광 공역는 CD11b와 APC 공역 CD90.2 (5 ㎍ / ㎖)을 사용 하였다 (5 ㎍ / ㎖의, 재료의 도표 참조).
  2. g (X) (400)에서 5 분 동안 세척 완충액 1 ㎖ 원심 분리기에서 세포를 세척한다. 뜨는을 가만히 따르다. 0.05 ~ 0.5 ㎍ / ㎖의 FITC 팔로이 딘에 함유 투과성 세척 완충액에 세포를 다시 중단하고 빛으로부터 보호하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
    주 : 약 0.1 ㎍ / ㎖의 FITC의 Phalloidin의 농도는 마우스 세포 잘 작동하지만, 적절한 농도는, 공급 업체, 세포 유형에 따라 다양하고, 유동 세포 계측기에 촬상 할 것으로 예상된다.
  3. 400 × g으로 5 분 동안 파마 / 세척 완충제 및 1 mL의 원심 분리기에서 세포를 세척한다. 뜨는을 가만히 따르다. 적절한 농도로 핵 염색 (예컨대, 약 25 ㎍ / mL의 7-AAD)를 함유 파마 / 세척 완충액에 세포를 다시 중단하고 빛으로부터 보호하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
  4. 셀을 세척400 × g으로 5 분 동안 파마 / 세척 완충제 및 원심 분리기를 1ml S. 뜨는을 가만히 따르다. 세척 완충액, 펠릿 번 세포를 씻어 50에서 다시 일시 - 작은 덮인 마이크로 원심 튜브에 세포를 전달하는, 세척 완충액 100 μL.
  5. 즉시 데이터 수집을 진행 또는 유동 세포 계측기 이전 영상에 취득 수일까지 빛으로부터 보호 4 ℃에서 세포를 저장한다.
    참고 : 세포가 성공적으로 최대 7 일 동안이 방법으로 저장되어있다. 긴 저장이 가능한 경우가 있습니다 만, 테스트되지 않았습니다.

7. 획득 데이터

  1. 초기화 및 제조업체의 지침에 따라 세포 계수기 이미징 흐름을 구성합니다. 종래의 데이터를 수집하여 유동 코어의 안정성을 보장한다.
  2. 시야 이미지 획득을위한 하나 개의 채널을 보유하고 있습니다. 시야 채널을 끄고 단일 얼룩 제어 데이터를 취득.
    1. "로드"버튼 INSE을 클릭완전 스테인드 샘플 홀더에 (모든 필요한 형광 색소로 염색 된 시료)를 포함하는 튜브를 실온으로.
    2. 은 "작업"창에서 선택 종횡비가 가까운 곳 1. (수평축의 채널의 강도) 각각 사용 채널에 대한 새로운 산점도를 만들 수있는 영역과 게이트 단봉 이상의 종횡비 새로운 산점도를 만들 .
    3. 각 형광 색소를 들어, 긍정적 인 인구를 확인하고, 필요한 경우 "조명"상자에 레이저 전압을 조정합니다.
    4. 튜브를 언로드하고 첫 싱글 묻은 튜브를로드합니다.
    5. 은 "취득 설정"상자에서 샘플 이름을 입력하고 수집해야 이벤트의 수를 설정; 은 (보상 컨트롤) 하나의 얼룩의 경우, 1,000 - 2,000 이벤트는 충분하다.
    6. 은 "채널"상자에서 각 샘플로 염색 된 채널을 선택합니다. 단일 얼룩 컨트롤의 경우, 모든 채널은 brightf으로 선택해야합니다의 ield 및 측면 산란 끕니다. 은 "취득"상자에서 "기록"버튼을 클릭; 이벤트의 수가 지정된 임계 값에 도달하면, 인수는 자동으로 중지됩니다.
    7. 튜브를 언로드 "반환"버튼을 클릭합니다. 각각의 단일 얼룩 제어 7.2.6 - 반복 7.2.4 단계를 반복합니다. 사이토 소프트웨어에 따라, 취득시도 1에 도시 된 게이트를 모두 설정하는 것이 가능하지 않을 수있다 (더 정확하게 게이팅 분석 중에 수행하는 단계; (8) 참조).
  3. (단계 7.2), 단일 염색 샘플로 샘플을 획득하지만, "채널"상자에 브라이트 채널을 포함한 필요한 모든 채널을 선택한다.
    1. 데이터를 기록하기 전에, 상기 채널 강도가 원하는 세포 집단을 식별하기에 적합한 지 확인하는 확인. 그렇지 않으면 단계 7.2에 기재된 바와 같이, 새로운 설정을 사용하여 레이저를 설정하고 다시 기록 단일 얼룩 제어를 조정한다.
    2. 각각샘플은, 수십 이벤트의 수천을 획득.
      참고 : 대부분의 조건에서 세포 - 세포 접촉 이벤트는 총 세포 수 (대부분의 단일 세포이다)의 소수입니다. 일반적으로, 최종 막 접촉 게이트 적어도 100 개 이벤트를 갖는 것이 바람직하다.

제 1 항에있어서, 상기 데이터 분석

  1. 제조업체의 웹 사이트에서 무료로 분석 소프트웨어는 가능한 사용하여 사이토 이미징 흐름에 획득 한 데이터를 분석 (사용자 계정을 만들어야합니다; 재료의 표 참조).

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그림 1. 게이팅 전략 Alloreactive 면역 시냅스를 식별하는 데 사용됩니다. 이벤트가 루트를 기반으로 세포 이미지를 검토하여 모든 이벤트에서 문이 있습니다에 초점 A.이 시야 찬 사용하여 이미지 강도 프로파일 (그라데이션 RMS)의 변화의 속도의 제곱을 의미Nel 보낸 사람 (채널 4, CH04), 텍스트에 설명 된대로. B. 인 - 포커스 이벤트 중 이중선은 브라이트 채널 영역 대 종횡비를 플롯하여 단일 세포로부터 구별된다. 이중선 0.5에 근접 및 큰 면적을 갖도록하면서 단셀은, 근접 1의 종횡비 클러스터 및 작은 영역을 갖는다. C. 은 APC의 형광 강도 (이 경우, 수지상 세포 [DC] 마커, CD11c 양성)는 그 T 세포 마커 형광 강도 (이 경우, CD90.2)에 대해 도시되고, 두 개의 긍정적 인 이벤트 게이팅된다. 게이트의 테두리는 국경 근처 이벤트의 이미지를 검토하여 정제 할 수있다. 그들은 APC 마커 (CD11c 양성, CH02)의 면적 대 종횡비를 플롯하여 하나의 APC를 포함하도록 D. T-APC의 이중선 후 정제한다. 그들 영역 대 종횡비를 플롯하여 하나의 T 세포가 포함되도록 E. 이러한 단일 APC의 이중선이어서 정제되고T 세포 마커 (CD90.2, CH06). F. 마지막 두 핵을 포함하는 사건은 2 7-AAD 양성 스팟 (즉, 핵)가 포함 이벤트를 핵 염색 채널 (7-AAD, CH05)에 자리 수의 히스토그램을 플로팅 게이팅하여 선택된다. 도 2에 기재 한 바와 같이 게이트 이벤트는 멤브레인과 접촉 시냅스 형성을 위해 분석된다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

주 : 게이팅 전략은이 섹션에서 설명되고도 1에 도시되어있다. 데이터 유동 세포 계측법 화상 분석 처리에 대해 할당 맹검 방식으로 수행되어야한다. 우리는 면역 시냅스와 비 synapti 있다고 생각하지만C 접점은 일반적으로 쉽게 구별 (아래 참조 2 및도 3), 멀게하는 이미지 분석에 고유 한 주관 인한 바이어스를 최소화해야한다.

  1. 보상 마법사로 단일 얼룩 제어 데이터 파일을로드하여 보상 매트릭스를 생성한다. 단일 스테인드 파일을로드 한 후, 실험에 사용 된 형광 채널을 선택합니다.
    주 : 소프트웨어가 자동으로 보정 행렬을 발생하지만,이 수동으로 정확한 양의 집단이 선택되었는지 확인하기 위해 검증되어야한다.
    1. 행렬에서의 값을 더블 클릭하고, 분석 영역에 추가 그래프. 죽은 세포 / 이중선 / 오탐 (false positive)을 제외하기 위해 필요한 경우 새 게이트를 만들기; 새로운 양의 정제 인구는 각 채널에 대한 드롭 다운 메뉴에 매트릭스 상자에서 선택 될 수있다.
    2. 각 채널에 대해이 작업을 반복합니다. compensatio을 저장할 "마침"을 클릭합니다N 행렬 (.ctm 파일).
  2. 분석 소프트웨어로 .rif 파일을로드하고 보정 매트릭스를 적용함으로써 원시 파일 (.rif)로부터 데이터 분석 파일 (.daf)을 얻었다.
  3. 데이터가로드되면, T 세포 APC 연락처 이벤트를 식별하는 게이팅 수행합니다.
    주의 : 전형적인 게이팅 전략 - 포커스 이벤트를 식별하는 것을 포함한다, 사이즈 조건 (이벤트의 종횡비 대 면적)에 기초 이중선을 선택하는 T 세포 이중 양성 이벤트로 T 세포 APC의 이중선을 선택한 APC 마커 (도 1A-C).
    주 : 종횡비 단셀에서 차별 이중선 (1 비율 확대) (0.5 비율 확대)을 허용 높이에 이벤트의 폭의 비율이다.
  4. 루트는 브라이트 채널 (도 1a)에 묘화 강도 프로파일 (구배 RMS)의 변화 비율의 제곱 평균에 의해 플로팅 - 포커스 이벤트를 식별. 일을 클릭즉 그라데이션 RMS 히스토그램 빈들에서 개별 셀 이벤트를 표시하고 포커스 아웃 이벤트를 제외한 게이트를 배치한다.
  5. 브라이트 채널의 종횡비 대 면적 플롯 및 일정 형상 및 크기 (도 1b)에 기초하여 식별 이중선 게이트 그린다. 단지 내부와이 게이트의 경계 외부 이벤트의 이미지 검토 게이트의 크기와 위치를 수정하기 위해 분석을 할 수 있습니다. 그 후, T 세포 마커의 강도가 하나 개의 축에 나타나고 APC 마커의 강도가 다른에서 나타나는 이중 이러한 이벤트의 플롯을 구성. 두 마커에 대한 긍정적 인 이벤트를 포함하는 T-APC의 이중 게이트를 그립니다.
  6. T 세포 APC의 이중 이벤트 단지 하나 개의 T 세포 하나 APC를 포함, 선택 이벤트 중.
    1. 는 APC 마커 영역 대 종횡비를 플로팅으로하고 단일 APC (도 1D)을 함유 이중선 게이팅함으로써 이것을한다. T 세포 마크 영역 대 종횡비 플롯하나의 T 세포 (도 1E)를 포함하는 이중 상태에서 ER 및 게이트.
      주 : 또한 정제는 두 지점 (도 1F)로 이벤트를 핵 염색 형광 게이팅에 적용 스폿 카운트 함수의 플롯을 히스토그램에 의해 달성 될 수있다.
  7. 어떤 경우에는 이중에서 두 세포는 접촉하지 않을 것이다; 서로 접촉 세포를 식별 장갑차와 T 세포에 대한 객체 마스크를 정의합니다.
    1. [마스크 관리자를 열고 새 마스크를 정의하기 위해 분석 메뉴에서 "마스크"옵션을 사용합니다. 같은 이름을 입력 "T 세포 객체 마스크입니다." 은 "기능"버튼을 클릭하고 대화 상자에서 선택 "개체를."
    2. T 세포 마커가 검출되는 채널 (예를 들어, CH06)를 선택한다. "OK"를 클릭하십시오.
      참고 : "개체 (타이트 M06, CH06)는"기능 상자에 표시됩니다. 이 기본 객체 마스크 보통 법과잘 KS하지만 최적화가 필요할 수 있습니다.
    3. 적절한 채널의 APC 객체 마스크를 만들려면이 과정을 반복합니다.
  8. 는 APC와 T 세포 마스크를 식별 한 후, T 세포 개체 마스크 APC 형광 강도에 대한 APC 객체 마스크 T 세포 마커 형광 강도를 플롯하여 막 접촉을 결정한다. 이 그래프에서 서로 접촉 만 세포를 포함하는 게이트를 그린다.
    참고 : 일반적으로, 매우 명확 더블 긍정적 두 번 부정적인 인구 (그림 2A에게)이있다. 더 - 이중 양성 더블 네거티브 집단 사이의 경계를 접촉하는 셀이 게이트 내에서 접촉하지 세포가 배제되는 것을 보장하기 위해 경계 영역의 셀 명 시야 이미지를 확인하여 설정 될 수있다.
  9. 이 단계에서 수동으로 간단한 세포 - 세포 접촉에서 성숙 면역 시냅스를 구별하기 위해이 문 내에서 이벤트의 팔로이 딘 FITC 이미지를 검토합니다. 유이러한 이미지를 표시하기 위해 "태그 이미지"기능을 SE는.
    참고 :이 문 내부 태그 이벤트 (면역 시냅스)의 비율은 T 세포 인구 직접 alloreactivity의 지표로 사용될 수있다는 연구되고있다.

결과

이 방법은 이소성 심장 동종 이식하기 전에 공여자 alloantigens 내성 렌더링 마우스에서 CD4 + T 세포 alloreactivity을 조사 하였다. CBA 마우스 (H-2 k)는 (H-2 B B6) 비 - 고갈 CD4 항체 일개월 결합 수혈 전에 B6 심장 이식의 수신에 도너 특정 이루어진 내성 프로토콜을 받았다. Foxp3의 + T 조절 세포 (36) (37)에 의존 장기 이식 생존율이 프로토콜 결과. tolerized B6 및 심장 동종 이식 비 tolerized받는 공동 배양이 프로토콜에 따른 B6 골수 유래 수지상 하였다로부터 이식 후 7 일 후에는, 비장 CD4 + T 세포를 얻었다. 도 2는이 실험의 대표 데이터를 도시한다. 멤브레인 컨택 게이트는도 2에 도시A, 녹색 십자선 시냅스 이벤트에 배치하여 (좌측 패널 (1)) 및 비 이벤트에 시냅스 (오른쪽 패널). 도 2b는이 이벤트의 시야와 형광 채널을 나타낸다. 편견을 줄이기 위해, 데이터 처리 할당 (23)에 눈을 멀게 관찰자에 의해 분석 하였다. 모두 비 tolerized에서도 3에 여러 실시 예에 도시 된 바와 같이 (도 3A-B) 및 tolerized (도 3C-D) B6 하트 CBA 수신자는 시냅스는 T-APC 계면에서 고밀도 FITC 양성 리지의 존재에 의하여 비 시냅스 접촉으로부터 쉽게 구별된다. 이러한 결과는 수신자 T 세포에 의한 면역 시냅스 시각적 검출 수신자에 alloreactivity 정도에 트랙을 보여준다.

figure-results-1130
막과 T-APC는 이중의 그림 2. 확인연락처 및 면역 시냅스 형성. 최종 이중 게이트 (도 1F)의 이벤트는 분석된다. 는 APC 객체 마스크 A. T 세포 마커 형광은 DC 객체 마스크 APC 형광 마커에 대해 도시된다. 일부 이중 이벤트가 세포 - 세포 접촉없이 APC와 T 세포가 있고 플롯의 왼쪽 하단 모서리에 표시 (이미지가 표시되지 않음). 멤브레인 컨택 게이트 따라서 T 세포와 항원 제시가 접촉하는 유일한 이중선를 포함 그려 질 수있다. 이 게이트의 각 이벤트의 이미지는 팔로이 딘-FITC 채널에서 액틴 세포 골격 재 배열 증거 검토 및 분석 소프트웨어를 사용하여 태그 될 수있다. 왼쪽 패널은 오른쪽 패널 면역 시냅스 형성없이 막 접촉 이벤트를 나타내는 반면, 면역 시냅스 이벤트 (1로 표시된 녹색 십자선으로 나타냄)를 나타내는 (2로 라벨링 및 녹색 십자선으로 나타냄). 시냅스 형성의 결정은 이들의 수동 검토가 필요이미지, B. B.에 도시 윗줄은 면역 시냅스와 이중선 대한 시야와 형광 채널 영상을 나타낸다 (A 이벤트의 1에 해당); 하단 행 막 접촉하지만 부족한 시냅스 형성 (A 2의 이벤트에 대응)와 이중선을 나타낸다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2121
T-APC 시냅스 형성의 그림 3. 예. CBA 마우스는 (하나 없음 전처리 (AB) 후, 또는 비 - 고갈 항 CD4 항체의 언더 커버 B6 전혈 내성 유도 후 B6 공여자 심장 동종 이식을받은 룽> CD). 7 일 후, 비장 CD4 + T 세포와 수지상 B6 시냅스 형성에 대해 시험 하였다. A. 비 tolerized 동물에서 막 접촉 비 시냅스 이중선의 세 가지 예를 도시한다. B. 비 tolerized 동물에서 면역 시냅스의 세 가지 예. C. tolerized 동물에서 막 접촉 비 시냅스 이중선의 세 가지 예를 도시한다. D. tolerized 동물에서 면역 시냅스의 세 가지 예. 시냅스 형성은 T-APC 인터페이스 (CH03)에서 밝은 FITC 양성 리지의 존재에 의해 표시된다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

AYS "> 항체 / 염료 형광 색소 채널 집중 중 CD11c eF450 CH02 5 ㎍ / ㎖, 경험적 적정 CD90.2 APC CH06 5 ㎍ / ㎖, 경험적 적정 Phalloidin의 FITC CH03 0.05-0.5 ㎍ / ㎖의 7-AAD - CH05 25 ㎍ / mL의

표 1. 항체이 연구에 사용 된 염료. 형광 색소 - 복합 된 항체, 염료, 공급자, 권장 농도는 표에 제시된다. 각각의 형광 색소를 검출하기 위해 사용 된 채널 사이토 촬상 유량은 표에 도시된다.

토론

이미징 유동 세포 계측법 단클론 T 세포와 항원 제시 사이 또는 초 항원 24, 25, 26, 27, 28의 존재하에 면역 시냅스 형성을 설명하기 위해 사용되었다. 이 방법은 생산 T 세포 APC 접촉 한 후, T 세포는 접촉 (21)의 위치를 향해 편광 그 액틴 세포 골격 재 배열된다는 사실을 이용한다. 이 재 배열 TCR 시그널링없이 발생하지 않으며, 따라서, T 세포의 활성화 (19), (20), (21)의 초기의 상관 관계이다. 여기에 제시된 방법은 폴리 클로 날 T 세포 개체군 alloreactive T 세포 주파수의 측정에이 방법을 적응시킨다. 따라서, 그것은 미래에 기증자 reactivi에 대한 분석의 개발을위한 기반이 될 수 있습니다 임상 이식에 타이.

직접적인 비교는 아직 이루어지지 않았지만, alloreactive 면역 시냅스의 검출은 기존의 MLR보다 뛰어난 예측 능력을 가지고 나타납니다. 내성 프로토콜은 상술 한 예를 들어, 이전의 연구는 것을 보여 주었다 MLR 결과 확실 그래프트 2 상관 결과 못한다.

이러한 alloantigen에 응답 이펙터 세포의 기능을 측정하지는 않지만 분석법 수많은 인간 9, 10, 11에서의 동작 적 상태에 대한 내성이 개발되어왔다. 반대로, IFNγ ELISPOT 8 계수 이펙터 T 세포 기능 분석되지만, IL-17 (38)와 같은 급성 및 만성 동종 이식 거부 반응과 관련이있다 사이토 카인 분비의 전체 스펙트럼을 캡처 할 수있는,> 39. 노동 집약적 인 제한 희석 분석 4, 쥐를 필요로하는 트랜스 - 생체 분석 (6), 임상 환경에서 자신의 응용 프로그램을 방해 할 중요한 실질적인 한계가 있습니다. MLR에 응답 T 세포의 TCR 서열 분석을 이용하여 세포 증식 분석의 최근 개선이 값이 될 수 있지만 여기에 제시된 분석과 같은, 임상 시험 18 40 추가 검증을 필요로한다.

면역 시냅스 탐지 분석의 추가 개발은 중요한 질문의 번호가 대답하는 것이 필요합니다. 먼저 개발로 분석은 직접 alloreactivity을 측정한다. 직접 경로는 도너 유래 장갑차에 동종 MHC / 펩티드 복합체의 표현을 포함한다. 후자는 일반적으로 이식 후 신속하게 제거하고, 또한 alloantigen 발표되어있다 CARRI그대로 공여 MHC (세미 직접 경로)을 제시받는 장갑차 또는 자기 MHC (간접 경로)에 처리 도너 항원하여 에드. 간접 경로는 만성 동종 이식 거부 (33), (41)의 중요한 드라이버이다.

원칙적으로,이 분석을 이용하여 간접 면역 시냅스를 검출하는 것이 가능해야하지만, 간접적 alloreactive T 세포는 이벤트의 많은 수의 분석이 요구된다는 것을 의미 직접들 (42), (43)보다 훨씬 낮은 주파수를 가지고있다. 두 번째 고려 사항은 우리가 단지 CD8 + T 세포는 항 - 공여 반응의 중요한 구성 요소 인 반면, CD4 + T 세포를 사용하여이 시험을 시험 한 점이다. 다시,이 방법으로 CD8 + T 세포 APC 시냅스를 검출 할 수 있어야한다. 또 다른 한계는 본 방법은 최종 MEMB의 수동 검토 및 세포 영상 분석을 필요로한다는 것이다rane 사용자 연락처 게이트, 우리는 현재이 단계의 자동화에 노력하고 있습니다.

마지막으로, 방법은 인간을 대상으로 테스트 및 개발을 필요로하고, 인간의 샘플 예비 연구는 현재 수행되고있다. 이식 수혜자의 면역 시냅스의 검출과 함께 또한 표현형 T 세포의 부분 집합 분석 (즉, 이펙터, 메모리, 규제 등) alloreactive T 세포 레퍼토리를 특성화하기위한 강력한 접근 방식을 나타내는 것이며, 중요한 초점이 될 것이다 향후 연구.

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

SCJ는 심장에 대한 국제 사회와 폐 이식 연구 활동 및 의사의 왕 대학 및 Fellowship.SM 여행 캐나다 Detweiler의 외과 의사에 의해 지원되었다 심장과 (SCJ에) 폐 이식 경력 개발 수상 국제 사회에 의해 부분적으로 지원되었다. SS는 건강 연구 옥스포드 생물 의학 연구 Centre.JH의 국립 연구소에 의해 지원되었다하는 것은 신장 연구 UK 수석 비 임상 원정대의받는 사람입니다. 웰컴 트러스트 프로그램 그랜트 (082519Z07Z), 영국 심장 재단 프로그램 그랜트 (PG / 10 / 62.28504) 및 EU 프레임 워크 프로그램 7 (; BioDRIM 한 연구) :이 작품은 AB와 KW에 다음과 보조금에 의해 투자되었다. 저자는 같이 ImageStream 마크 X의 악기에 대한 액세스 및 지원을 제공하기 위해 마이클 파슨스와 Lunenfeld - 타넨 바움 연구소에서 유동 세포 계측법 핵심 시설, 시나이 의료 시스템, 토론토 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-buffered salineVariousVaries
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificAM9260G
Triton X-100 nonionic detergentSigma-AldrichX100
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
FormaldehydeSigma-AldrichF1635Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore sizeFisher Scientific08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichP5282
7-aminoactinomycin DThermo Fisher ScientificA1310Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2eBioscience17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11beBioscience48-0112Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3eBioscience13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class IIeBioscience13-5321
Biotinylated anti-mouse B220eBioscience13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8eBioscience13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19eBioscience13-0193
Anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
MidiMACS magnetic cell separatorMIltenyi Biotec130-042-302
recombinant mouse GM-CSFPeprotech315-03
recombinant human TGFβ1Peprotech100-21Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/AImaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/AFree download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium VariousVaries
Fetal bovine serumVariousVaries
Cell culture platesVariousVaries

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