Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

요약

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

초록

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC), 신경 그리고 glial 세포의 형태학 적 및 기능적 특성은 잘 보존 된. 이 모델은 neuroprotection, 뉴런, 신경 네트워크 또는 종양 침입에 electrophysiological 실험 연구를 포함 하는 다양 한 연구 질문을 해결 하는 데 적합 합니다. Hippocampal 건축과 multisynaptic 회로에 신경 활동은 잘 보존 OHSC, 비록 조각화 절차 자체가 처음 병 변 및 glial 흉터의 형성에 이르게. 흉터 형성 아마도 기계적 특성 및 작은 분자, 등의 방산 동작을 변경합니다. 분할 영역 동물 수술, 그리고 다양 한 두뇌 파생 된 셀 형식, 즉 이다, microglia 및 생리 적 및 병 적인 모두에서 뉴런 간의 상호 작용에 대 한 연구 없이 뇌 손상 후 시간 종속 프로세스의 모니터링 허용 조건입니다. 이 모델의 상반 된 측면 혈 및 면역 혈의 부재 이다. 신경 손상의 진행 하는 동안 혈액 재생 중요 한 역할에서에서 면역 세포를 마이그레이션. 그 셀은 조각에, 문화에 본질적인 프로세스 외부 간섭 없이 관찰 될 수 있습니다. 또한, OHSC에서 중간 외부 환경의 구성 정확 하 게 제어 됩니다. 이 방법의 더 이점은 표준 준비에 비해 희생된 동물의 낮은 수입니다. 몇몇 OHSC는 가능한 한 동물에서 여러 치료와 동시 연구를 만드는 하나의 동물에서 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, OHSC는 조직 손상 후 또는 종양 침공 기간 동안 새로운 보호 치료제의 효과 분석 하는 데 적합.

제시 하는 프로토콜 여기 매우 재현할 수 생성을 허용 하는 OHSC의 준비 방법에 설명 합니다, 그리고 잘 neuroprotection 또는 종양 침입 연구 처럼 실험적인 연구의 다양 한 사용할 수 있는 분할 영역을 보존.

서문

OHSC는 공부 microglia¹, 이다 및 신경 세포의 생리 및 병 적인 속성을 잘 특징이 생체 외에서 모델입니다. Extracellular 환경을 제어 하 고 다양 한 자극 후 셀룰러 및 형태학 상 변화를 모니터링 하는 것이 쉽습니다. Hippocampal 신경의 조직 및 그들의 연결 준비^2,3후 잘 보존 되어 있습니다. 여러 장점 중 OHSC 동물 수술 없이 뇌 상해와 종양 내 습의 모니터링 하실 수 있습니다. 6 ~ 8 OHSC 단일 설치류 두뇌에서 얻어질 수 있다. 크게 동물의 수를 줄이고 같은 동물에 여러 약물 농도, 유전자 조작 또는 다른 병 변 모델을 테스트 허용 OHSC 따라서 도움이 될. 분할 영역 기반 분석 실험에서 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 또한, 보조 손해 같은 병 적인 상태의 시간 종속 개발 시간 경과 영상에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다.

Stoppini 그 외 여러분 에 의해 원래 설립 주어진된 프로토콜에서 ⁴, 준비 단계는 설명 하 고 적절 한 조각의 선택에 대 한 중요 한 형태학 랜드마크 강조 표시 됩니다. 생 후 7-9 일 쥐 또는 산 후 4-5 일 쥐의 준비를 좋습니다. 이 기간에서 OHSC 기계적 충격 및 신경 회로의 개편을 위한 높은 잠재력에 강력한 저항을 표시. 반면, 배아 또는 성인 쥐에서 준비 급속 하 게 그들의 구조를 변경 재배 하는 동안 그들의 organotypic 형태를 잃고 고 따라서 덜 공부 하는 기초 연구^5,6 장기 프로세스에 적합 ^{, 7 , 8 , 9 , 10 , 11}. OHSC의 생존 율에 대 한 또 다른 중요 한 포인트 확산 및 따라서 영양소 공급은 제한 된^12,,1314조각 자체의 두께입니다.

프로토콜

에 의해 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU 유럽 의회의 승인으로 동물 실험 윤리 정책 및 신경 과학 연구에 있는 동물의 사용에 정책에 따라 수행 했다 고 과학적 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 유럽 연합의 위원회.

1. 준비의 악기와 문화 미디어

1. OHSC의 준비에 대 한 사용의 다음 세트: 2 개의 작은 위, 두 곡선된 핀셋, 좋은 팁, 한 트위터 (크기 11, 하나 크기 15의 2), 3 개의 블레이드 세 메스 홀더, 필터 종이 라운드 (직경: 35mm), 한 천, 한 면도날 하나 수정 파스퇴르 피 펫, 그리고 한 파스퇴르 피 펫 팁 없이 수정. ( 그림 1) 사용 전에 압력솥에 모든 재료를 소독.
2. 한 천 5 g의 무게와 증류수 100 mL 물에 용 해. 압력솥에 210.8 kPa에서 121.7 ° C에서 20 분에 대 한 솔루션을 소독. 60 mm 페 트리 요리를 멸 균 유리 피 펫을 사용 하 여 3 mL 액체 agar 솔루션 배포, 5 h에 대 한 강화, 오염을 방지 하 고 더 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 플라스틱 파라핀 영화 커버 수 있습니다. 한 블록 조각화 절차 동안 두뇌를 안정화 하는 데 필요한.
3. 미디어
   1. 준비 매체 (pH 7.35)의 게 200 mL로 구성 된 198 mL 최소한의 필수 매체 (MEM)와 2 mL L-글루타민 솔루션 (최종 농도 2 m m). 미디어 준비의 날에는 솔루션을 준비 하 고 4에서 저장 ° c.
   2. 준비 49 mL MEM, 25 mL 행 크 스의 구성 된 문화 매체의 100 mL ' 균형 소금 솔루션 (HBSS), 25 mL (v/v) 정상 말 혈 청 (NHS), L-글루타민 솔루션 1 mL (최종 농도 2 m m), 100 µ g 인슐린, 혈당 120 mg, 10 mg 스 10000 U 페니실린과 800 µ g 비타민 C로 이전 보고. 따뜻한 매체 (37 ° C), pH 값 pH 7.4와 살 균 필터 (0.2 µ m 기 공 크기)을 조정. 매체를 변경 하기 전에 모든 둘째 날 (워밍업, pH 조정, 등.) 하는 절차를 반복 합니다. 1 주일 동안 매체를 가장 사용 하는 방법 4에 저장 될 때 ° c.
4. 준비 중간 두뇌를 저장 한 35 mm 페 트리 접시를 채워. 작업 영역에서 냉각 팩에 조직을 수집 하기 위해 두 개의 빈 접시를 놓습니다.

2. 준비 하 고는 Vibratome와 썰

1. 사용 두뇌 4-5 일 또는 7-9 일 오래 된 쥐에서 Stoppini 동부 표준시 알에 따르면 OHSC 준비에 대 한 오래 된 쥐. ⁴ 후 동물의 잘린, 제거 피부 두개골에서가 위.
2. 구멍 매그넘으로 좋은 시저의 블레이드를 소개 하 고 꼬리 (다시) rostral (프론트) 축 따라 절단 하 여 두개골을 엽니다. 두 게가 위가 각각 왼쪽과 오른쪽 귀 쪽으로 포인트를 첫 번째 수직 인하 (" T-절 개 ").
3. 주목 하지 뇌 손상 미세 집게와 신중 하 게 두개골을 엽니다. 메스 (블레이드 크기 11)를 사용 하 여 정면 극과 소 뇌의 가장 rostral 부분을 잘라.
4. 주걱의 두뇌를 제거 하 고 신중 하 게 준비 중간 ( 그림 2)으로 가득 페 트리 접시에 배치에 의해 의미 합니다. 두뇌 견본 홀더를 놓고 의료 cyanoacrylate 접착제로 그것을 수정 합니다. 한 천 조각을 사용 하 여 기계적인 안정화 보장.
5. 350 µ m에 가로 조직 해 부 슬라이딩 vibratome를 사용 하 여 두꺼운 OHSC.
6. 광학 쌍 안 현미경을 사용 하 여 분할 영역을 평가 합니다. 낮은 품질의 OHSC를 즉시 삭제 합니다. 만 그 조각 그대로 cytoarchitecture 해 마의 중간 부분에서 고립 된 데는 것이 중요 하다 (그림 3 및 4 참조)는 지 느 러 미 및 복 부 해 마 사이.
7. Hippocampal 지역과 entorhinal 외피 (둥근 블레이드 크기 15; 메스를 사용 하 여 분리 그림 3)입니다. Perforant 통로 entorhinal 외피를 유지 해야 합니다.
8. 6 ~ 8 OHSC 각 뇌에서 얻을 수 있습니다. 한 셀 문화 삽입 (기 공 크기 0.4 µ m)에 2-3 조각을 전송 하 고 잘 당 1 mL 문화 매체를 포함 하는 6-잘 문화 접시의 한 잘에.
9. 5% (v/v) 공동 ₂ 완벽 하 게 습도 분위기에서 35 ° C에서 6-잘 요리를 품 어 및 변경 세포 배양 매체 마다 둘째 날.
   참고: 6 일간에 체 외에서 (div)에서 실험을 실시 합니다. 조각화 절차와 관련 된 염증 성 반응 하루 6 사라집니다. 이 단계에서 microglial 셀 다시 없는 형태 표시 고 시 냅 스 연결 성숙 했다.

3. 조직의 품질의 평가

1. 고정, 라벨 및 OHSC 서에서 degenerating 신경의 시각화
   1. 실험을 수행한 후에 5 µ g/mL propidium 요오드 화물 (PI) 이전에 고정, 2 h와 OHSC를 품 어 degenerating 신경 세포의 핵을 얼룩 순서.
      주의: PI는 의심 되는 발암 물질, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 항상 착용.
   2. 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.4)와 OHSC를 세척 하 고 24 헤 대 한 paraformaldehyde (PFA)의 4% (v/v) 솔루션으로 해결
      주의: PFA 의심과 독성 발암 물질 이다. 증기 두건에서 작업 및 보호구 착용.
   3. 1 mL PBS와 삽입에는 OHSC를 세척 하 고 찡그린 브러시 막에서 분할 영역을 사용 하 여.
   4. 24-잘 접시 ( 그림 5)에 IB ₄ 염료와 OHSC 라벨.
2. 붙일 사용 하 여 종양 내 습 실험의 전도 라는 단일 셀
   1. 실험의 시작에 앞서 24 h 형광 염료 Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl를 사용 하 여 종양 세포를 라벨 에스테 르 (CFDA SE).
   2. 분리 Neubauer 챔버를 사용 하 여 종양 세포를 계산 하 고.
   3. 매체에 셀 서 스 펜 션의 10 µ L 원하는 휴대폰 번호 (일반적으로 50000 또는 100000 세포) 포함 되도록 resuspend.
   4. 슬라이스 문화에 세포 현 탁 액의 10 µ L을 적용 하 고 3 일에 대 한 침략을 세포 허용.
   5. 실험의 끝에, 4% (v/v) PFA 24 h를 사용 하 여 슬라이스 문화를 수정 하 고는 cytoarchitecture를 시각화 하기 위해 또 다른 24 h에 대 한 PI와 공동 문화를 라벨.
      주의: PFA 의심과 독성 발암 물질 이다. 증기 두건에서 작업 및 보호구 착용.
   6. 설치 미디어를 사용 하 여 추가 분석을 위해 커버 슬립에 공동 문화를 탑재.

4. OHSC 실험의 평가

는 OHSC confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 분석. PI의 감지 표시, 신경 세포를 변질 또는 파장 λ의 단색 광을 사용 하는 cytoarchitecture를 표시 하는 PI = 543 nm 및 방출 밴드 파장 λ에 대 한 필터를 통과 = 585-615 nm. CFDA 레이블이 종양 세포 또는 IB ₄ microglia는 여기 파장 λ의 사용 = 488 nm. 두 실험 종류에 대 한 z-스택 2 µ m 두께 광 조각으로 기록 하 고 평가 대 한 사용.

결과

Neuroprotection 연구: 신경 손상, PI 긍정적인 핵과 IB₄ 가 이랑 (DG)의 립 세포 층 (GCL)의 모든 3 광학 섹션에서 microglia 계산 했다 긍정적인의 수를 결정 합니다. 종양 내 습 실험, 스택의 최대 강도 z 프로젝션 계산 침략의 다른 침입 패턴 (그림 6)를 시각화 하는 측정으로 종양 세포에 의해 커버 된 지역에 대 한 사용 되었습니다.

토론

현재 프로토콜 OHSC의 준비를 설명합니다. 이 모델은 내장 기능 및 뇌 조직의 반응의 생리 및 병리학 자극의 적용 후 테스트 수 있습니다. Electrophysiological 매개 변수 분석, 외 OHSC lesioned 수와 모든 세포 유형에 손상의 효과 확인할 수 있습니다. 다른 물질 및 lesioning 프로세스 또는 대 식 세포와 림프 톨의 부재에서 치유의 자세한 설명과 함께 치료 가능 하다.

The most 중요 한 단계?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well	Falcon	35-3046
Agar	Fluka	5040
Autoclav	Systec	DX-45
CFDA	Thermo Fisher	V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700	Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium	Invitrogen	32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Labs	FL-1101
Glucose	Merk	1083371000
Glutamin	Invitrogen	25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)	Invitrogen	24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)	Invitrogen	14170-138
Insulin	Sigma Aldrich	I5500
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960
L-Glutamin	Invitrogen	25030-024
LN229	Cell-Lines-Service	300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)	B.Braun	1050052
Millicell Culture Inserts	Millipore	PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid	Sigma Aldrich	M3262
Normal Horse Seum	Invitrogen	26050-088
Penicillin Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Petri dishes (all sizes)	Greiner	627160/664160/628160
PFA	Roth	0335.1	toxic
Propidium iodid (PI)	Sigma Aldrich	81845-25MG	toxic
U138	ATCC	HTB-14
Vibratome	Leica	Leica VT 1200