확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

요약

이 프로토콜은 환자 유래의 세포 배양 모델 또는 종양 미세 환경과 세포의 직접적인 특성화 확립 사후 확산 극한 뇌교 교종 샘플들의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다.

초록

확산 내장 뇌교 신경 교종 (DIPG)는 보편적으로 치명적인 예후를 운반 어린 시절 뇌간 종양이다. 외과 적 절제는 가능한 치료 전략 아니며 생검 일상적으로 수행되지 않기 때문에, 연구 환자 샘플의 유용성이 제한된다. 따라서,이 질병을 연구하는 노력은 충실한 질병 모델의 소수에 의해 도전을 받고있다. 이러한 필요를 해결하기 위해 시험 관내 분석에서 또는 생체 동 소성 이종 이식 실험에 사용할 수있는 내구성 환자 유래의 세포 배양 모델을 생성하기 위해 여기 사후 부검 조직 샘플의 빠른 처리를위한 프로토콜을 기술한다. 이 모델은 잠재적 인 약물 표적을 선별하고 DIPG 내에서 근본적인 병인 학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 분석 및 유전자 전 후속 분석을 활성화 (FACS) 정렬 형광 - 활성화 된 세포를 사용하여 종양 세포 미세 환경을 격리하도록 확장 될 수있다Pression의, 단백질 발현, 또는 벌크 셀 또는 단일 세포 수준에서 DNA의 후생 유전 학적 변형. 마지막으로,이 프로토콜은 다른 중추 신경계 종양 환자 유래의 배양 물을 생성하도록 구성 될 수있다.

서문

DIPG은 일반적으로 중간 어린 시절 ^{1, 2시,} 복부 뇌교에서 발생 공격적인 중추 신경계의 악성 종양이다. 임상 시험의 수십 년에도 불구하고, 현재의 치료는 일시적으로 개선 또는 증상의 안정화를 제공 방사선 치료, 제한되며 단지 3 개월 평균 평균 생존을 확장합니다. 심지어 방사선, 평균 생존율은 초기 진단 2 년 이내에 질병으로 죽어가는 어린이의 90 % 만 9개월입니다. 때문에 종양과 뇌간의 중요한 기능의 침윤성 특성, 수술 적 절제 할 수 없습니다. 조직 학적 분석은 일반적으로 단독으로 신경 영상으로 만들어 질 수 임상 치료 및 진단에 유도 전류 역할이 없기 때문에 또한, 미국에서, DIPG 수술 적 생검을 수득 역사적 ³ 수행되지 않았다. 종양 조직 (F)의 이와 같이, 가용성또는 연구는 후보 약물 분자와 기본 종양 생물학에 대한 연구를 수행하기위한 노력을 제한, 제한된다. 특히, 뇌 영상 및 정위 기술의 개선, 분자 생물학의 발전과 결합 될 때, 질병에 대한 우리의 이해를 변형 한 최근 ^4에 DIPG의 안전 생검의 개발을 허용했다. 현재 치료 계획을 개체화에 대한 선행 생검 및 DIPG의 분자 프로파일 링을 사용하여 여러 임상 시험 진행 (NCT01182350, NCT02274987) ^5입니다.

DIPG 및 기타 소아 고급 신경 교종은 성인 아교 모세포종 대응 ^{6, 7에서} 별개의 질병을 나타내고, DIPG의 따라서 충실한 실험 모델은 고유의 병태 생리를 이해하는 데 필요한 효과적인 치료 전략을 발견 할 수 있습니다. 최근 DIPG 종양 t를 획득하기위한 노력을 집중부검시의 연구에 대한 문제는 또는 덜 일반적으로 조직 검사는 우리의 이해와 DIPG을 연구하는 능력을 혁명을 일으켰다. 게놈지도의 노력은 H3 히스톤 가족 3A (H3F3A) 및 히스톤 클러스터 1 단백질 ^{8, 9, 10, 11 부호화} 히스톤의 돌연변이에 의한 인체 질병의 제 1 예를 나타내는 H3b (HIST1H3B)에서 재발 성 돌연변이를 밝혀 . 또한 DIPGs의 서브 세트는 이전에 암을보고하지만 선천성 소아 발달 장애 fibrodysplasia 골화의 progressiva ^{8, 9, 10, 11에서} 발견되는 변이와 동일하지 않은 ACVR1 유전자의 돌연변이를 나타낸다. 뿐만 아니라, 첫 번째 환자 유래 DIPG 세포 배양 및 소성을 이종 이식 개월델 ^{이제, 2, 12, 13, 14,} 면역 결핍 마우스에 종양 세포의 이종 이식을 통해 직접 구축 마우스 모델 시리얼 이종 생성뿐만 아니라 ^{3, 14, 15 일에} 설립되었다. 이러한 환자 파생 모델을 사용하여 초기 약물 검사 노력은 임상 번역 ^{4, 14} 유망한 새로운 에이전트를 식별하고 적어도 하나의 임상 시험 (NCT02717455)을위한 토대를 마련했다.

진행으로이 첫 번째 단계는 시작에 불과하며, 많은 환자 유래의 조직 샘플과 문화 모델은 가장 효과적인 치료 전략을 질병의 하위 유형을 정의하고 개발하는 데 필요합니다. 유전자 엔진DIPG 겹의 마우스 모델은 또한 질병의 우리의 기본적인 이해를 증진 겨냥한 연구를 촉진 할 것이다. DIPG에 대한 유전 적 모델을 생성하기 위해 만든 노력은 위에서 설명한 기초 게놈 연구의 도움되지만 옵션의 현재 제한된 수의 사용할 수 있습니다. 조직 학적으로 유사한 고급 뇌간 신경 교종를 생성하는 하나의 모델은 신생아 마우스 ^{(5), (16)의} 후두에 네 스틴 양성 세포에 PDGF-B 과발현과 Ink4a-ARF 손실을 구동하기 위해 바이러스 RCA 단자 / TV-시스템을 사용합니다. 또 다른 ^{방법은도 6, 7, 17} 종양이 세포를 렌더링하는데 충분하다 인간 배아 줄기 세포 유래의 신경 전구 세포에서 여러 주요 DIPG 관련된 돌연변이 (히스톤 H3.3의 K27M 돌연변이 p53의 손실 PDGFRA 활성화) recapitulating 포함한다. 유전 적 방법과 환자 deriv의 조합ED 모델은 임상 시험을 사용하고 효과적인 치료제의 개발을 촉진 할 것이다.

위에서 설명한 DIPG 연구의 과제를 해결하기 위해이 급속 부검 프로토콜 조사 ^{8, 9, 10, 11, 12, 14,} 환자 유래의 배양 세포를 생성하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 조직의 생존을 보호하고 확장 사후 간격 반송 시간과 관련된 문제에도 내구성 문화를 생성하는 가능성을 극대화하는 것이다. 성공적으로 생성되면,이 DIPG 배양 환자 유래의 세포에 대한 잠재적 인 치료 분자의 평가를 허용 후속 시험 관내 및 생체 내 조작 이종 이식 실험에 사용될 수있다.

프로토콜

이 프로토콜은 모든 환자 데이터의 적절한 드 식별과의 제도적 검토 보드에서 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 가이드 라인에 따라 승인을 수행하고있다. 이전에이 프로토콜 작업에 대한 환자의 가족에서 모든 해당 기관 검토위원회의 승인과 동의를 얻습니다.

1. 조직 샘플을 얻기

참고 :이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 부검시 즉시 시작하는 조직 기증의 적절한 처리가 필요합니다. 전체 샘플 가능성은 즉시 항생제 / 항진균제로 보충 적절한 냉각 매체로 조직을 전송의 사후 간격 (PMI)를 최소화하는 교통 전반에 걸쳐 젖은 얼음에 샘플을 유지하고, 프로토콜에 걸쳐 무균 기술을 유지에 크게 의존한다.

1. 통지시임박한 기부의 샘플 채취 키트를 준비합니다. 다음의 재료는 직접 조직 샘플의 복귀 운송을 위해 사용될 수있는 단열 용기 운송 박스를 포함하여 :
   1. 멸균 장갑, 커튼, 그리고 메스를 포함하여 멸균 준비를위한 자료를 포함합니다.
   2. 얼음이나 차가운 팩 단열 용기에 30 mL의 전달 매체를 포함하는 10 멸균 50 ML 원뿔 튜브 - (8)를 포함합니다.
      주 : 표준 세포 배양 배지가 작동 할 수 있지만, 가장 가능성이 샘플 항진균제 / 항생제가 보충 절전-A로 구해진다.
   3. 다른 분석 (예를 들어, 고정 제)에 대한 추가 샘플 튜브를 포함합니다.
   4. 부검은 연구자의 사이트에서 수행하지 않을 경우, 명확하게 종양 샘플을 수집하는 방법을 내용의 문서를 포함한다. 이는 너와 같은 중뇌 및 수질에서 샘플을, 불임을 유지 젖은 얼음 샘플 튜브를 유지, 등 등의 세부 사항을 포함MOR 세포는 종종이 지역을 침공.
2. 부검 동안 불임을 유지한다. 두개골 내부의 무균 뇌를 고려, 그래서 두개골이 열려 번 (변경 장갑 포함) 멸균 기술을 관찰합니다. 피부와 머리 오염을 방지하는 것이 중요합니다.
3. 복부 측면에서 종양 해부 (뇌교의 "배"를 보충 그림 1 참조). 멸균 메스로 종양에서 작은 1cm 덩어리를 잘라 즉시 차가운 배송 미디어 (단계 1.1.2의 주 참조)로 전송하고 젖은 얼음에 넣어. 40 mL를 각 튜브의 조직과 미디어의 최종 부피 결과, 각각의 튜브에 조직의 10 ㎖를 놓습니다.
   주 : DIPG의 경우에는 종양이 확산 자주 뇌교 및 뇌간 나머지 침투. 뇌교에서 - (40㎖의 조직 30) 및 1-4 튜브 - 중뇌 및 골수에서 - (20 ㎖ 조직 10) 각각이 관과 같은 통상적으로 3 포함한 가능한 샘플만큼 수집한다.
4. 샘 수집중뇌 및 수질에서 PLES는 종종 많은 종양 세포를 포함하는 뇌교에 병치.
5. 샘플 수집 후, 단열 용기에 젖은 얼음 샘플 O / N를 제공. 동결 세포를 죽일으로, 드라이 아이스에 샘플을 제공하지 마십시오.

샘플 처리를위한 2. 준비

1. 이전 샘플 준비를 시작으로, 1 시간 동안 UV 광 하에서 면도날 곡선 지혈제, 기타 비 멸균 도구와 함께 조직 배양 후드 살균. 배양의 오염을 방지하기 위해 멸균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행한다.
2. 준비 및 살균 필터 솔루션을 제공합니다.
   1. 1.8 M 수크로오스 용액을 조제 증류수 300 ㎖의 308.07 g 자당을 녹인다. 추가 50 mL의 10 배 칼슘 또는 마그네슘없이 식염수 솔루션 (HBSS)을 Hank's은 버퍼 증류수를 사용하여 500 mL의 전체 볼륨을 가지고. 4 ℃에서 보관하십시오.
   2. 소화 효소 용액을 제조, (5)을0 ㎖의 다진 조직마다 10 ㎖ 칼슘 및 마그네슘 HBSS 500 μL 5 ㎎ / ㎖의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (최종 농도를 50㎍ / ㎖) 500 μL 2.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제의 I / II 및 디스 파제 용액 (최종 농도 25 추가 μg의 / ㎖) 500 μL, 1 M HEPES 완충액. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 소화 솔루션입니다.
   3. 종양 줄기 미디어 (TSM)베이스를 준비하려면, 250 mL의로 Neurobasal-A, 250 mL의 둘 베코의 수정 된 이글 매체를 혼합 : 식품 혼합물 F12 (DMEM / F12), 5 ㎖의 100 배의 항생제 항진균제, 5 ㎖의 200 mM의 L 알라 닐 L-를 글루타민 디 펩티드 (루타-A), 5 ㎖ HEPES 완충액 5 ㎖의 100 mM의 피루브산 나트륨, 5 ㎖의 100 × MEM 비 필수 아미노산.
   4. TSM베이스에 다음과 같은 보충제를 추가, 성장 인자와 전체 TSM을 준비하려면 다음을 50 배 B27 보충 마이너스 비타민 A (1시 50분), 인간 표피 성장 인자 (H-EGF, 20 NG / ㎖), 인간 섬유 아세포 성장 인자 (H- FGF 20 NG / ㎖), 인간 혈소판 유래 성장 인자 AA (H-PDGF-AA, 10 NG / ㎖)인간 혈소판 유래 성장 인자 BB (H-PDGF-BB, 10 NG / ㎖), 헤파린 용액 (2 μg의 / ㎖).
3. 4 ° C까지 스윙 버킷 로터가 장착 된 실험실 원심 분리기를 사전 냉각.

3. 기계 해리

1. 높은 벽으로 둘러싸인 100mm X 20mm 세포 배양 접시에 조직을 전송합니다. 운송에서 미디어의 나머지를 제거하고 10로 교체 - 15 mL의 차가운 문화 미디어.
2. 만곡 지혈제를 사용하면, 면도날을 파악 명백한 혈관이나 수막을 제거하면서 미세 조직을 말하다.
   주 : 최종 조직 절편 1mm보다 작아야한다 (도 1b 참조).
3. 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브로 조직을 전송합니다. 추가로 5 mL의 차가운 문화 매체와 세포 배양 접시를 세척하고 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 남은 조직을 전송하기 위해 필요한이 세척 단계를 반복합니다.
4. (- 5 회 4) 10 mL의 혈청 학적 피펫을 사용하여 부드럽게를 씹다. 큰 담배 마는 허용UE 단편은 튜브의 바닥에 침전한다. 필요한 경우, 간단히 1 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 샘플을 원심 분리기.
5. 기계적 해리 분수를 수집합니다.
   1. 상층 액을 제거하고 표시된 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 필터링 "기계 해리." 원래 원뿔 튜브를 통해 필터 전환 및 조직 조각을 복구하기 위해 문화 미디어로 씻는다.
   2. 5 분 (350 XG, 4 ° C)은 "기계 해리"부분을 원심 분리기.
   3. 펠렛 "기계 해리"부분에서 상층 액을 제거하고 차가운 문화 매체의 조직을 재현 탁. 은 "기계적 해리"원뿔형 튜브 조직 이상 5 ㎖가있는 경우에는 튜브보다 5 ㎖ 조직을 갖고 없도록 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 조직을 분할.
6. (자당 그라데이션 원심 분리 단계까지 인트를 얼음에 기계적 해리 부분을 저장페이지 5). 또한, 기계적 해리 부분은 효소 해리 잠복기 (단계 4.4) 중 5 단계로 진행할 수 있습니다.

4. 효소 해리

1. 나머지 큰 조직편을 함유하는 튜브에 조직 이상 5 ㎖이 경우에는 튜브보다 5 ㎖ 조직을 갖고 없도록 다른 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 조직을 분할.
2. 5 분 (350 XG, 4 ° C)에 남아있는 조직 절편을 함유하는 원뿔형 튜브 (들)를 원심 분리기.
3. 데워진 효소 소화 솔루션을 뜨는을 제거하고 추가, 매 1 mL의 조직에 대한 5 ㎖ 소화 용액이되도록 (예를 들어, 5 ㎖ 조직 25 mL를 소화 용액).
4. 실험실 필름 원추형 튜브의 뚜껑을 밀폐하고 30 분 동안 37 ° C에서 회 전자에 반응을 배양한다.
5. 배양 후, (그림 1C 참조) 부드럽게 샘플을 씹다.
   1. 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여,피펫 샘플까지 6 다운 - 8 시간. 과도한 공기 방울을 생성하지 마십시오.
   2. 피펫의 마지막에 1,000 μL 피펫 팁을 추가하고 추가로 6 씹다 - 8 번.
   3. 남아있는 덩어리가 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 제거하고 여전히 "효소 해리"이라는 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 정지 세포와 뜨는을 필터링하고 얼음에 저장합니다.
   4. 큰 조직 조각이 남아 있으면, 조각에 칼슘과 마그네슘에 추가로 10 ㎖의 HBSS를 추가하고 반복 3.5.1와 3.5.2 단계를 반복합니다. 은 "효소 해리"튜브에 100 μm의 필터를 통해이 최종 솔루션을 필터링합니다.
6. 5 분 (350 XG, 4 ° C)의 "효소 해리"튜브를 원심 분리기 및 자당 기울기 원심 분리를 계속합니다.

5. 자당 그라데이션 원심 분리

1. 샘플은 아직 용액 centrifu에 현탁하면5 분 (350 XG, 4 ° C)에 대한 GE의.
2. 칼슘과 마그네슘없이 20 mL의 차가운 HBSS에 뜨는 및 재현 탁 조직을 제거합니다. 차가운 HBSS 25 ML의 총 볼륨 업을 가져옵니다.
3. 천천히 25 mL의 1.8 M 자당 솔루션을 추가하고 혼합하는 튜브를 반전. 이것은 0.9 M 자당 기울기가 발생합니다.
4. 10 분 (800 XG, 4 °에 C)에 대한 더 브레이크 원심 분리기. 그라데이션을 방해하고 수율을 감소 (전 원심 분리 후 샘플의 예는 그림 1D 참조)하는 원심 브레이크를 사용.
5. 조심스럽게 수초의 파편과 가능한 한 많은 자당 솔루션을 기음. 칼슘과 마그네슘없이 30 mL의 차가운 HBSS를 추가하고 부드럽게 혼합하여 샘플을 씻으십시오. 5 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 원심 분리기.

6. ACK 적혈구 용해

1. 세척 뜨는을 제거합니다. 5 mL의 ACK 용해 완충액을 첨가하고 완만하게 RT에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이, 세포 펠렛을 재현 탁.
2. 패를 끄다칼슘 및 마그네슘없이 30 ㎖ 차가운 HBSS를 첨가하여이 Analysis.
3. 5 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 원심 분리기.

7. 초기 문화의 유지 보수

1. 성장 인자 따뜻한 완전한 TSM 15 mL의 트리 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생존 세포 밀도를 정량화 - 10 최종 세포 펠렛을 재현 탁.
   참고 : 가능한 세포의 범위는 광범위하게 조직 기증의 상황에 따라 달라집니다 및 정량 인해 남은 세포 파편이 초기 단계에서 어려울 수 있습니다. 이상적인 경우, 샘플 당 백만 살아있는 세포를 가지고하는 것을 목표로하고 있습니다. 과도한 파편은 T175 플라스크에 낮은 밀도로 남아 플레이트의 경우.
2. 새로운 T75 문화 플라스크에 최종 세포 현탁액을 전송합니다. 추가적인 성장 인자 스파이크 전반적인 성장 인자 수준을 유지하고, 종양 세포의 발달 neurosphere를 모니터링하는 격일는 (도 1E 및도 2 참조).
3. 또한, 유동 세포 계측법 및 형광 활성화 셀 정렬을 포함하여 추가 분석을위한 공정 효소 해리 세포.
4. (평균 3 얻어 - 4 주되지만, 최대 2 개월 며칠 범위) neurosphere를 개발 한 결과, 이물질의 양을 감소시키기 위해 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터를 사용하여 샘플 필터 역방향.
   주 : 여과 액을 실행 가능한 단일 세포 또는 작은 구체가 존재하는 경우에 문화에서 유지되어야한다.
5. 초기 환자 샘플을 비교, 계대 동안 DNA 지문을 수행하여 문화의 무결성과 순도를 확인합니다.

결과

기술 된 프로토콜은도 1의 공정의 다양한 단계에서의 조직의 이미지와 함께 5 단계 흐름과 같이 요약된다. 샘플은 제 빠르게 멸균 부검을 통해 얻어진다. 시료로부터 혈관 수막을 제거하면서 기계적 해리 동안 조직 다진되고, 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터로 여과 하였다. 남은 조직 절편은 효소 온난화 오븐에서 분해된다. 다음으로, 파편 시료로부터 수초의 뚜렷한 층을 분리, 수 크로스 구배 원심 분리를 통해 감소된다. 또한, ACK 용해 가시적 샘플에 존재 적혈구의 양을 감소시킨다. 마지막으로, 세포를 성장 인자로 보충 된 무 혈청 배지에서 도금된다.

도 1은 기업 부검시에 종양의 일례이다. 종양은 뇌교의의 확산 침투로 성장뇌간의 D 인접 지역. 샘플 준비하는 동안, 작은 ~ 1cm X 1cm 덩어리 절단해야합니다 즉시 얼음에 차가운 배송 미디어에 배치.

그림 2는 샘플 내구성 문화 배양의 초기 단계에서 나타날 수있는 방법을 다양한 예를 보여줍니다. 처음에 도금 및 초기 문화 (A, B)는 종종 많은 생존 세포를 포함하는 표시되지 않습니다. 또한, 초기 셀 클러스터 (C, D)는 종종 neurosphere를 통상과 관련된 대조도를 나타내지 않는다. 특히, 문화의 이전 셀 클러스터의 모습에 시간의 기간은 몇 개월 주가 걸릴 수 있습니다. 그러나, 셀의 클러스터 역방향 필터링과 함께 이러한 셀 클러스터의 초기 통로, 구체 (F)을 형성 할 수있는 건강 종양 세포를 분리 할 수있다. 여과 액 (E)는 일반적으로 남은 파편을 포함, 그러나 도금하고, 여과 액을 유지하고 모니터링을 권장 셀 클러스터의 개발. 이러한 환자 유래의 시료는 다음 배수 통로 (G, H)에 대한 배양 유지할 수있다.

도 3은 마우스에 이종 이식 될 이들 세포의 기능을 설명한다. 각 경우에서, DIPG 세포 생물 발광 (A)를 통해 종양의 발전을 모니터 할 GFP - 루시퍼 라제 리포터와 함께 형질 감염시켰다. 종양은 종양 생착 (B) 또는 특정 마커 (C)의 발현을 관찰하기 위해, 예를 들어, 조직 학적으로 관찰 할 수있다. 시험 관내 분석법 조합이 생체 내 모델은 다양한 약물 또는 유전자 조작의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다 (예를 들어, ^{8, 9, 10, 11, 14).}

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가공의 여러 단계에서 그림 1. 조직 샘플. (A) 무균 부검 절차 및 젖은 얼음에 야간 배송을 통해 샘플을 가져옵니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 (B) (행 1) 배송 미디어 종양 조직을 포함하는 튜브; 100mm X 20mm 세포 배양 접시에 신선한 조직; 조직의 초기 닦지; (행 2) 부분적으로 다진 조직; 수막 혈관의 제거; 다진 조직 조각의 최종 크기. 왼쪽에서 오른쪽으로 (C) (1 행)은 37 ° C의 오븐에서 회전 테이블 배양 조직; (행 2) 10 mL를 피펫에 부착 된 1000 μL 피펫 팁을 통해 조직의 분쇄; 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터를 통한 여과 해리 조직. 왼쪽에서 오른쪽으로 (D)는 : 조직 전에 원심 0.9 M 수크로오스 용액에 현탁 해리; 원심 분리 후, 자당 기울기를 통해 분리 해리 조직; 눈에 보이는 레이어 오자당 그라데이션의 상단에 f를 수초 파편; ACK 용해 및 세척 후 최종 세포 펠렛. (E) 최종 시료 배양에 배치 또는 다른 다운 스트림 분석에 사용될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

차 문화와 초기 통과 세포의 2. 이미지를 그림. (A - B) 문화가 (SU-DIPG-XXX, A) 분리 후 즉시 도금, 또는 아직 neurosphere를 재배하지 않은 (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) SU-DIPG-XXVIII (C)와 SU-DIPG-XXIX (D)의 차 문화 neurosphere를 초기 모습. Fi를 가진 (EF) 100 μm의 나일론 필터를 사용하여 D에서 차 문화의 제 1 통로,여액 (E) 및 역 여과 액 (F)는 도금. (G - H) 문화에서 성장 SU-DIPG-XXVII (G) 및 SU-DIPG-XXV (H)의 제 3 통로의 제 1 통로에서 성숙한 neurosphere를. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 환자 유래 세포 배양 생착 및 마우스의 양식 종양 수 있습니다. GFP - 루시 페라 제 기자로 형질 네 가지 환자 유래 세포 배양의 (A) 생물 발광 이미지. 마우스 뇌교에 접목 종양 세포를 나타내는 (B)는 마우스 이종 이식에서 시상 섹션. 녹색 : GFP, 빨간색 : 미엘린 염기성 단백질. 스케일 바 = 1mm. (C) 예 immunofluores마우스 뇌에서 GFP 접목 종양 세포를 나타내는 cence 이미지. 블루 : DAPI, 녹색 : GFP, 빨간색 : IGF2R. 스케일 바는 40 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 A 뇌교 종양의 1. 부검 샘플. 확산 고유 뇌교의 신경 교종의 즉각적인 사후 모습. 종양은 뇌교의 복부 표면에 큰, 수초 풍부한 대량으로 나타납니다. 이 이미지를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 생체 외 다양한이나 생체 내 실험에 사용할 수있는 환자 유래의 세포 배양을 개발하기 위해 사후 종양 조직 기부의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다. 때문에 부검 샘플 작업의 특성, 샘플 생존을 유지하는 것은 상당한 도전을 포즈. 부검 할 사후 변화 나 조직의 반송에 필요한 시간 등 여러 가지 요인은, 가능한 한 많이 최소화하지만, 종종 조절하기 어렵다한다. 우리의 경험 미만 (6)의 사후 변화에서 - (조직이 냉담한 배송 및 운송 매체에 배치되는 시간에 죽음의 시간)에서 8 시간 내구성 세포 배양을 확립하는 가장 좋은 기회를 산출했다. 그 후 24 시간 내에 실험실에서 조직을 수신하고, 수신시 바로 문화를 처리하는 것이 가장 좋습니다.

이러한 드문 경우의 위치는 매우 다양하기 때문에과티슈 검색 단계의 품질이 크게 성공 확률에 영향을 부검을 수행하는 물류가 어려울 수있다. 대부분의 경우 6-8 시간 기간을 달성하기 위해서는, 학술 중심 조직 수확을 실시 가능하지 않다. 대신, IRB 승인 프로토콜에 따라 장례식 집에서 종양 조직을 복구하는 통화 조직 복구 서비스를 갖는 종종 조직 복구를위한 더 많은 편법이다. 죽음의 사전 동의를 얻기 권장 및 물류 계획을 용이하게한다. 조직 검색 (장갑, 커튼, 메스)에 대한 명확하고 철저한 지침과 멸균 공급 장치 자체에 포함 된 부검 키트를 준비하는 것이 좋습니다. 또한, 조사, 병리학 및 장례식장의 사이에 의사 소통의 명확한 지점을 설정하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 조사 전에 부검의 병리학 자와 프로토콜을 논의하고 일반적인 오류를 강조한다. 이러한 오류는 마이크로 포함조직 검색, 하룻밤 / 신속한 배송 thermoinsulated 용기에 충분한 젖은 얼음 샘플을 제공하기 위해 실패를 통해 발송 실패시 BIAL 오염 (일반적으로 효모). 마지막으로, 반송 시간을 최소화하기 위해 샘플의 선적 호별 택배 서비스를 이용하여 추천한다.

치료는 세포 생존을 유지하는 조직 분해시주의해야한다. 예를 들어, 설계 매체의 사용은 전송을 위해 신경 조직의 건강을 유지하기 위해 (하이버 네이트-A는 보충 항진균제 / 항생제) 성공적인 배양을 발생 가능성을 증가시킬 것이다. 항상 얼음에 샘플을 전송하여 프로토콜 걸쳐 차가운 온도에서 샘플을 유지하는 것도 중요하다. 두 단계는 세포에 외상 한, 프로토콜의 성공을 향상시킬 수 있습니다 분쇄를 최소화과 함께 모두 기계 및 효소 분해 분획을 수집. 우리의 경험에서 가장 성공적인 문화는 모두 분수에서 성장하면서우리는 두 제제의 하나의 잠재적 이들 샘플 민감한 특성을 반영하는 영구 문화를 확립 경우가 있었다. 프로토콜의 또 다른 외상 단계는 분쇄입니다; 필요한 분쇄의 정도를 줄일 수있는 하나의 전략은 샘플을 철저히 준비의 시작에 다진되도록하는 것입니다. 샘플 가능성을 개선하도록 설계된 프로토콜의 양태의 다른 예는 효소 분해에 특히 중요하다 프로토콜에 걸쳐 (예를 들어, HEPES) 버퍼를 추가 포함한다.

상기 세포 생존을 증가시키기이 프로토콜의 가능한 변형은 ACK 적혈구 세포 용해 단계의 제거이다. 그러나,이 경우에는, 적혈구를 제거하기 위해 배양 초기 주 동안 ACK 용해 단계를 수행 한 다음 종종 필요하다. 수정 될 수도 프로토콜의 또 다른 목적은 수크로오스 densit를 사용 미엘린 및 세포 파편의 제거이며y를 그라디언트. 특히, 미세 아교 세포의 세포 생존율을 개선하는 것으로보고 된 다른 전략은 불연속 퍼콜 밀도 구배 ⁽¹⁸⁾ 또는 자기 미엘린 제거 비드,이 단계에서 또한 가능하다.

마지막으로, 초기 조직 분리 및 neurosphere를의 모양 사이의 기간은 샘플 사이에서 변화 한 달 이상 일주일이 걸릴 수 있습니다. 초기 배양은 일반적으로 죽은 세포 및 세포 파편 상당한 정도 포함하기 때문에, 생세포 남아 있는지 여부를 결정하기 어려울 수있다; 8주 (도 2) - 배양 적어도 4 유지되어야한다. 여기에 표시되는 남은 잔해에서 성장 세포를 분리하기위한 하나의 전략 (즉, 새로운 미디어에 세포 클러스터와 재 도금을 필터링 역). 문화를 계속 유지할지 여부에 대한 결정은 궁극적으로 일을 주변 요소에 따라 사례 별 결정이다전자 부검 (예를 들어, 장기간의 사후 변화, 조직 운송 중 문제), 조직 해리 (예를 들면, 과도한 혈액이나 파편)하는 방법과 샘플 문화에 나타납니다. 문화가 확립되면, 신원이 목적을 위해 유지 원래 종양의 샘플에 문화를 비교, 짧은 탠덤 반복 분석 또는 유사한 방법을 사용하여 DNA 지문에 의해 검증되어야한다. 6개월 - 우리는 정기적으로 매 3 예를 들어, 다른 문화에 의해 더 오염이 발생하지 않았는지 확인하기 위해 DNA 지문에 의해 문화를 확인하는 것이 좋습니다.

이러한 환자 유래 DIPG 문화의 생성은 효과적인 치료의 성공적인 개발에 중요한 단계를 나타냅니다. 가능한 환자 유래 DIPG의 문화와 이종 이식 모델의 확장은 가장 효과적인 치료 전략을 파악하고 궁극적으로이 파괴적인 질병을 극복에 중요하다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hibernate-A	Gibco	A12475-01
HBSS with Calcium/Magnesium	Gibco	24020-117
HBSS	Corning	21-022-CV
HEPES	Gibco	15630-080
Liberase DH (Collagenase/Dispase)	Roche	5401054001
DNAse I	Worthington Biochemical	LS002007
Sucrose	Sigma	S0389
Antibiotic/Antimycotic	Gibco	15240-096
Neurobasal-A	Gibco	10888-022
DMEM/F12	Gibco	11330-032
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
B27 Supplement Minus Vitamin A	Gibco	12587-010
MEM Non-Essential Amino Acids (100x)	Gibco	11140-050
Human PDGF-AA	Shenandoah Biotechnology	100-16
Human PDGF-BB	Shenandoah Biotechnology	100-18
Human EGF	Shenandoah Biotechnology	100-26
Human FGF	Shenandoah Biotechnology	100-146
Sterile scalpel blades	Bard Paker	372610
Curved hemostats	Fine Science Tools	13013-14
Razor blades	VWR	55411-050
100 x 20 mm cell culture dish	Corning	353003
Sterile forceps	TWD Tradewinds	DF8988-5
Sterile drapes	3M	2037
Sterile gloves	Kimberly Clark	1182307
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
100 micron mesh filter	Fisher	352360
50 mL conical tube	Fisher	1495949A