JoVE Logo
저자
연락처

로그인

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

초록

탄성 하이드로 겔 표면에 생체 분자의 접촉 인쇄 조합으로 구성 미세 세포 마이크로 어레이, 세포 분화에 배열 생화학 적 신호의 영향을 측정하기 위해 엄격하게 제어되는 높은 처리량 설계 시스템을 제공한다. 세포 마이크로 어레이를 사용하는 최근의 노력은 많은 미세 환경 요인이 병렬로 제공되는 조합 연구에 대한 자신의 유틸리티를 증명하고있다. 그러나, 이러한 노력은 세포 반응의 생화학 적 큐의 효과를 조사에 주로 초점을 맞추고있다. 여기서는 견인력 현미경 면역 및 생체 역학적 세포 기질 상호 작용에 의해 두 세포 분화를 평가하기 위해 가변 파장 재료 특성을 갖는 세포 마이크로 어레이 플랫폼을 제시한다. 이를 위해, 우리는 하나 현미경 슬라이드 또는 유리 바닥 배양 접시에 제작 된 탄성 계수 변화의 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔을 이용하여 두 개의 서로 다른 형식을 개발했습니다. 우리는 BES를 제공이러한 하이드로 겔 기판에 마이크로 어레이의 제조, 마이크로 어레이에 후속 세포 배양 및 데이터의 수집을위한 t 관행 및 문제 해결. 이 플랫폼이되는 생화학 적 (예, 세포 외 매트릭스 성분) 모두 및 생물 물리학에 대한 (예를 들면, 기판의 강성) 큐 역할 교차 상당한 재생할 수 생물학적 과정 연구에 사용하기 위해 적합하다.

서문

세포와 주변의 미세 환경 요인 사이의 상호 작용은 개발, 항상성 및 질병 병인 1, 2, 3, 4에 걸쳐 생물학적 과정의 많은 다양한 중재. 이러한 미세 환경의 상호 작용은 결합 리간드 - 수용체를 통해 세포 용해 인자의 전달, 바인딩 셀 매트릭스 및 세포 - 세포 상호 작용을 포함한다. 상기 생화학 적 고려 사항에 더하여, 예컨대, 기판의 기계적 성질 등의 생물 리 학적 매개 변수 (예, 영률, 기공율)과 셀 형상 및 관련 하류 mechanotransduction 점점 세포 분화 5, 6, 7, 8의 중요한 매개체로서 인식을 얻고, 9 10. 이러한 미세 환경의 상호 작용으로 인한 신호는 유전자 네트워크 및 신호 경로에 대한 입력으로서 역할을한다. 또한, 이러한 세포 고유의 구성 요소는 세포 고유의 유전 적 프로그램과 세포 외부 미세 환경 요인 5, 11, 12 사이의 복잡한 공동 규제 루프를 완료 분비 요인과 행렬 분해 효소를 통해 미세 환경에 대한 피드백을 제공합니다.

미세 환경 요소의 조절 프레젠테이션 설계 시스템의 사용은 다른 컨텍스트 13, 14, 15의 범위에 유용한 입증되었다. 특히 미세 가공 시스템은, 소형화 (13)을 통해 단백질 및 세포뿐만 아니라 고도의 병렬화 분석 정확한 공간적 패턴을 용이 한 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 세포 마이크로 어레이는 생체 분자의 조합은 접촉 인쇄 탄성 폴리 아크릴 아미드 겔 기판 23, 24, 25로되어있는 하나의 미세 가공 시스템을 나타낸다. 세포 접착 성분 (즉, 기질 단백질)의 포함은 자주 면역 세포 형광 기자를 통해 다운 스트림 분석 뒤에 마이크로 어레이에 지속적인 세포 부착과 문화를 가능하게한다. 세포 마이크로 어레이 생산적 간세포 표현형 23, 26, 신경 전구 분화 27 mammar의 개선 된 이해를 달성 지향 된Y 전구 세포 운명 결정 (28), 배아 줄기 세포의 유지 / 분화 23, 29, 30, 폐암의 전이 (31) 및 흑색 종 (32)의 치료 반응. 최근 내배엽 스펙 33 간 선조 분화 34, 35, 폐 종양 세포의 약물 반응 (36)의 세포 외 기질 (ECM) 단백질 조성물의 역할을 규정하는 셀 마이크로 어레이의 사용을 증명하고있다. 이러한 작업에서는 어레이 플랫폼의 조합 기능을 확장 및 세포 외 기질 성분과 세포와 생체 역학 극한 신호의 교점을 탐구에 초점을 맞추고있다. 또, 능력 정량적 charac에 제공하기 위해 배열 플랫폼 생물 물리학 판독을 구현분화 세포의 수축력의 terize 역할은 (35)을 처리합니다. 이를 위해, 우리는 세포에서 생성 된 견인의 높은 처리량 평가를 가능하게 세포 마이크로 어레이와 견인 힘 현미경 (TFM)를 통합. TFM 세포에서 생성 된 견인력을 측정하기 위해 널리 이용되는 방법 및 조성물 및 로컬 미세 37, 38, 39, 40의 역학과 단일 세포 및 조직 수준 함수의 조정에 관한 중요한 통찰력을 제공했다. 따라서, 셀과 마이크로 어레이 TFM을 결합하는 중요한 생리 학적 관련성 생 물리적 파라미터를 측정하기위한 고 처리량 시스템을 제공한다.

여기에 설명 된 셀 마이크로 어레이 플랫폼은 네 개의 섹션으로 구성되어 폴리 아크릴 기판, 어레이, 세포 배양 분석법 및 판독의 가공 및 데이터 분석의 제조. 만나다처음 세 개의 실험 구역의 개략적 인 요약 그림 1; 면역 형광 데이터의 분석에 초점을 맞춘 마지막 부분의 개략적 인 요약 그림 2를 참조하십시오. 역학적 세포 - 기질 상호 작용의 연구에 세포 마이크로 어레이 플랫폼에 적응하기 위해, 우리는 웬 동부 알 당 동조 영률이지만 유사한 다공성 폴리 아크릴 기판을 사용했다. 41. 자신의 기판에 세포에 의해 가해지는 힘의 TFM 측정을 가능하게하기 위해, 우리는 자주 다른 그룹에 의해 이용 슬라이드 두꺼운 유리 현미경 이외에 유리 바닥 페트리 접시 형식을 구현했습니다. 따라서,이 세포 마이크로 어레이 플랫폼은 별도의 유리 - 바닥 접시에 TFM 통해 현미경 슬라이드 및 셀에서 생성 된 힘에 대한 면역 세포 분화를 통해 병렬 측정 할 수있다. 우리는 또한 일반적으로 세포 마이크로 어레이에 사용 된 분석 방법에 몇 가지 개선 사항을 적용했습니다. SpecificalLY 대신 전체 섬 강도의 파라 메트릭 Z 점수를, 우리는 단일 셀의 강도를 측정 및 비 정규 분포를 설명하고 더 정확하게 세포의 동작을 설명하기 위해 분위수 정상화를 적용합니다. 우리는 이러한 개선은 생화학 및 생물 물리학 모두 단서가 중요한, 교차 역할을하는 생물학적 과정의 조사에 대한 특정 유틸리티를 제공 믿습니다. 또한, 우리의 분석 개선은 단일 셀과 인구 수준의 문제가 발산되는 세포 기능의 범위의 연구와 세포 마이크로 어레이의 적용을 가능하게한다.

프로토콜

폴리 아크릴 아미드 기판의 1. 제작

  1. 청소 유리 기판 - 세포 배양시 최적의 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔 제조 및 무결성을 보장하기 위해 - 엔드 포인트 면역 형광 또는 유리 바닥 TFM을위한 35mm 배양 접시의 표준 현미경 슬라이드 중 하나. 대안 적으로, 사용 된 유리 기판을 미리 세척.
    1. 트리톤 X-100 증류수 (DH 2 O) V / 0.25 %의 절에서 유리 기판을 담가. 30 분 동안 궤도 통에 기판을 놓습니다.
    2. 트리톤 X-100 용액을 제거하고 기판을 30 분 동안 궤도 통에 최종 헹굼과 장소에 몰입 DH 2 O. 휴가 기판과 5 번 헹군다.
    3. DH 2 O를 제거하고 아세톤에 기판을 담그지. 30 분 동안 궤도 통에 기판을 놓습니다.
    4. 아세톤을 제거하고 메탄올에 기판을 담그지. 30 분 동안 궤도 통에 기판을 놓습니다.
    5. 메탄올을 제거하고 2 O. 담가의 0.05 N 수산화 나트륨의 기판과 장소.
      주의 : 수산화 나트륨이 높은 가성과 피부에 심한 화상과 눈에 손상을 일으킬 수 있습니다. 보호 장갑, 의류, 눈 보호구를 착용 할 것.
    6. NaOH 용액을 제거하고 기판을 건조하고 건조 될 때까지 핫 플레이트에서 110 ° C에서 구워 기판에게 DH 2 O를 사용하여 필터링 된 압축 공기와 5 번 씻어 (5-15 분). 기판 세정 무기한 실온에서 저장 될 수있다.
  2. 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 부착을 보장하기 위해 깨끗한 유리 기판 silanization합니다.
    1. 에탄올 중의 갓 제조 된 2 % V / V를 3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필 메타 크릴 레이트 (3-TPM) 깨끗한 유리 기판을 담근다. 30 분 동안 궤도 통에 기판을 놓습니다.
      주의 : 3 TPM은 가연성 액체이다. 열, 스파크, 화염, 뜨거운 표면에서 멀리 유지하고 화학 흄 후드 만 사용합니다.
    2. 3-TPM 솔루션을 제거하고 etha에서 기판을 담그지NOL. 5 분 동안 궤도 통에 기판을 놓습니다.
    3. (- 15 분 5) 기판을 건조하고 건조 될 때까지 핫 플레이트에서 110 ° C에서 구워 여과 압축 공기를 사용합니다. 실란 화 된 기판을 1 개월까지 실온에서 저장 될 수있다.
  3. 옵션 1 : 엔드 포인트 면역에 대한 실란 화 현미경 슬라이드에서 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔을 제조.
    1. DH의 예비 중합체 용액을 제조 2-4 kPa로 (4 % 아크릴 아미드 0.4 % 비스 아크릴 아미드), 13 kPa의 (6 % 아크릴 아미드, 0.45 영률로 기판을 제조하기 원하는 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 비율 (w / v)의 비율 O 웬 외 당 % 비스 아크릴 아미드), 30 kPa로 (8 %의 아크릴 아미드, 0.55 % 비스 아크릴 아미드) 및 유사한 다공성. 41. 0.2 μm의 주사기와 소용돌이 명확 때까지 솔루션 및 필터. 예비 중합체 용액을 3 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
      주의 : 아크릴 아미드 또는 비스 아크릴 아미드에 노출 neurot, 급성 독성이 발생할 수 있습니다oxicity, 자극. 보호 장갑, 의류, 눈 보호구를 착용 할 것.
    2. 메탄올 / 큐어 V 2,959w 20 %의 광개시제 솔루션을 준비합니다. 이 광중합 개시제 용액을 저장할 수없는 신선한마다 준비한다.
    3. 1 (예비 중합체 : 광개시제) 비율 9에 예비 중합체 및 개시제 용액을 혼합한다. 15 분간 거품을 제거하기위한 진공 챔버와 선택적으로 탈기.
    4. 유리 건조 트레이에 실란 화 슬라이드를 놓고 9의 100 μL 피펫 : 1 사전 폴리머 : 각 슬라이드에 광개시제 솔루션을. 거품의 생성을 피하면서 부드럽게 22 × 60mm의 coverslip에 각 슬라이드 커버. 커버 슬립 산소에 의한 중합 반응의 억제를 방지합니다.
    5. 장소 건조 자외선 가교제의 트레이와 10 분 (4 승 /의 평방 미터) 365 nm의 자외선 A와 슬라이드를 노출합니다. 필요에 따라, 중합 시간을 최적화. 이상으로 인해 overpolymerization에 커버 슬립을 제거하는 위험 어려움을 노출을 사용합니다. 짧은 노출은 r에ISK의 underpolymerization 낮은 하이드로 겔 안정성.
    6. 5 분 동안 DH 2 O에서 하이드로 겔을 담가. 중합 된 하이드로 겔이 손상되지 않도록주의하면서 면도칼로 된 커버를 제거합니다.
    7. DH 2 O 매일을 변경, 3 일 - 1 실온에서 DH 2 O에서 하이드로 겔을 둡니다. 최대 3 개월 동안 상온에서 - (30 분, 15) 및 저장 건조까지 핫 플레이트상에서 50 ℃에서 하이드로 겔을 탈수.
  4. 옵션 2 : TFM을 사용하여 세포 - 기질 상호 작용의 실시간 평가 실란 화 35mm의 유리 바닥 배양 접시에 형광 비드 함유 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제조.
    1. 15 분 응집물을 분산 된 1 ㎛의 형광 비드 원액 초음파 처리.
    2. DH의 예비 중합체 용액을 제조 2-4 kPa로 (4 % 아크릴 아미드 0.4 % 비스 아크릴 아미드), 13 kPa의 (6 % 아크릴 아미드, 0의 영률로 기판을 제조하기 원하는 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 비율 (w / v)의 비율 O웬 외 당 0.45 % 비스 아크릴 아미드), 30 kPa로 (8 %의 아크릴 아미드, 0.55 % 비스 아크릴 아미드) 및 유사한 다공성. 41. 0.2 μm의 주사기와 소용돌이 명확 때까지 솔루션 및 필터. 예비 중합체 용액을 3 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
      주의 : 아크릴 아미드 또는 비스 아크릴 아미드에 노출되면 급성 독성, 신경 독성, 자극이 발생할 수 있습니다. 보호 장갑, 의류, 눈 보호구를 착용 할 것.
    3. 0.2 % V / V와 혼합하는 와류의 최종 농도 예비 중합체 용액에 형광 비드를 추가한다.
    4. 메탄올 / 큐어 V 2,959w 20 %의 광개시제 솔루션을 준비합니다. 이 광중합 개시제 용액을 저장할 수없는 신선한마다 준비한다.
    5. 1 (예비 중합체 / 비드 : 광개시제) 비율 9에 예비 중합체 / 비드와 광개시제 용액을 혼합한다. 15 분간 거품을 제거하기위한 진공 챔버와 선택적으로 탈기.
    6. 유리 건조 트레이 및 P로 실란 화 35mm의 유리 바닥 배양 접시를 놓습니다9 IPET 20 μL : 1 사전 폴리머 / 비드 : 각 요리의 중심 위에 광개시제 솔루션입니다. 거품의 생성을 피하면서 부드럽게 12mm 원형 coverslip에 각 슬라이드 커버. 커버 슬립 산소에 의한 중합 반응의 억제를 방지합니다.
    7. 하이드로 겔의 표면에 형광 비드를 분산하기 위하여, 요리를 반전하고 놀 등 당 20 분 동안 실온에서 떠난다. 42.
    8. 아직 반전하는 동안, 10 분 (4 승 /의 평방 미터) 365 nm의 자외선 A와 요리를 노출합니다. 필요에 따라, 중합 시간을 최적화. 이상으로 인해 overpolymerization에 커버 슬립을 제거하는 위험 어려움을 노출을 사용합니다. 짧은 노출 위험 underpolymerization 낮은 하이드로 겔 안정성.
    9. 0.1 M 4- (2- 히드 록시 에틸) 하이드로 겔에 담가 -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액 어두운 밤새 실온에서 떠난다. 돌보는, 면도칼로 조심스럽게 된 커버를 제거 polyme 손상되지 않도록음 공인 된 하이드로 겔.
    10. (- 30 분 15) 건조 될 때까지 핫 플레이트에 50 ° C에서 하이드로 겔을 탈수. 하이드로 겔을 3 개월 동안 어둠 속에서 실온에서 저장 될 수있다.

배열의 2 제작

  1. 생체 분자를 인쇄하는 버퍼를 준비합니다. 관심의 생체 분자에 적합한 인쇄 버퍼를 사용합니다. 성장 인자 (GF) 인쇄 버퍼는 세포 - 세포 리간드와 같은 분자의 다른 클래스에 대해 대체로 적절하다.
    1. 아세트산 나트륨 164 mg을 6 mL의 DH 2 O. 와류 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 37.2 ㎎을 첨가하고 잘 용해하도록 37 ° C 부화 2 × ECM 단백질 인쇄 버퍼를 제조 하였다. 가용화 한 후, 미리 예열 트리톤 X-100의 50 μL와 글리세롤 4 mL를 넣어. 소용돌이 및 용해 다시 37 ° C에서 품어. 4.8로 pH를 조정하기 위해 적정 빙초산 80 μL - 40을 추가한다. 2 × ECM 단백질 출력 버퍼 (4)에 저장 될 수있다1 개월 C를 °.
      주의 : 아세트산 인화성 및 부식성. 보호 장갑, 의류, 눈 보호구를 착용 할 것.
    2. 2 × GF 인쇄 버퍼를 준비 6 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)로 105.5 mg을 아세트산 나트륨 37.2 mg을 EDTA를 추가한다. 소용돌이와는 완전히 용해하기 위해 37 ° C에서 품어. 글리세롤의 [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 설포 네이트 (CHAPS) 4 mL의 - 가용화 한 후, 100 mg의 3을 추가합니다. 2 × GF 단백질 인쇄 버퍼는 1 개월, 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  2. 소스 플레이트를 준비합니다.
    1. 384 웰 V 바닥 마이크로 플레이트에서 두 번 목표 농도에서 각각의 생체 분자 용액으로 2 × 인쇄 버퍼의 동일한 볼륨을 결합한다.
      주 : 배열 요소의 다른 종류의 목표 농도는 하이드로 겔 및 생물학적 기능의 유지에 따라 다르지만 일반적인 ECM 단백질에 대한 적절한 목표 농도 250 μg의 / ㎖이다. 각 웰의 총 부피가 될 수등 5 μL 낮은 및 필요하지 이상 15 μL합니다. 관심의 생체 분자의 조합에 더하여, 다운 스트림 이미지 분석을 용이하게하는 순서로 배열 된 형광 마커를 포함한다. 로다 민 접합 된 덱스 트란 (2.5 ㎎ / ㎖)를 사용합니다.
    2. 거품을 생성 않도록주의하면서, 피펫으로 잘 철저하게 각을 섞는다. 100 × g에서 1 분간 소스 마이크로 원심 분리기. 소스 접시 같은 날 제조 및 마이크로 어레이 제조 할 때까지 4 ℃에서 보관을 사용하여 마이크로 어레이를 제작.
  3. 각각의 마이크로 어레이 제조 실행하기 전에 제조자의 지시에 따라 청소 핀. 직접 미세 배열의 프린트 헤드에 깨끗한 핀을 넣습니다.
  4. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 미세 배열 및 프로그램을 준비합니다. 다음 단계는 현재 사용되는 특정 미세 배열에 부분적으로 고유하지만 대부분 microarrayers의 동작과 유사하다.
    1. , 가습 장치를 켜십시오 (65 % RH 비 세트 포인트를 조정레오 미터가 설정 값과 일치 할 때까지 -condensing)를 기다립니다. 적절한 어댑터에 소스 판을 놓습니다.
    2. 15 분 동안 50 ℃에서 하이드로 겔 기재 탈수 및 해당 어댑터에 배치했다. 미세 배열은 현미경 슬라이드와 마이크로 모두를위한 어댑터가 있습니다. 35mm의 유리 바닥 배양 접시를으로 배열를 들어, 6 웰 마이크로 플레이트에 요리를로드하고 Arrayer에의 마이크로 어댑터에 마이크로 놓습니다.
    3. 정확하게 (35mm 페트리 접시를 포함한 예 현미경 슬라이드 또는 마이크로) 소스 플레이트, 어레이 설계 및 원하는 형식의 레이아웃을 반영하는 프로그램의 파라미터를 조정한다. 이월과 교차 오염을 방지하기 위해 각 상태 사이 모두 물과 디메틸 술폭 시드 (DMSO)를 사용하여 세척 단계를 포함한다.
    4. 습도가 65 % RH (비 응축) 아래로 떨어되지 않은 한 시간보다 및 핀이 막혀 있지 않은지 더 자주 확인하지 어레이 제조를 시작합니다. 습도 경우dity는 가습기를 작성하고 응축의 연결 관을 취소으로 배열 일시 중지, 예기치 않게 떨어졌다. 핀이 막힌 경우, 핀을 청소하거나 사전 세정 핀 교체에 배열 일시. 충분한 건조 시간을 제공하는 동일한 기판 (즉, 4 시간에 밤새)에 생체 분자를 순차적으로 배열 복수 종류하는 것이 가능하다.
    5. 프로그램이 완료되면, 밤새 알루미늄 실온에서 박 및 65 % RH (비 응축)으로 덮여 슬라이드 상자 또는 마이크로에서 제조 배열을 배치합니다. 일반적인 단백질 얼룩 또는 면역 형광을 사용하여 배열 품질 유지를 평가할 필요가있을 수 있음에 유의 Brafman 등의 알을 참조하십시오. 자세한 내용은 25.

3. 세포 배양 및 분석 판독

  1. 제조 후 날, 4 챔버 요리 (현미경 슬라이드) 또는 6 웰 마이크로 플레이트 (배양 접시)에 배열 된 기판을 배치하고 1 %에 젖어PBS에서 v / V를 페니실린 / 스트렙토 마이신; 슬라이드 4 mL의 요리 3 용액을 사용한다. 30 분 동안 UV C에 노출. 교환 페니실린 / 세포 배양 미디어 스트렙토 마이신 솔루션입니다.
  2. 수집하고 세포를 계산합니다. 500 × 10 세에 배열 상 씨 - 현미경 슬라이드 당 4 mL의 35mm 페트리 접시 당 3 ㎖에서 2 × 10 6 세포 / 배열입니다. 24 시간 또는 잘 채워 세포 섬의 형성까지 - 2 CO 2를 37 ° C에서 배열 문화를 품어 5 %. 파종 밀도와 세포와 특정 응용 프로그램에 필요한 시간을 모두 조정합니다. (즉, 저밀도 또는 파종 시간) Underseeding하는 것은 좋지 배열 인구와 괴상한 생물 결과가 발생할 수 있습니다. (즉, 고밀도 또는 파종 시간) Overseeding은 감소 배열의 무결성에 의한 섬 분리에 발생할 수 있습니다.
  3. 미리 예열 세포 배양 배지로 두 번 배열 문화를 씻어 세포 섬의 형성을 가능하게 한 후, 다시 슬라이드와 요리 3 mL를 4 mL로 사용합니다. Optiona에서야 적절한 관리 및 치료, 생물학적 시스템의 관심 (예를 들어, 소분자 억제제, 성장 인자, 등)를 추가한다. 모든 치료의 농도를 유지하기 위하여 2 D - 어레이마다 하나의 미디어를 변경합니다. 배열 문화를 개시 5 D - 1 - 내 TFM에 의해 면역 형광 또는 세포 - 기질 상호 작용에 의해 세포 마커의 발현 및 세포 기능을 평가 옵션 1 아래 옵션 2를 참조하십시오.
  4. 옵션 1 : 엔드 포인트 면역을 수행합니다. 일부 단백질의 면역 형광은 메탄올, 에탄올, 또는 염산을 사용하여 더 엄격한 permeabilization 필요할 수 있습니다. 때문에 배열에 대한 잠재적 손상을 평가하고 더 큰 규모의 실험에 사용하기 전에 각 permeabilization 프로토콜을 최적화 할 수 있습니다.
    1. 흡인 세포 배양 4 챔버 요리의 배열 슬라이드에서 미디어와 갓 준비한 4 % V의 4 ㎖ / 슬라이드를 추가 / V 파라 포름 알데히드 PBS에서 (PFA). 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
      주의 : 박람회PFA에 URE은 급성 독성이 발생할 수 있으며, 자극 또는 접촉에 피부를 부식 할 수 있습니다. 보호 장갑, 의류, 눈 보호구를 착용하고 화학 물질 흄 후드 만 사용합니다.
    2. 기음 PFA 솔루션 및 PBS 4 mL로 각 슬라이드를 3 회 반복한다. 이 때, 고정 된 슬라이드는 1 주간 4 ℃에서 저장 될 수있다. 이 배열의 무결성을 보장하기 위해 정착 immunolabeling와 같은 날에 장착을 계속하지만 바람직하다.
    3. 대기음 PBS와 PBS의 트리톤 X-100 V 0.25 % V의 4 ㎖ / 슬라이드 / 추가 할 수 있습니다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
    4. 기음 트리톤 X-100 용액은 PBS 4 mL로 각 슬라이드를 3 회 반복한다. 이차 항체의 종류에 일치하는 5 % v / V를 혈청 4 mL의 / 슬라이드를 추가 (예를 들어, 당나귀 당나귀 차 항체에 대한 혈청) PBS에서 1 시간 동안 실온에서 품어.
    5. 철저하게 각 슬라이드에서 차단 솔루션을 제거합니다. PBS에 5 % v / V를 혈청 희석 차 항체의 500 μL / 슬라이드 추가. 이 볼륨은 39 ° C에서 실온에서 두 시간 배양 한 대 배열과 밤새 배양을 커버하기에 충분하다.
    6. PBS 4 mL로 각 배열 슬라이드 3 회 반복한다. 철저히 최종 세척을 제거하고 PBS에 5 % v / V를 혈청 희석 적절한 보조 항체의 500 μL / 슬라이드를 추가합니다.
    7. PBS 4 mL로 각 배열 슬라이드 3 회 반복한다. 조심스럽게 솔루션을 사용하여 집게에서 배열 슬라이드를 제거하기 전에 DH 2 O로 간단히 세척 할 것. O. 심지 또는 건식 잔류 DH (2) 실험실의 조직을 사용하여
    8. 시각적으로 전체 배열의 전체 범위를 확인하면서 슬라이드에서 DAPI와 솔루션을 장착 피펫 100 μL.
    9. 마운트 슬라이드를 통해 22 × 60mm의 coverslip에 배치합니다. 명확한 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 더 이전 다음 날보다 영상까지 4 ° C에서 어둠 속에서 보관하십시오.
    10. 마이크로 어레이 스캐너 또는 거꾸로 형광 현미경 equipp를 사용하여 이미지 전체 배열로봇 스테이지 에드. 마이크로 어레이 스캐너는 빠른 판독을 제공하지만 Cy3- 또는 Cy5에 호환 형광 필요할 수 있습니다 및 단일 세포의 순서에 종종 제한된 해상도 (즉, 1-10 μm의). 형광 현미경, 형광 다양한 채널을 사용하는 옵션 및 더 높은 해상도 (<1 ㎛ ~ 100 × 종합 배율)를 제공하지만, 로봇 스테이지 배율 / 대물 품질에 따라 느리게 판독을 제공한다.
    11. 저장 (예를 들면, JPG) 다른 파일 포맷과 관련된 데이터 압축 또는 손실을 방지하기 위해 TIFF 파일 등의 방법 중 하나에서 전체 어레이의 이미지를 캡쳐.
  5. 옵션 2 : TFM을 사용하여 세포 - 기질 상호 작용의 실시간 평가를 수행합니다.
    1. TFM 동안 기판으로부터 세포를 해리하는 1 % V / V를 소 혈청 알부민 (BSA), 1 %의 V / V PBS에서 도데 실 황산나트륨 (SDS)의 용액을 준비한다.
    2. 에 배열 문화를 포함 35mm 배양 접시를 이동배양 (37 ° C, 5 % CO 2), TFM 측정을위한 로봇 스테이지 거꾸로 형광 현미경.
      1. 한 접시에 비행기를 위치를 (X 좌표 Y 좌표) 표시하고 초점 위상차 현미경을 사용하여 개별 셀의 섬 (Z는 좌표).
      2. 구슬을 시각화까지 적색 형광 현미경으로 전환합니다. 이전 단계에서 저장된 각각의 위치로 돌아가서 셀 섬 아래 비드의 첫 번째 층에 포커스되도록 초점 평면의 Z 좌표를 수정한다. 새로운 좌표를 저장하고 미리 해리 위상차 멀리 붉은 형광 이미지를 캡처하는 모든 세포 섬의 자동화 된 이미지로 이동합니다.
    3. 조심스럽게 접시에 BSA / SDS 용액 150 μL를 추가하고 기판에서 완전한 세포 분리 수 있도록 5 분을 기다립니다; 위상차 현미경을 사용하여 세포 분리를 모니터링 할 수 있습니다.
    4. 셀 제도 기판에서 분해 된 후, T로 돌아그는 위치를 표시하고 구슬의 제 1 층에 초점이 여전히 있는지 확인합니다. 이러한 비드의 평면 인해 셀에서 생성 된 마찰력에 의해 유도 된 변형이라면, 그들은 다시 포커스되도록 상기 초점 평면의 Z 좌표를 수정한다. 수정 Z 좌표를 저장 한 후 해리까지 적색 형광 이미지를 캡처하기 위해 모든 섬의 자동화 된 이미지를 반복합니다.
    5. 나머지 요리 3.5.4 - 반복 3.5.1 단계.

데이터 4. 분석

  1. 면역 데이터 분석.
    1. 프로세스 배열 이미지를 인수했다. (즉, 적색, 청색 또는 녹색) 개별 채널을 포함하는 파일에 복합 배열 이미지를 분할 및 8 비트 TIFF 이미지 (43), (44)을 변환합니다. 비닝 (binning)을 적용 (예를 들어, 2 × 2, 4 × 4) ~ 채널 당 32 메가 픽셀이 enti의 하류 단일 세포 분석 중에 메모리 요구 사항을 줄이기 위해 이미지 크기를 줄이기 위해어레이 이미지를 재. 이러한 배열 처리 단계의 ImageJ에 매크로 구현은 "array_processing.ijm"라는 제목 보충 코드 파일을 참조하십시오.
    2. 왼쪽 위, 왼쪽 아래 및 오른쪽 아래 로다 민 - 복합 덱스 트란 마커 또는 배열 조건의 픽셀 좌표를합니다. 8 비트 TIFF 이미지 회전이 좌표를 사용하여 완벽하게 수직으로하고, 이후, 특정 배열 조건 단일 세포 분석에서 출력 주석. 회전 단계를 리딩이 배열의 구현을위한 기업 코드 파일 제목 "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm"및 "array_gridding.ijm"를 참조하십시오.
    3. IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects 및 MeasureObjectIntensity : 비닝의 단일 세포 분석을 수행, 다음과 같은 모듈을 사용하여 CellProfiler에 (버전 2.1.1) 45 8 비트 TIFF 이미지를 회전. IdentifyPrimaryObjects는 IdentifySecond를 핵을 식별aryObjects 각 세포핵과 관련된 immunolabels를 식별하고, MeasureObjectIntensity 핵 라벨 및 immunolabels 모두 정량화를 제공합니다.
      1. ExportToSpreadsheet 모듈을 이용하여 채널 CSV 파일과 같은 세 가지 모듈로부터 출력 된 단일 셀 데이터는 이후 하위 분석을 용이하게한다. 적색, 녹색, 청색 채널을 포함하는 이미지 세트에 대해 이러한 단계를 구현 CellProfiler 파이프 라인에 대한 보충 코드 파일 제목 "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe"및 "rgb_array_image_analysis.cppipe"를 참조하십시오.
    4. 실험 변동성과 비 가우시안 단일 셀 분포를 고려하여 데이터를 변환하기 위해, 생물 복제 (46)에 의해 분위수 정상화를 적용합니다. 이 과정은 복제를 통해 공유 배포를 생성하고 immunolabel 강도의 변화의 공정한 비교를 할 수 있습니다. 또한, UNL이케의 Z-점수 및 기타 파라 메트릭 방법, 분위수 정상화가 아닌 파라 메트릭과 대표성을 허용, 특정 데이터 분포를 가정하지 않는 배열 조건의 함수로서 단일 셀 동작의 분석.
    5. 데이터를 플롯하고 해석한다. 생물학적 시스템 및 가정에 따라 계산하고, 각 배열 조건은 다음 앙상블 방법 중 하나 이상을 플롯 :
      1. 계산 및 실험에 걸쳐 부착 및 생존의 결합 수단으로 섬 세포 당 플롯.
      2. 계산하고 세포의 운명이나 기능의 척도로서 분위수 정규화 immunolabel 강도를 플롯.
      3. 통상 계산이 SD 음성 대조군의 평균 강도보다도 일정한 임계치보다 강도에 의해 결정된 바와 같이 immunolabel 양성 세포의 비율을 플롯.
      4. 또한, 순서 immunolabel 강도의 플롯 분포 조사 및 단일 셀 동작을 분류하기배열 된 상태의 함수로서. 이 배포판은 또한 중앙 경향 (평균, 중앙값, 모드)과 변화 (편차, 변동 계수, 파노 인자)와 같은 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트와 같은 가설 시험 방법의 조치를 사용하여 특징으로 할 수있다.
  2. TFM 데이터 분석. 여기 버틀러 등의 알에 의해 이전에 개발 된 알고리즘을 구현하는 방법을 설명한다. 그리고 왕 등. 40, 47.
    1. 배치에 ImageJ에를 사용하여 8 비트 TIFF 파일에 이미지를 변환합니다. 픽셀 비닝 평균을 적용 (예를 들어, 2 × 2)가 하류 분석 계산 비용 및 시간을 감소시킨다. TFM위한 알고리즘은 대부분 단일 셀 분석, 단일 셀의 셀 기판 계면에 비해 섬 (~ 17.5 × 103 ㎛의 2)의 대형 셀 기판 계면 (75 ㎛의 2) necessi 집중함에tates 비닝 단계.
    2. 입력 캡처 위상차 및 MATLAB 및 프로세스 버틀러 등의 이전에 개발 된 알고리즘을 사용하는 등 과학적인 프로그래밍 환경으로 멀리 붉은 형광 이미지 (모두 사전 분리 및 사후 해리). 그리고 왕 등. 40, 47.
      1. 셀 섬에서 멀리 떨어진 세 지역을 선택합니다. 이 영역은 이미지 또는 샘플 드리프트에 의한 변위를 설명하는 데 사용됩니다.
      2. 마이크로 미터 (예를 들면, 0.454 픽셀 / μm의) 픽셀로 변환하는 계수를 제공하며, 상기 기판의 영률 (예컨대, 13 kPa의)과 포아송 비 (예를 들어, 여기에 설명 된 폴리 아크릴 아미드 겔에 대한 0.48).
      3. 각 섬 위해, 기하학적 제약 조건을 정의하는 둘레의 경계를 그릴; 이 경계 외부의 모든 힘은 제로되어있다. 이 제약 된 시스템은 큰 dista 주어진 합리적이다후부 섬 사이 (즉, 450 μm의).
    3. 각 섬의 제곱 평균 제곱근 견인 스트레스와 수축 모멘트를 계산합니다. 수축 모멘트 셀 섬 전체 잔류 응력의 측정은 세포 - 세포 상호 작용 (48)의 강도를 반영하는 것으로 나타났다. 각 배열 상태를 들면, 여러 섬과 생물 복제 및 계산을 통해 평균 제곱 평균 제곱근 값은 가설 테스트에 대한 분산을 관련. 이 섬의 중심으로부터 형상 함수, 예를 들면 거리가 모두 측정을 대표하는지도를 제공하기 위해 많은 섬 위에 응력이나 모멘트의 분포를 평균화 할 수있다.

결과

이 플랫폼을 사용하여, 우리는 간 선조 34, 35의 운명 사양 모두 생화학 및 생물 물리학 적 큐의 역할을 조사 하였다. 단백질 A / G 공역 노치 리간드가 폴리 아크릴 아미드 겔 (도 3A)에서 향상된 보존 및 클러스터링을 보여 담관 세포의 운명 (도 3b)를 향해 간 전구 세포의 분화를 구동 더욱이 능력이었다. 단일 세포 분석을 이용하여, 우리는 리간드 간 전구 세포의 반응은에 또한 의존한다는 것을 발견은 ECM 단백질 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 라미닌 (도 3C)에 대한 노치 리간드에 대한 반응을 정량화 ECM 컨텍스트. 마지막으로, 우리는 리간드 DLL1과 Jag1없이 간 전구 세포를 생성하는 shRNA를 최저를 이용했다. 배열 된 노치 리간드에 대한 반응은 PR에 따라 변하며어느 esence 리간드는 세포 - 외인성 리간드에 반응성이 세포 리간드 극한 표현 (도 3d)의 함수이기도 것을 확인. 또한, 우리는 이중 양성의 고유 한 하위 집단을 관찰 (ALB + / OPN +)를 DLL1 최저 (그림 3D) 세포. 함께, 이러한 대표적인 결과를 표시한다 : (1) 개인 리간드 최저 여러 배열 ECM 단백질 노치 리간드의 페어링에 의해 예시 된 바와 같이 어레이 형태의 조합 기능; (2)뿐만 아니라의 기능은 ECM 단백질 배열뿐만 아니라, 단백질 A / G 매개 결합을 통해 세포 - 세포 리간드 배열; 및 (3) 우리 단세포 분석하고 독특한 개체군을 식별 할 수있는 기능의 구현.

우리는 또한 간 전구 세포의 분화가 기판 강성 및 ECM 성분 (그림 4A 모두에 의존하는 것을 관찰 피브로넥틴은 딱딱한 기판 (그림 4B)의 분화를 지원하는 반면 옹>), 특히 그 콜라겐 IV를 찾는 것은 모두 부드럽고 딱딱한 기판에 분화 지원합니다. TFM 측정의 대표적인 히트 맵은 콜라겐 IV에 낮은 기판 강성에 지속적인 견인 스트레스 담관 세포 (그림 4C), 평균 제곱 평균 제곱근 값 (그림 4D)에 의해 확인 발견로의 분화를 촉진하는 것이 좋습니다. 함께, 이러한 대표적인 결과는 표시 (1) 가변 강성 기판 상에 마이크로 어레이와 셀 TFM의 성공적인 통합 세포 표현형 및 트랙션 응력 모두를 평가하는 단계; (2) 매트릭스 조성물과 기판 강성 모두 간 전구 세포 운명의 조정; (3) 세포 마이크로 어레이 우리의 TFM 분석 및 일반적인 견인 스트레스 프로파일의 구현입니다.

전자 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
그림 1 : 첫 번째 세 가지 실험 섹션보기 개요 도식. 제 1 절에서, 유리 기판 청소 및 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔의 제조를 용이하게하기 위해 실란 화된다. 섹션 2에서, 관심의 생체 분자의 조합은 384도 원 마이크로 제조된다. 로봇 Arrayer에 다음에 하이드로 어레이를 제조 깨끗 핀, 소스 마이크로 및 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔에 로딩되고 초기화된다. 제 3 항에있어서, 세포가 배열 된 영역에 시드와 명소 배양 프로토콜이 수행 된 후 부착 할 수있다. 엔드 포인트에서 세포 중 하나 TFM를 사용하여 면역 세포 / 면역 고정 또는 분석된다. 스케일 바는 75 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

= "1"> 페이지 내에서 figure-results-2241
그림 2 : 처리 및 배열에서 면역 형광 데이터의 분석. (A) 기와는 복합 32 비트 RGB 이미지는 제 비닝 후 개별 8 비트 채널로 분할된다. 배열 형광 마커와 세포 섬의 조합을 사용하여, 상기 어레이의 세 모서리가 자동 배향 및 배열 리딩 있도록 식별된다. (B) 단일 셀의 데이터는 입력 된 어레이의 각 채널에 대해 생성된다. 실험적 편차를 고려하기 위해 정규화 분위수 모든 복제에 걸쳐 단일 공유 분포를 생산 생물 복제에 적용된다. 분위수 정규화 된 데이터는 연속적으로 또는 단일 셀 분포를 직접 분석 (라벨 백분율 양성 세포의 강도를 의미하는, 예를 들면, 셀 / 섬) 플롯 앙상블 측정의 계산을 통해 해석된다.m / 파일 / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2871
그림 3 : 노치 리간드 프리젠 테이션에서 중재 간 전구 차별화. (A)는 노치 된 Fc 재조합 리간드 가변 -1- (JAG1) 델타 형 1 (DLL1)의 단백질 A / G로 배열 향상된 보존 및 클러스터링을 나타냈다. 스케일 바는 50 μm의입니다. (B) 간 선조는 노치 리간드을 제시 담관 세포를 분화. 4 ', 6- Diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 핵 라벨 알부민 (ALB)는 간세포 마커이며, 오스테 오 폰틴은 (OPN)는 담관 세포 마커이다. 스케일 바는 150 μm의입니다. (C)이 ECM 단백질의 노치 리간드 JAG1, DLL1, 델타 같은 4 (DLL4)를위한 OPN 양성 세포의 비율의 정량은 I를 콜라겐, Collagen III, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 라미닌. 학생의 t의 -tests은 P <0.05 (*)에 대한 표시 P-값으로 각 ECM 단백질 내의 각 배열 노치 리간드에 대한 제어 IgG에 대해 수행되었다. 노치 리간드 JAG1, DLL1 및 DLL4되게 콜라겐 III에 셀 ALB 및 OPN의 (D) 영상 세포 계측법. 노치없이 간 전구 세포는 DLL1과 Jag1 (즉, shDll1 및 shJag1가)의 shRNA 최저를 사용하여 생성 된 리간드. 평균은 ± SEM이 그림은 Kaylan 등에서 수정 된로 (C)의 데이터는 제시했다. 34. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3984
그림 4 : 매트릭스 구성 및 기판 강성 쿠간 전구 차별화를 rdinate. 덕트 세포를 담즙 (A) 간 전구 차별화 ECM 조성과 기판 강성 모두에 따라 달라집니다. DAPI는 ALB는 간 세포 마커이며, OPN은 담관 세포 마커 인 핵 라벨이다. (B) 탄성 계수의 기판 30 kPa로, 13 kPa로, 콜라겐 4 kPa의 I (C1), 콜라겐 IV (C4), 피브로넥틴 (FN), 그리고 모든 양방향 조합에 OPN 양성 세포의 비율의 정량 그 ECM 단백질. (C) 셀 견인 스트레스는 기판 강성과 ECM 성분 모두에 따라 달라집니다. (D)의 영률의 기판을 30 kPa로 콜라겐 4 kPa의 I (C1), 콜라겐 IV (C4), 피브로넥틴 (FN), 이들 모두 양방향 조합을 견인 응력 평균 제곱근 값 정량 ECM 단백질. (B) 및 (D)에서, 데이터는 SEM 및 스튜던트 t의 -tests 평균 ±로 표현 된P <0.05 (*), P <0.01 (**)에 대해 지시 된 P 값과 ECM 각 조합에 대해 30 kPa로 수행 하였다 P <0.001 (***). 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 이 그림은 Kourouklis 등에서 수정되었습니다. 35. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

섹션 문제 잠재적 원인 해결책
폴리 아크릴 아미드 기판의 1. 제작. 커브 글라스는 하이드로 겔에서 제거 할 수 없습니다. Overpolymerization. <십분 (4 승 /의 평방 미터)에 중합 시간을 줄일 수 있습니다. 그 자외선 crossli 확인nker 출력이 기대 범위 내에있다.
불량 폴리 아크릴 아미드 겔 중합. Underpolymerization. 중합 시간> 십분 (4 승 /의 평방 미터)에을 늘립니다. 그 UV 가교제 출력이 예상 범위 내에 확인하십시오.
폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔은 커브 글라스의 제거 후 손상됩니다. 소프트 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔은 손상하기 쉽다. 우리는 특히 (즉, 4 kPa의) 하이드로 겔 가장 부드러운위한 하이드로 겔 제조 수율 (~ 50 %) 감소 관찰합니다. 부드럽게 하이드로 겔을 처리하고 원하는 수율을 달성하기 위해 시작 번호를 증가시킨다.
배열의 2. 제조. 불량 또는 일치하지 않는 지점 형태. 일관성 가습기 기능. 그 가습기를 확인하고 각 인쇄 실행을 통해 기능을 레오 미터 및 65 % RH을 유지한다.
프린트 헤드 또는 막힘에 붙어 핀검정 고시. 무료 핀 운동을 허용하도록 프린트 헤드를 청소합니다. 완전히 전에 각 인쇄 실행 후 청소 핀은 핀 채널에서 집계를 제거합니다.
3. 세포 배양 및 분석 실행. 초기 부착 후 배열에 세포 분리 또는 사망. Overseeding 과도한 증식. 초기 시딩 밀도와 시간을 줄일 수 있습니다. 세포 증식을 감소시키기 위해 배열 문화 동안 "유지 보수"또는 "차별화"용지를 사용하십시오.
하이드로 겔에서 독성 아크릴 모노머의 릴리스. 아크릴 모노머의 확산 / 해제를 허용 세포 독성을 줄이기 위해 최소 3 일 동안 DH 2 O에서 하이드로 겔을 만끽 해보세요.
세포 배열에 연결하지 않습니다. Underseeding. 초기 시딩 밀도와 시간을 늘립니다. 더 강하게 부착 세포 유형을 사용합니다.
가난한 증착매트릭스 또는 생체 분자 상태. 입자 및 집계의 청소 핀, 인쇄 매개 변수를 확인하고, 형광 마커, 예를 들면, 로다 민 - 복합 덱스 트란의 얼룩을 평가한다.
세포 - 기질 상호 작용의 특이성. 다른 세포 유형의 일부가 아닌 다른 ECM 단백질에 특이 적 부착. 당신의 세포와 여러 다른 ECM 단백질을 테스트합니다.
제작 후 최적 어레이 스토리지. 우리는 동결 중에 상 변화를 방지하기 위해 부분적으로 65 % RH, 실온에서 밤새도록 제조 된 어레이를 저장 추천한다. 세포 접착 모두 습도, 온도, 저장 시간에 민감하다; 이러한 매개 변수는 실험을 위해 최적화 / 일치해야합니다.
세포 배양 동안 유리 기판으로부터 박리 하이드로 겔. 가난한 슬라이드 청소 및 실란 화. 슬라이드 청소 작업 솔루션을 교체하고실란 화.
Overdehydrated 하이드로 겔. 이상 15 ~ 30 분 동안 핫 플레이트에 탈수 하이드로 겔을 두지 마십시오.
데이터 4. 분석. 복제 관광 명소와 슬라이드 사이의 높은 변동성. 어레이 제조의 가변성. 핀과 프린트 헤드가 깨끗한 지 확인합니다. 가습기 기능을 확인합니다. 시각화 및 형광 마커를 사용하여 장소와 배열 품질을 정량화. 같은 저장소 배열은 위의 추천.

표 1 : 문제 해결.

토론

실험에서는 가장 일반적인 실패가 제조 어레이의 품질과 관련된 불완전하게 관심있는 생물학적 시스템에서의 반응을 특징으로하는 것을 발견 하였다. 우리는 세포 마이크로 어레이 실험의 일반적인 고장 모드 및 관련 문제 해결 단계 표 1에 독자를 참조하십시오. 특히 배열의 품질에 관해서는, 우리는 다음을 추천합니다. 이러한 로다 민 - 복합 덱스 트란과 같은 형광 표지 된 분자를 사용하는 프로그램, 매개 변수 및 버퍼으로 배열의 기술적 품질과 견고성을 확인합니다. 전이나 더 시각적으로 제조업체의 지침에 따라에 배열 이후 어느 철저히 핀은 핀 채널을 광학 현미경을 이용하여 이물질이 명확 있는지 확인합니다. 일반적으로 단백질 얼룩 또는 immunolabeling를 사용하여 배열 된 생체 분자의 보유를 확인합니다. 70 kDa의 아래 분자량 생체 분자가 자주 하이드로 겔 (23)에 유지되지 않습니다, SUP> 31. 여러 종류의 세포를 사용하여 배열 된 생체 분자 세포 기능을 확인합니다. 만 부착 세포 배열과 호환합니다; 또한, 배열에 접착 두 세포 고유의 특성 (예를 들어, 인테그린 발현 프로파일) 및 선택한 ECM 단백질에 따라 달라집니다.

때문에 제한된 공간에, 우리는 여기에 배열 디자인, 레이아웃, 및 제조의 광범위한 치료를 제공하지 않은 이전 23 일에, 25 독자를 참조하십시오. 우리는 일반적으로 10 ~ 20 고유 한 생체 분자 조건 (즉, 5 ~ 10 점 / 상태)로 구성된 100 자리 서브 어레이 (150 μm의 스폿 직경 450 μm의 중심 간 거리)를 사용합니다. 하나의 배열의 서브 어레이의 수는 편안하게 한 25 × 75mm 현미경 슬라이드에 1,280 개까지 확장 할 수 있습니다 관심의 생체 분자 상태의 수에 따라 달라집니다 (~ 64 서브 어레이에서 6,400 점)외부 참조 "> 25, 31 파라미터는 상기 추가의 관심의 패턴의 크기에 따라 달라질 수는]. (75)로부터 패턴을 발생하는 핀 - 450 ㎛의 용이하게 이용할 수있다.

어레이 실험은 가장 다른 문화 형식을 사용하여 관심의 높은 점수를 배열 조건, 분석 판독 및 생물학적 모델 시스템의 유효성 검사에 의해 보완된다. 특히, 우리는 또한 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, QRT-PCR, 면역 블) 또는 표준 TFM와 함께 대량 배양을 사용하여 선택 배열 조건의 효과를 검증하는 것이 좋습니다. 유전자 조작 할 수도 어레이에서 관찰 된 효과를 확인하는 역할을 적절한 생물학적 모델 시스템에 대한 관심의 인자 (예를 들어, 최저 또는 과발현). 생체 내 동물 모델이 검증의 또 다른 방법을 나타내는 최근의 galectin-3 galectin-8의 중심 역할을 확인하기 위해, 예를 들어, 사용 된폐암 전이 틈새는 등의 초기 셀 마이크로 어레이 (31), (49)을 통해 확인했다.

다른 방법의 수는 2 차원 미세 시스템 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 3 차원 설계 생체 시스템 (56)의 종류, 57, 58을 포함한 세포 기능의 미세 환경 규제를 조사하는데 사용되어왔다 59, 60, 61. 다른 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 셀 마이크로 어레이 플랫폼의 특별한 장점은 다음과 같이 구성한다 : (1) 최대 스루풋수백 또는 상호 작용 효과의 분석을 가능 요소의 다른 조합의 수천; (2) 액세스 자동화 영상 분석; (3) 배열 요소의 제어 프리젠 테이션을 모두 생화학 및 생물 물리학 판독의 통합; (4) 기판의 재료 특성을 변경하는 능력; 세포 운명 기능 (5)가 높은 콘텐츠 단일 세포 분석.

요약하면, 가변 기판 강성의 기판 상에있는 셀 TFM 마이크로 어레이의 조합 모두 생화학 및 생물 물리학 적 큐 완전한 특성화를 가능하게한다. 여기에 제시된 바와 같이,이 플랫폼은 일반화하고 용이 세포 분화 및 mechanotransduction의 조합 미세 환경 조절의 개선 된 이해를 향해 부착 세포 유형 및 조직 다양한 상황에 적용될 수있다.

공개

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

우리는 인정 오스틴 Cyphersmith 및 Mayandi Sivaguru (게놈 생물학에 대한 칼 R. Woese 연구소, 어 바나 - 샴페인 일리노이 대학) 현미경에 대한 지원과 관대 현미경의 핵심 화면과 비디오 캡처를 수용.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm syringe filterPall Corporation4433Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solutionFisher ScientificSV30010
22 × 60 mm coverglassesElectron Microscopy Sciences63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)Sigma-Aldrich440159Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)Sigma-AldrichC3023
35 mm glass-bottom Petri dishesCell E&GGBD00002-20013 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterileUSA Scientific1823-8400
6-well polystyrene microplatesFisher Scientific08-772-1B35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
AcetoneSigma-Aldrich179973
AcrylamideSigma-AldrichA3553CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tailEMD Millipore08-115MI
Collagen III, humanEMD MilliporeCC054
Collagen IV, humanEMD MilliporeCC076
Crosslinker, 365 nmUVPCL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDaThermoFisher ScientificD1841Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxideFisher ScientificBP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific (HyClone)SH3001302
Ethyl alcoholDecon Labs2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichED
Fc-recombinant DLL1, mouseR&D Systems5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouseAdipoGenAG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, ratR&D Systems599-JG-100
Fibronectin, humanSigma-AldrichF2006
Fluorescent microscope, invertedZeissAxiovert 200MEnsure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPISouthernBiotech0100-20
Glacial acetic acidSigma-Aldrich695092CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
GlycerolSigma-AldrichM6145
Irgacure 2959BASF Corporation55047962
Laminin, mouseEMD MilliporeCC095
MethanolSigma-Aldrich179957
Microarray scannerGenePix4000BFluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
MicroarrayerDigilabOmniGrid MicroOther microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mmSigma-AldrichCLS294775X25~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)Sigma-AldrichM7279CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/vElectron Microscopy SciencesRT15710Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinantThermoFisher Scientific21186
Pyrex drying tray, 2,000 mLFisher Scientific15-242B
Rectangular 4-chambered culture dishFisher Scientific (Nunc)12-565-495For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetateSigma-AldrichS2889
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arrayingArrayItSMP3Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100Sigma-AldrichX100

참고문헌

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N., Parekkadan, B., Yarmush, M. . Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. , 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

121

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유