소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

요약

이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.

초록

일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 시험 관내 모델로서 널리 사용되어왔다. 그러나, CGN 배양에서 신경 교세포와 뉴런의 공존은 신경 세포 생존 능력의 정확한 평가에서 편차를 유발할 수있다. Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색법은 생존 및 사멸 세포를 동시에 평가함으로써 세포 생존력을 측정하는 데 사용되었습니다. 우리는 비색 분석법의 민감도를 향상시키고 CGNs의 신경 생존 능력을 평가하기 위해 FDA-PI 이중 염색법을 사용했습니다. 또한 정확도를 높이기 위해 청색 형광 DNA 얼룩 ( 예 : Hoechst)을 추가했습니다. 이 프로토콜은 CGN 문화에서 이러한 방법을 사용하여 연결 가능성의 평가의 정확성을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 형광 현미경을 사용하여 glial 세포의 수를 제외 할 수 있습니다. 비슷한 전략을 적용하여 원치 않는 gli를 구별 할 수 있습니다.대뇌 피질의 배양 및 해마 배양과 같은 다양한 혼합 세포 배양에서 뉴런의 알 세포.

서문

3- (4,5- 디메틸 -2- 티아 졸릴) -2,5- 디 페닐 -2-H- 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석과 같은 비색 세포 독성 분석은 일반적으로 시험 관내에서 세포 생존력을 측정하는 데 사용됩니다. 쥐의 일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 이온, 과산화수소 및 글루 탐 산염 1,2를 비롯한 다양한 신경 독소에 민감합니다. 따라서 CGN 배양 물은 신경 과학 분야 의 시험 관내 모델로 사용될 수 있습니다. CGN 배양 물은 CGN 배양에서 총 세포의 약 1 %를 차지할 수있는 뉴런 및 신경교 세포를 포함하는 다양한 세포를 함유 할 수있다. 그러나 신경 교세포는 뉴런에 비해 신경 독소에 다르게 반응하여 비색 분석 ³ 에 의해 측정 된 신경 세포 생존력에 편향을 일으 킵니다.

살아있는 세포에서 Fluorescein diacetate (FDA)는 에스 테라 제에 의해 플루 오레 신으로 전환 될 수 있습니다.Propidium Iodide (PI)는 죽은 세포를 통과 한 후 DNA와 상호 작용할 수 있으며 배양 물 내에서 세포 사멸을 나타내는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 FDA-PI 이중 염색은 생존 가능한 세포와 ​​죽은 세포를 동시에 평가할 수있어 비색법을 결합하여 세포 생존력을보다 정확하게 측정 할 수 있음을 시사합니다. 또한 핵에 파란색 형광 염료 인 Hoechst를 추가하여 세포 생존력의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 FDA-PI 이중 염색법과 FDA-PI-Hoechst triple 염색법을 설명하며, 일차 배양 CGN에서의 신경 생존력을 정확하게 분석하는데 사용될 수 있습니다.

이 프로토콜은 다른 크기와 모양으로 CGN과 glial 세포를 시각화하고 구별하는 것을 이용합니다. 염색 후, 생존 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수는 형광 현미경으로 촬영 한 대표 이미지로부터 계산됩니다. 대형 glial 세포는 전형적인 CGNs의 비교에 의해 제외됩니다형광등 모드에서 위상차 모드로 촬영 한 것입니다. 유사한 전략은 일차 피질 문화와 해마 문화와 같은 뉴런과 glial 세포를 포함하는 혼합 세포 배양에서의 연결 생존 능력을 측정하기 위해 수행 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 실험실 동물의 관리와 사용을위한 국립 보건원 (NIH) 안내서 (NIH Publications No. 80-23, 1996 년 개정)를 따르고 Ningbo University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) SYXK-2008-0110).

1. 솔루션 및 문화 미디어의 준비

참고 : 시약 및 스톡은 무균 조건에서 준비해야합니다. 구멍 크기가 0.22 μm 인 필터를 사용하여 필터링하여 소독하십시오.

1. 이중 증류수 (ddH ₂ O) 10 ML에 PLL 5 MG를 추가하여 Poly-L-Lysine (PLL) 스톡 솔루션을 준비하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 PLL 스톡 솔루션을 몇 달 동안 저장하십시오.
2. Krebs 완충액에 NaCl 7.25g, KCl 0.4g, NaH2PO4 0.14g, D- 글루코스 2.6g 및 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 5.94g을 100mL의 ddH2 _</ sub> O. 필터링을 통해 소독하십시오. 한 달 동안 4 ℃에서 Krebs 완충액을 보관하십시오.
3. Mg2SO4 3.82 g을 ddH ₂ O 100 mL에 넣고 3.82 % Mg ₂ SO ₄ 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 개월 동안 4 ℃에서 Mg ₂ SO ₄ 용액을 보관하십시오.
4. CaCl ₂ 1.2 g을 ddH ₂ O 100 mL에 넣고 1.2 % CaCl ₂ 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 개월 동안 4 ℃에서 CaCl ₂ 용액을 보관하십시오.
5. 100mL의 ddH ₂ O에 KCl 15g을 가하여 2M KCl 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 달 동안 4 ℃에서 KCl 용액을 보관하십시오.
6. D - 글루코스 1.8g을 ddH ₂ O 100mL에 넣고 D- 글루코스 스톡 용액을 준비한다. 여과하여 소독한다. D- 글루코오스 용액을 나누어서 4 ℃에서 1 개월 동안 보관하십시오.
7. Cytosine β-D-Arabinofuranoside (Ara-C) 스톡 솔톨 준비이온은 0.24 g의 Ara-C를 10 mL의 ddH ₂ O에 첨가하여 제거한다. 여과하여 소독한다. 몇 분 동안 4 ℃에서 분주하고 Ara-C 보관 용액을 보관하십시오.
8. FBS (Fetal Bovine Serum) 25 mL, 100x 글루타민 2.5 mL, 2M KCl 용액 2.78 mL, 기본 중 독수리 (BME)의 100x 항생제 2.5 mL를 사용하여 250 mL의 배지 (25-30 새끼) . 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다.
9. 2.5x 100x 글루타민 용액, 2.78ml 2M KCl 용액 및 2.5x 100x 항생제를 사용하여 25K 배지를 BME에 준비한다. 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다.
10. BME에서 2.5x 100x 글루타민과 2.5x 100x 항생제를 사용하여 5K 배지를 준비한다. 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다.
    참고 : 배양 배지, 25K 배지 및 5K 배지는 새로 준비해야합니다
11. 1 mL의 아세톤에 5 mg의 FDA를 첨가하여 FDA 저장 용액을 준비한다. 장기 보관을 위해서는 4 ℃에서 FDA 보관 용액을 보관하십시오.
12. 1 mL의 ddH ₂ O에 1 mg의 PI를 첨가하여 PI 저장 용액을 준비하십시오. 몇 달 동안 4 ℃에서 PI 저장 용액을 보관하십시오.
13. Hoechst 33342 5 mg을 ddH ₂ O 1 mL에 넣고 Hoechst 원액을 준비하십시오. 몇 달 동안 4 ℃에서 Hoechst 원액을 보관하십시오.

2. 해 해제의 준비

참고 : 해부하기 전에 1 일하십시오.

1. 해파드 용액을 150 ML의 ddH ₂ O에 Krebs 버퍼 15 ML, 3.82 % Mg ₂ SO ₄ 솔루션 1.2 ML 및 소 혈청 알부민 (BSA) 0.45 g을 추가하여 준비합니다. NaOH를 사용하여 7.4로 산도를 조정합니다.
2. 다음과 같이 5 x 50 mL 튜브에 라벨을 붙이십시오 : 1, 2, 3, 4 및 5.
3. 필터가있는 50 mL 주사기에 절개 용액 40 mL를 넣으십시오. 튜브 1에 해부 용액 30 mL를 여과하고 조직을 처리하는 데 사용되는 몇 가지 35 mm 세포 배양 접시에 각각 2 mL 씩 넣습니다.
4. ~까지ube 2, 해부 용액 50 mL에 12.5 mg의 트립신을 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오.
5. 3 관에 해부액 15 mL에 1.2 mg의 DNAse I, 7.8 mg의 대두 트립신 저해제, 150 mL의 3.82 % Mg ₂ SO ₄ 용액을 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오.
6. 튜브 4에 튜브 3의 용액 5 mL를 넣는다. 해파 용액 10.5 mL를 넣는다. 필터링을 통해 소독하십시오.
7. 튜브 5에 해부 용액 12.5 mL에 3.82 % Mg ₂ SO ₄ 용액 100 μL와 1.2 % CaCl ₂ 용액 15 μL를 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오.
8. 사용 전에 모든 튜브를 4 ° C에 보관하십시오.

3. 세포 배양 판 코팅

참고 : 해부하기 전에 1 일하십시오.

1. 100 mL의 ddH ₂ O (최종 농도 : 5 μg / mL)에 PLL 원액 1 mL를 넣는다. 플라스틱 코팅poly-L-lysine 용액 5 μg / mL를 첨가하여 6- 웰 또는 12 웰 세포 배양 플레이트 (6 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 2 mL 또는 12 웰 세포 배양 플레이트의 웰당 1 mL)를 첨가 하였다.
2. 실온에서 1 일 동안 (또는 37 ° C에서 2 시간 동안) 배양하십시오. 해부하기 전에 1-2 시간, 피펫을 사용하여 솔루션을 제거합니다. ddH ₂ O로 한 번 씻고 세포 배양 후드에서 말립니다.

4. 8 일 된 Sprague-Dawley Rats에 대한 조직 처리.

1. 얼음에 100mm 접시를 놓으십시오. 한 켤레의 소독 가위를 사용하여 쥐 새끼를 접시에 처치하십시오.
2. 구멍이있는 매그넘에 가위를 삽입하고 귀에서 눈으로 두개골의 양면을 자릅니다. 한 쌍의 포셉을 사용하여 두개골을 들어 올리십시오. 전체 뇌가 두개골에 있는지 확인하십시오. 소뇌를 분리하고 포셉 한 켤레를 사용하여 위에서 언급 한 35mm 요리에 넣어.
3. 해부 현미경으로 작업하십시오. 두 쌍의 포셉으로 수막과 혈관을 제거하십시오..
4. 칼로 티슈를 자른다. 튜브를 튜브에 넣으십시오. RT와 1,500 x g에서 5 분간 원심 분리하십시오.
5. 뜨는을 대기음. 펠렛을 저장하십시오.
6. 튜브 2의 용액을 펠렛에 넣는다. 부드럽게 흔들어서 Resuspend.
7. 튜브를 37 ° C의 수 욕조에 15 분간 놓습니다. 부드럽게 3 분마다 흔들어.
8. 튜브 4의 용액을이 용액에 첨가한다. 흔들어서 실온에서 5 분간 원심 분리하고 1,500 x g.
9. 뜨는을 대기음. 펠렛을 저장하십시오.
10. 튜브 3에 솔루션을 추가하여 펠렛을 resuspend.
11. 두 개의 15 mL 튜브를 준비하십시오. 각 튜브에 세포의 절반을 배치하십시오. 셀을 균질화하기 위해 목화 플러그 파스퇴르 피펫을 사용하여 60-70x 위아래로 피펫.
12. 튜브 15에 3 mL의 용액을 각 15 mL 튜브에 첨가한다. RT에서 10 분간 앉아서 면봉으로 된 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 조심스럽게 상등액을 제거하십시오. 상등액을 새로운 15 mL 튜브에 넣고 RT와 1,500 x g에서 5 분간 원심 분리합니다.
13. 에이상층 액을 증발시킨다. 펠렛을 저장하십시오.
14. 펠렛에 배양 배지를 넣어 약 1.5 x 106 세포 / mL (10 마리의 새끼를 약 100 mL)의 세포 밀도를 얻습니다.
15. 세포를 문화 플레이트에 넣고 37 ° C 및 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 배양하십시오.

5. 배양 중 Ara-C와 D-glucose의 첨가

1. 24 시간 후, 신경 세포의 성장을 억제하기 위해 Ara-C 저장 용액 (12- 웰 세포 배양 플레이트 또는 10- 웰 세포 배양 플레이트에 대해 20 μL / 웰, 최종 농도 : 1 mM)을 첨가한다.
2. 7 일에, 최종 농도가 1 MM되도록 12 잘 세포 배양 플레이트 또는 6 잘 세포 배양 플레이트에 대한 우물 당 100 μL에 대한 우물 당 50 μL D- 포도당 스톡 솔루션을 추가합니다.

6. CGN 배양에서의 FDA-PI 이중 염색 및 FDA-PI-Hoechst 삼중 염색

1. 20 μL의 FDA 저장 용액을 첨가하여 FDA-PI 작업 용액 준비최종 농도 : 10 μg / mL)와 10 mL의 PBS에 50 μL의 PI 스톡 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL)을 넣었다. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다.
   1. FDA-PI-Hoechst 작업 용액의 경우 FDA 저장 용액 (최종 농도 : 10 μg / mL) 20 μL, PI 저장 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL) 50 μL, Hoechst 원액 10 μL (최종 농도 : 5 μg / ML) 10 ML PBS에. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다.
      참고 : 사용 직전에 FDA-PI 작업 솔루션 및 FDA-PI-Hoechst 작업 솔루션을 새로 준비하십시오.
2. 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 꺼냅니다. 얼음에 올려 놓으십시오.
3. 배양기를 대기음으로 감기는 PBS로 교체하십시오.
   참고 : 솔루션 변경은 천천히 그리고 조심스럽게 이루어져야합니다. 피펫 팁으로 세포를 만지지 마십시오.
4. 차가운 PBS를 대기음으로 옮겨 차가운 FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 작업 용액으로 교체하십시오 (500 μL / 우리12 웰 세포 배양 플레이트 또는 6 웰 세포 배양 플레이트에 대해 1㎖ / 웰). 얼음 위에서 5 분간 방치한다.
5. FDA - PI 또는 FDA - PI - Hoechst 작업 솔루션을 대기음과 차가운 PBS (12 잘 세포 배양 플레이트 또는 잘 쥐 세포 배양 플레이트 50 μL / 잘 100 μL /)를 추가합니다.
   참고 : 이미지를 촬영할 때 셀을 건조시키지 마십시오.
6. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 통과 대역이 450 - 490 nm 인 여기 필터를 사용하십시오. FDA, PI 및 Hoechst의 형광 방출을 각각 520, 620 및 460 nm에서 감지합니다. 동일한 조건에서 형광 현미경의 위상차 모드를 사용하여 정상 광선 아래에서 이미지를 찍습니다.
   참고 : FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 염색 후 15 분 이내에 이미지를 촬영하십시오. 노출 시간은 100-300ms이고 아날로그 게인은 2.8x입니다.

7. 신경 생존력의 평가

1. FDA-PI 이중 염색의 경우, 여과 후 검출 된 세포의 이미지를 오버레이그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 층에있는 FDA- 양성 층을 드래그하여 다른 형광 필터로.
   1. "레이어"패널의 "불투명도"필드에 "50 %"를 입력하여 FDA 양성 레이어의 불투명도를 조정합니다. "Layer"메뉴에서 "Merge Visible"버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. "이미지"아래의 "대비"필드에 "50"을 입력하여 오버레이 이미지의 대비를 설정하십시오 | "조정"| "밝기 / 대비" 오버레이 이미지에 FDA 및 PI 이중 긍정 셀이 없는지 확인하십시오.
2. FDA-PI-Hoechst 3 중 염색의 경우 그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 층의 FDA 양성 층을 끌어 다른 형광 필터를 필터링 한 후 검출 된 세포의 이미지를 오버레이합니다. "레이어 & # 0"레이어의 "불투명도"필드에 "50 %"를 입력하여 FDA- 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다.34; 패널.
   1. "Layer"메뉴에서 "Merge Visible"버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 병합 된 레이어에서 Hoechst 양성 레이어를 드래그합니다. "레이어"패널의 "불투명도"필드에 "50 %"를 입력하여 Hoechst- 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다. "Layer"메뉴에서 "Merge Visible"버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다.
3. 형광 모드에서 촬영 한 이미지와 위상차 모드에서 촬영 한 이미지를 비교하여 대형의 불규칙한 glial 세포를 CGN과 구별합니다. CGN보다 3 배 큰 직경을 가진 세포는 glial 세포로 간주되므로 제외해야합니다.
4. 이미지 처리 프로그램 ( 예 : ImageJ)에서 세포 카운터 플러그인을 사용하여 실행 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수를 각각 계산합니다.
   1. FDA-PI 이중 염색의 경우, 작은 FDA 양성 세포를 수동으로 표시한다.생존 가능한 뉴런. PI 양성 세포를 죽은 뉴런으로 수동으로 표시하십시오. FDA-PI-Hoechst triple staining의 경우, 작은 FDA- 및 Hoechst- 이중 양성 세포를 생존 가능한 뉴런으로 수동으로 표시하십시오. 수동으로 PI- 및 Hoechst- 이중 양성 세포를 죽은 뉴런으로 표시하십시오.
5. 다음 방정식을 사용하여 연결 세포 생존율을 계산하십시오 : 연결 생존율 % = [생존 가능한 뉴런의 수 / (죽은 뉴런의 수 + 생존 가능한 뉴런의 수)] × 100 %. 각 우물에 대해 5 개의 무작위 필드를 선택하고 뉴런 생존율을 평균합니다.

결과

GAP43 (적색)과 GFAP (녹색)의 이중 immunostaining는 각각 신경 세포와 glial 세포의 모양을 분석하는 데 사용되었다 ^{2 , 5} . 두 뉴런과 glial 세포는 CGN 문화에 존재합니다. GFAP 양성 glial 세포는 이미지의 화살표로 표시된대로 크고 불규칙한 모양입니다 ( 그림 1 ). 세포 활력에 대한 전통적인 분석은 신경 생존력을 측정하는 데 ...

토론

이 프로토콜은 앞에서 설명한 절차 ^{6 , 7} 에서 수정되었습니다. 연구원은 체외에서 일차 뉴런 을 배양 할 때 조건을 개선하여 비 신경 세포 성장을 줄이기 위해 시간을 보냈습니다. 그러나, 개선 된 배양 조건으로도, 일부의 신경아 교세포가 남아있다. 또한, 그들은 신경 세포의 성장과 성숙을 도와주기 때문에 비 연결 세포가 기본 신경 세?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100x glutamine	Gibco	25030081
100x antibiotics	Gibco	15240062
Basal Medium Eagle (BME)	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate (FDA)	Sigma	F7378
Propidium Iodide (PI)	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 mL	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 mL	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image processing software	NIH	ImageJ