정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

요약

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

초록

알러지 유발 물질과 병원균의 흡입은 폐의 면역 세포 유형의 다양한 여러 변화를 이끌어 낸다. 유동 세포 계측법은 면역 세포에 세포 표면 단백질의 정량 분석을위한 강력한 기술이지만, 폐 내에서 이러한 세포의 현지화 및 이동 패턴에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, 화성 분석은 체외에서 화학 주성 인자에 반응하는 세포의 가능성을 연구하기 위해 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 전술 한 기술들에 대조적으로, 폐 내의 각각의 세포 유형의 위치를 ​​용이하게 시판되는 형광 태그 항체로 염색 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 공 초점 현미경에 의해 부분을 시각화 시각화 할 수있다. PCLS 살 모두 사용과 폐 조직을 고정하고, 슬라이스 전체 엽 단면 한 큰 영역을 포괄 할 수있다. 우리는 성공적으로 수지상 세포의 구별 유형, 대 식세포, 호중구, T 세포와 B 세포뿐만 아니라, 림프, 내피 등의 구조 세포를 포함 폐에서 세포 유형의 다양한의 위치를 ​​시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다 상피 세포. 세포가 폐 내에서 이동 및 정상 상태에서 염증 동안 서로 상호 작용하는 방식을 라이브, 입체 폐 조직에서 수지상 세포와 T 세포 사이 것과 같은 세포 상호 작용을 시각화하는 능력은 공개 할 수 있습니다. 같은 유동 세포 계측법 및 정량 PCR과 같은 다른 절차와 함께 사용하는 경우 따라서, PCLS는 폐의 알레르기 성 및 염증성 질환의 기초가 세포 사건의 포괄적 인 이해에 기여할 수있다.

서문

이러한 지질 다당류 (LPS)와 같은 염증성 자극의 흡입 후,이 내에 면역 세포의 조정 움직임, 그리고 폐에서. 예를 들어, 호중구는 빠르게 폐 실질과기도로 모집하고 있습니다. 또한, 종래의 수지상 세포 (CDCS)로 알려진 몇몇 전문 항원 제시 세포는 비교적 복잡한 이동 패턴 ^{1, 2} 겪는다. CDCS은 표면 마커들의 디스플레이하는 CD11c에 부분적으로 유세포하여 식별 기초 할 수있다. 수지상 고유 서브 세트 CD103 및 CD11b를 ³ 차 표면 발현에 의해 구별 될 수있다. 흡입 된 항원을 취득하면, 일부 CDCS 폐 빠져가 항원 특이 적 T 세포 위해 ⁴ 펩티드를 제시 폐 배수 림프절 (림프절)에 림프관을 통해 이동한다. 이 적응성 면역 연구의 시작에 중요한 초기 이벤트esponses. 알 수없는 이유로, 그러나, 흡입 항원을 획득 모든 CDCS는 폐를 떠나, 이러한 세포의 대부분은 ^몇 달 ⁵ 해당 기관에서 ^{6 남아있다.} 단핵구 유래의 CD11c ⁺ 케모카인 수용체, CCR7 부족한 세포, 지역 림프절 ^{7, 8로} 마이그레이션 할 수없는 때문에 이러한 관찰은 부분적으로 이러한 세포의 발달 조상에 의해 설명 될 수있다. CDCS의 이동 가능성도 폐 내에서의 해부학 적 위치에 의해 적어도 부분적으로 결정되는 것으로 보인다. 그러나, 폐 CDCS의 서로 다른 집단의 정확한 현지화 완전히 특징되지 않습니다. 폐 내에서, 그리고 직접 분자의 면역 세포 지역화의 개선 된 지식, 폐의 면역 체계가 활성화됩니다 방법에 대한 더 나은 이해를 위해 필요합니다.

PCLS이되고 증가하고있다폐 구조 ^{(9), (10)의} 구조적 일체 성을 유지하면서, LY는 셀룰러 위치 및 세포 - 세포 상호 작용을 시각화하기위한 생체 외 방법으로 사용된다. PCLS은 쥐, 소, 원숭이, 양, 말, 인간 ^(11)를 포함하여 많은 종의 폐를 연구하는 데 사용되었다. 이 기술의 주요 장점은 약 20 분할함으로써 개별 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고, 마우스 폐 단일 로브로부터 제조 될 수 있다는 것이다. 수지상 세포, 대 식세포, 호중구 및 T 세포를 포함하여 거의 모든 면역 세포 유형은 PCLS에 존재하고 그들의 정상적인 구조를 유지한다.

PCLS은 아세틸 콜린 ⁽¹²⁾ 또는 메타 ^(13)와 치료 후 칼슘 신호 및기도 평활근 세포의 수축력을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방식에서, 폐의 작은 부분은 인현미경 alyzed하지만, 한 연구는 PCLS에서기도 수축의 측정 슬라이스 조각에서 약 10 %을 변화하고,이 차이는 그대로 동물 ^(14)에 폐 기능 검사를 사용하여 볼에 필적이라고보고했다. 다른 연구자들은 LPS ^(15)와 함께 배양 한 후 사이토 카인의 발현 및 세포 표면 마커의 변화를 연구하기 위해 체외 방식으로 PCLS을 사용했다. PCLS 또한 작은 내 선방 동맥 저산소 성 폐 혈관 수축의 체외 모델에서 사용되어왔다. 이 선박은 해부 동맥 세그먼트 또는 subpleural 용기 ^(16)의 분석 등을 포함하여 기타 절차를 사용하여 도달 할 수없는 폐의 부분에 있습니다. 우리 연구실은 주로 생체 내 염증 자극 다음과 면역 세포의 정상 상태에서 라이브 폐 조직의 현지화 및 시각화 PCLS을 사용하고있다. 다음과 같이 우리가 개발 한 절차이다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

이 문서에 설명 된 동물 실험 절차는 NIEHS 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 폐 제조

1. 제도적 동물 관리 및 사용위원회에 의해 제공되는 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건에서 생후 6 12 주 사이 하우스 마우스.
   참고 : 몇 군데 마우스는 각 연구자의 특정 관심 분야에 따라, 순진, 또는 처리 될 수 있습니다. 여기서는 50 μL의 총 부피의 비히클로 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여, 나이브 마우스에 100 μg의 난 알부민 (OVA) 및 0.1 μg의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)로 처리 된 마우스에 면역 세포 제이션을 설명한다. oropharyngeally기도에 OVA / LPS를 주입하기 위해 동물 이소 플루 란 흡입 마취와 수직으로 고무 밴드와 함께 자신의 치아에 의해 중단되었다. 혀 부드럽게 포셉 파지 연하 방지 한쪽 유지하고 50 #시켰다181; 구강의 후면에 증착 된 OVA / LPS 용액 L은 앞서 설명한 ^17.
2. 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 마우스를 안락사 및 폴리스티렌베이스 동물 핀.
3. 턱 복부까지의 중앙으로부터 피부와 복막 절단 가위로 복강을 열고. 집게 또는 위의 둔한 에지 제외 창자 당기고 폐 멀리 피 드레인 대정맥을 자르지. 폐를 절단하지 않도록주의하면서, 흉곽의 팽창을 허용하도록 위의 날카로운 팁 격막 천공.
4. 클리어 침샘과 집게로 기본 기관에서 당기고 수동으로 조직을 잡아하여 멀리 기관에서 다른 조직. TRA 불구하고 모든 방법을 베이지 않도록주의하면서 미세 집게 가위를 사용하여 연골의 두꺼운 밴드의 전방 측면에서 기관의 작은 절개를합니다CHEA. 절개는 20 G 바늘이 통과 할 수 있도록 충분히 커야합니다.
5. 바늘의 끝을지나 튜브의 약 1cm을두고 폴리에틸렌 튜브의 섹션 상에 1.5 인치, 20 G 바늘을 밀어. 아가까지 바늘을 통해 따뜻한 0.8 ㎖ (40 ℃)에서 2 % 저 융점 그려서 주사기를 최종 베벨 1 ml 주사기의 바늘을 장착하고,로드 약 45 °의 각도로 튜브를 절단.
6. 기관의 절개로 튜브의 끝을 놓고 천천히 폐에 아가로 오스를 주입. 바늘이나 주사기를 이동하지 않고, 바늘이 기관에 남아 보장하기 위해 폴리스티렌베이스에 주사기를 테이프.
   참고 : 주입 후, 폐는 가슴에서 크고 팽창 될 것입니다. 오른쪽 돌출부는, 먼저 왼쪽 엽을 확장합니다. 하나의 로브가 확장되면, 바늘 (기관지 과거) 너무 깊이 삽입 된, 그리고 그것을 진행하기 전에 약간 당겨해야 할 것입니다. 의이 부분절차는 아가로 오스는 응고 시작하기 전에, 상대적으로 빠르게 수행해야합니다.
7. 적어도 10 분 동안 상기베이스 및 냉장실 여전히 기관에 삽입 된 주사기 또는 냉장고, 마우스를 놓는다. 필요한 경우, 동물은 몇 시간까지, 심지어 비디오 현미경으로 이미지 세포의 이동으로 진행하면 거기에 유지 될 수있다.
8. 마우스가 감기되면, 조심스럽게 가위를 사용하여 아가로 오스 - 팽창 폐를 절제하고, 얼음 차가운 PBS와 3cm 접시에 배치합니다. 얼음에 보관하십시오.
9. 조직 슬라이스에 대해 원하는 엽 (예를 들어, 바로 우수한 엽)을 선택합니다. 확실히 (이 기관에 연결) 폐의 내부 부분이 접시에 내려 얼굴을 확인합니다.
   주 : 로브를 사용하고, 플런저에 그 방향이 표시되며기도 혈관의 크기를 결정한다. 여기에서 설명한 배향은 큰기도의 시각화 및 실질 이상적이다. 마우스는 하나의 큰 왼쪽 엽과 오른쪽에 네 개의 작은 돌출부가 있습니다. 에 대한편리 크기 때문에, 또한 흡입 에이전트가 그 안에 균일하게 분산하기 때문에 인두 또는 비강 흡입을 통해 폐에 알러지 유발 물질의 도입 다음 PCLS 영상은 오른쪽 우수한 엽은 일반적으로 부분적으로 구분된다. 그러나 다른 로브, 특히 왼쪽 엽도 공부하실 수 있습니다. 마우스 균주 또는 치료를 비교하는 경우, 같은 엽을 비교하는 것이 중요하다.

2. 폐 슬라이스

참고 : 제조업체의 지침에 따라, 금속 블록, 플런저 및 금속 주사기를 냉각, 자동 슬라이서를 이용하여 슬라이스를 확인합니다.

1. 플런저에 모든 용도의 작은 방울, 노 실행 젤 superglue를 넣고 접착제 금속 주사기의 측면에 접촉하지 않도록주의하면서 원을 그리 접착제를 확산. 접착제 주사기의 측면에 접촉하면, 주사기 플런저 접착제와 함께한다.
2. 즉시 접착제와 플런저를 피복 한 후, 가볍게 잡고다운 기관 측과 집게 절제 로브 과잉 액체를 제거하고, 신중 플런저의 상부에 배치하기위한 조직에이 한 덩어리. 플런저의 에지를 넘어 연장되는 여분의 조직을 잘라내.
3. 금속 주사기의 측면 이동과 조직을 통해 있도록 만들어 아래로 플런저를 이동 잘 깊은 몇 센티미터보다 더 이상, 하단에 붙어 폐. 금속 주사기의 바닥의 주위에 테이프 장소에서이 위치를 유지합니다.
4. 단지 로브의 상부를 커버하는 것이므로 웰에 40 ℃에서 2 % 저 용융 아가 로스를 붓는다.
5. 얼음 - 냉각 된 냉각 블록 금속 주사기를 둘러싸고 1 로브 및 아가로 냉각 - 2 분.
   참고 : 주변 조직 아가로 오스의 짧은 시간 냉각이 고르지 잘라 PCLS이 발생할 수있는 슬라이스 동안 아가로 오스의 붕괴로 이어질 수있다.
6. 자동 슬라이서로 표본 주사기를 넣고 얼음 차가운 PBS와 버퍼 탱크를 채우십시오. 맞 춥니 시편 주사기 모터 구동 단계와 바닥에서 테이프의 부분을 제거한다. 스텝 모터 구동 단지 플런저의이면에 닿을 때까지 빨리 감기 (FF) 위치로 스위치를 켜는.
7. 시편 주사기와 신선한 날을 맞 춥니 다. 슬라이서에서 설정 조직 두께, 연속 / 단일 슬라이스, 진동 및 속도. 예를 들어, 조직의 두께가 150㎛, 연속 절삭 (계속). 발진 9 및 속도 3 - 4. 시작. 위의 설정은 특정 자동 슬라이서 사양으로 조정해야합니다.
8. 그들은 상기 버퍼 탱크 내로 낙하하고 빙냉 PBS를 함유하는 24 웰 플레이트에 배치로 얇은 주걱 또는 브러시를 사용하여 한번에 하나 PCLS 수집.
   참고 : 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 조각을 유지하는 것이 중요합니다. 모든 폐 나이, 성별, 체중에 따라 다르지만, 10 ^번째 조각은, 예를 들어, 일반적으로 유사기도 크기 산출한다.

ove_title "> 3. 항체 염색

1. 계정에 잠재적 인 형광 스펙트럼 중복 및 현미경의 탐지 기능을 가지고, 관심의 세포 유형에 따라 형광 태그 항체의 패널을 디자인합니다.
   참고 : 다음과 같은 예를 들어, DC 서브 세트 검출 용 패널은 다음의 CD11c / 알파 X 인테그린 - BrilliantViolet (BV) (605) (인가 전압 : 405 nm의 발광 피크 : 605 ㎚), CD324은 / E-cadherin의 - 알렉사 488 (AF488 ) (인가 전압 : 488 nm의 발광 피크 : 519 ㎚), CD88 / C5Ra1 - 피코 에리 트린 (PE) (인가 전압 : 561 nm의 발광 피크 : 578 ㎚), CD103은 / 알파 E 인테그린 - 알로 피코시 아닌 (APC) (인가 전압 : 633 내지 발광 피크 : 660 ㎚). 형광 스펙트럼 뷰어 도구 (재료 목록 참조) 패널을 설계하는 데 유용합니다.
2. 원하는 항체를 포함한 항체 칵테일을 만든다.
   1. 정적 PCLS 이미징 1.5 ML의 microcentrifu 800 μL 염색 완충액 100 μL 프크 블로커, 50 μL 정상 마우스 혈청 및 50 μL 정상 쥐의 혈청을 추가1 mL의 총 부피에 대한 gation 튜브. 생균 이미징 대신 염색 완충액 10 % FBS (라이 보 비츠-10)을 함유하는 800 μL의 라이 보 비츠 매체 (1X)를 사용한다.
   2. 각 항체의 원하는 최종 농도를 조정하는 항체를 추가한다. 3 센티미터 접시에 항체 솔루션을 전송하고, 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 유지한다.
      주 : (- 5 ㎍ / ㎖의 통상 1) 최종 농도가 필요 각 항체에 대해 최적화된다.
3. 대형기도 또는 폐의 주변부로서 관심의 해부학 적 영역을 갖는 PCLS를 선택하고, 1 ㎖의 항체 용액을 포함하는 3-cm 접시에 놓는다.
4. 30 또는 60 분 동안 천천히 흔들 얼음에 어두운 얼룩 PCLS,.
5. 정적 PCLS 이미징 들어, 라이브 세포 이미징을 위해 섹션 4로 진행 섹션 5로 진행합니다.

PCLS 4. 정적 이미징

1. 항체 PCLS 60 분 배양 후, t 디쉬로부터 상기 항체 용액을 제거하고 린스그는 1 mL의 얼음 차가운 PBS로 두 번 조각.
2. 3cm 둥근 바닥 유리 접시 상에 50 μL 피펫 PBS. 주걱이나 붓을 사용하여, 평평해질 때까지 부드럽게 조각을 조작, 드롭에 스테인드 PCLS을 전송하고 확산. 피펫으로 PBS를 제거합니다. 슬라이스는 가능한 한 평평해야한다. 위의 절차는 광표백을 방지하기 위해 신속하게 수행 될 필요가있다.
3. 슬라이스에 실온 장착 매체 1 방울을 넣고 부드럽게 플레이트의 웰에 유리 커버 슬립 놓는다. 이미징 전에 시간까지 4 ° C에서 어둠 속에서 PCLS을 유지합니다.
4. 공 초점 현미경으로 볼 때, 20 배 목표를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다. 은 "볼록 선체"설정에서 조직의 가장자리를 찾아 표시하기 위해 "타일"도구를 사용합니다. 이 타일 스캔 시간을 줄이는 데 도움이됩니다.
5. Z 축 스택 범위를 설정하는 동안, 특히 가장자리 슬라이스의 여러 영역에서 확인 설정된 범위 그적합하다.
   주 : Z-범위는 조직이 완전히 평평하게 누워에 도착하는 것은 매우 어렵 기 때문에 조직 자체의 두께보다 클 필요 전망이다. 슬라이스에 충돌 곡선을 수용하기 위해 250 ㎛의 - 예를 들어, 150 μm의 두께로 PCLS 상기 Z 스택 범위 가능성 (200)에 설정 될 필요가있다. 20 배의 대물 렌즈와 12 시간 - Z 축 스택 범위와 조직의 크기에 따라 각각의 전체 폐 스캔 (7) 사이를 취할 것이다. 각각의 폐는 고유하고 설정은 모든 실험 조정해야합니다.

PCLS 5. 라이브 세포 이미징

1. 항체 PCLS의 30 분 인큐베이션 후에, 접시의 항체 용액을 제거하고 차가운 라이 보 비츠 10 mL로 1 회 조각을 헹군다.
2. 신선한 50 μL 피펫 라이 보 비츠 - 10 커브 글라스 챔버 (8 개 슬롯)의 슬롯에 하나. , 매체에 PCLS를 전송하기 위해 주걱을 사용하여 슬라이스가 평평해질 때까지 부드럽게 조작하고 확산. 위의 절차필요 광표백을 방지하기 위해 신속하게 수행한다.
3. 피펫을 사용하여 50 μL 매체를 제거합니다. 슬라이스는 가능한 한 평면 거짓말을하는 것입니다.
   주 : 조각의 가장자리가 상기 챔버의 벽에 대해 수직으로 대칭되는 경우에 허용된다. 또한, 가능하다면, 금속 백금의 중량을 다음 단계로 진행하기 전에 슬라이스를 고정하는데 사용될 수있다. 잘라 작은 무게로 구부러 질 수 있습니다 백금 와이어의 한 예를 들어 첨부 자료 목록을 참조하십시오.
4. 4 ° C 냉장실에서 성장 인자 - 감소 된 100 μL 라이 보 비츠 10 페놀 레드없는 세포 외 기질을 100 μL를 혼합한다. 이를 위해 미리 냉각 된 피펫 팁을 사용하거나 세포 외 기질은 팁에 응고됩니다.
   주 : 매트릭스 매질이 비율 (1 : 1) 조직 배양 조건에서 PCLS을 저장하기에 충분히 조밀 한 겔을 생성한다.
5. 부드럽게 혼합하는 행렬을 피펫 조심스럽게 젤은 루의 상단에가는 것을 확인의 PCLS 위에 피펫슬라이스를 겨, 그리고 조각이 젤 상단에 뜨지 않습니다. 겔 플레이트의 바닥에 내려 PCLS 정박 중량으로 작동한다.
6. 조심스럽게 37 ℃ 배양기에 챔버 커버 글라스를 전송하고, 매트릭스 ~ 5 분 동안 응고하자.
7. 공 초점 현미경의 사전 예열 단계에 전체 챔버의 coverglass을 전송합니다. 촬상에 걸쳐 37 ℃에서 챔버를 유지한다. 라이 보 비츠의 매체를 사용하는 경우 CO ₂ 공급은 세포 배양 중에 필요하지 않습니다.
8. 프레임 간의 원하는 간격에 기초하여 상기 Z 스택 영역 및 타일의 범위를 설정한다. 공 초점 현미경으로 볼 때, 20 배 목표를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다. (예를 들어, 2 × 2를 중심으로 그리드)은 "중심 그리드"설정을 사용하여 조직에 대한 관심의 영역을 나타 내기 위해 "타일"도구를 사용합니다.
9. Z 축 스택 범위를 설정하는 동안 설정 범위가 적절한 슬라이스의 여러 영역에서 확인.
   참고 : ZR앤지 조직의 두께와 동일 할 것. 각각의 폐는 고유하고 설정은 모든 실험 조정해야합니다. 2 × 2 타일 10 Z-스택은 일반적으로 1 ~ 프레임 / 2 분을 초래할 것이다. 확인 자동 초점 기능은 촬영 기간 동안 XY 및 Z-드리프트를 최소화하기 위해 실험을 시작하기 전에 활성화됩니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

C57BL / 6 마우스에서 두 개의 DC 서브 세트들의 위치, CD11b를 ^하이 CDCS 및 CD103 ⁺ CDCS, PCLS 식별로 절단하는 CD11c 특이 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)로 염색하고, CD88, CD103 및 CD324 (E-cadherin의). CD324 얼룩기도 상피 세포에 대한 항체 및 CD88은 대 식세포와 호중구,하지만 CDCS ^(8)에 표시됩니다. 이것은 우리의 CD11c ⁺ 대 식세포에서 CDCS를 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 원래의 폐 CDCS의 두 부분 집합의 위치를 ​​시각화하기 위해 개발되었다. 그러나,이 프로토콜은 쉽게 세포 생존 및 폐의 3 차원 구조를 유지하면서, 다양한 세포 유형을 공부하고 적용 할 수 있습니다. 후자의 기능은 세포 배양 시스템에 비해 중요한 장점이다 희귀 세포 유형의 식별을 용이하게한다. 상기 방법은 폐에서 PCLS의 발생에 의존하고, 배경 얼룩을 최소화하면...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 016617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum (NRS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000