기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

요약

세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.

초록

세포 스트레스 또는 손상에 대한 응답으로 증식하는 세포는 세포 노화이라고 장기 세포주기 정지의 상태를 개시하는 특정 프로그램을 유도 할 수 있습니다. 노화 세포의 축적은 생명체의 노화와 체외에서 계속 배양을 통해 발생합니다. 노화 세포는 배아 발달, 조직 복구 및 재생, 종양 억제, 노화 등 많은 생물학적 과정을, 영향을 미친다. 노화 세포의 특징을 포함하지만, 증가 된 노화 - 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을)에 한정되지 않는다; P16의 ^INK4A, p53의, 그리고 P21 수준; γ-H2AX을 포함하여 DNA 손상의 높은 수준; 노화 관련 이질 병소 (SAHF)의 형성; 및 노화 관련 분비 표현형 (SASP), 염증성 사이토 카인 시그널링 분자의 수 분비를 특징으로하는 현상 획득. 여기, 우리가 모두 복제 성을위한 프로토콜을 설명하고DNA의 배양 세포에 노화를 유발 손상. 또, SA-β-gal을, γ-H2AX 및 SAHF 얼룩 등 여러 노화 - 관련 마커를 이용한 노화의 표현형을 모니터링하고, 세포주기 조절제 및 SASP 인자 단백질의 mRNA 수준을 정량화하는 방법을 강조. 이 방법은 다양한 모델과 조직에서 노화의 평가에 적용 할 수 있습니다.

서문

반 세기 이상 전 헤이 플릭와 동료들은 문화 확산 방법 변형되지 않은 세포를 설명하지만, 시간이 ¹ 만 한정된 기간 동안. 인간의 섬유 아 세포의 장기 배양이 확산 막을 수있는 세포를 발생; 그러나, 그들은 대사 활동했고, 이것은 세포 노화라고했다. 노화 종양 억제에 도움이 될 수 있지만,이 에이징 ^{(2, 3)에} 발생하는 회생 용량의 감소에 기여하는 것으로 생각된다으로도 불리 할 수있다. 노화 세포는 ^{4 세를} 인간과 배아 발달, 상처 치료, 조직 복구 및 나이와 관련된 ^염증이 포함 생물학적 과정의 숫자에 연루되어있다으로 조직에 축적하는 것으로 나타났다.

문화에 세포의 지속적인 계대이 연결되었습니다 복제 성 노화를 유도마찰과 게놈의 불안정성을 텔로미어합니다. DNA 손상과 암 유전자를 포함한 다양한 세포 스트레스는 또한 노화 ^3가 발생할 수 있습니다. 텔로미어 (telomere)의 감소가 아닌 다른 요인에 의한 노화는 종종 스트레스 유발 또는 조기 노화라고 일반적으로 P16의 ^INK4A / Rb는 경로 ^(5)에 따라 결정된다. 증식 있지만, 형질 전환되지 않은 세포는 일반적으로 형상 스핀들 표시, 노화 세포는 특정 특성을 갖는 평평하고 넓은 형태 증가 노화 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을) (도 1 및 2)를 포함하는 것으로 식별 될 수있다. 노화 세포는 γ-H2AX (도 3) ^(6), 및 잠재적으로 노화 관련 이질 병소 (SAHF) (도 4) ^(7)을 포함하여, DNA 손상 마커 축적된다. 노화 세포는 P를 포함하는 세포주기 규제의 높은 수준을 가지고 16 (P16의 ^INK4A) 및 / 또는 (P21) 및 p53의 (도 5) ^{(8, 9).} 또한, 최근의 데이터는 노화 세포는 염증성 사이토 카인 및 케모카인 중 다수를 분비하여 비 - 자율적 인 영향을 미칠 수있는 노화 - 관련 분비 표현형 (SASP) ^10이라고 나타났다. 이 SASP 현상이 셀 타입에 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로는 인터류킨 -6 (IL-6), IL-8, 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 성장 -의 증가에 의해 증명된다 종양 유전자의 조절 α (GRO-α), 및 β-GRO, 그 중에서도 (도 6). 노화를 유도 특정 응력이나 손상도 분비 표현형 ^{11, 12, 13에 영향을} 미칠 수있다. SASP는 ELISA를 카인 / 단백질 어레이를 사용하는 분비 단백질의 수준을 측정함으로써 검출 될 수있다S = "외부 참조"> ^{10, 14.} 전사 후 메커니즘 SASP 단백질 농도 ¹¹ 조절할 수 있지만, ^{15, 16, 17} mRNA 수준의 변화 또한 많은 경우에 검출 될 수있다. 이러한 변화는 일반적으로 더 민감하고 단백질 수준 측정보다 정량화하기 쉽다. 기타 노화 마커는 영속 DNA 손상 병소 핵 노화 (DNA-SCARS) ^(18)을 보강 염색질 변형 불려 DNA 세그먼트, 및 다양한 다른 마커 ^{3, 19, 20을} 포함하여 평가할 수있다.

여기서는 SA-β-갈, γ-H2AX, SAHF 포함한 노화 여러 마커를 측정하는 또 배양 세포에서 노화를 유도하고 공통 기술을 설명하고 senesce의 단백질 및 mRNA를NCE 분자가 회합.

프로토콜

1. 유도하는 증식 및 노화

1. 해동 저역 통과 인간의 배수체 섬유 아세포 (예를 들면, WI-38 및 IMR-90) 또는 다른 세포주.
   참고 : 여기, 사람 이배체 섬유 아세포가 사용되었지만, 이러한 프로토콜은 이러한 내피 세포, 상피, 또는 중간 엽 줄기 세포와 같은 다른 종류의 세포에서 노화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 배양 조건으로 인해 상이한 성장 속도 또는 성장 조건을 사용하는 다른 세포 유형에 대해 최적화 될 수있다.
   주 : 세포를 증식하고, 스핀들 형태를 (개략과 예 2도도 1 참조)를 가져야한다. 이상적으로는, 세포는 가능한 복제 성 세포 노화를 피하기 위해 실험 시작 30 <인구 두배 레벨 (PDL)를 가져야한다.
   1. 하기 식 PDL 로그 = N의 _F는 최종 세포 수이며 (N의 _F / N ₀₎ /은 log2를 이용하여 세포의 PDL을 계산 N _{0 시드} 셀 ^(21)의 초기 개수이다.
2. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 WI-38 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 비 필수 아미노산, 1 %의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충.
3. 10 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 DMEM에서 IMR-90 세포를 성장한다.
4. 37 ℃에서 모든 셀을 성장시키고, 5 % CO _2는 지속적으로 세포의 성장과 각 2 분할 - 80 % 합류 - 세포 ~ (70)에 도달하면 (4) D를. 광학 현미경을 사용하여 세포의 합류를 모니터링합니다. 이 억제를 접촉에 의한 세포 성장에 영향을 미칠 수있는, 높은 합류로 세포를 피하십시오.
5. 다음에서 배양 한 PDL에 변화가 없을 때, 노화 세포의 형태 학적 외관 광 현미경으로 세포를 모니터링을위한 (도 1 및 2 참조).

2. DNA 손상 - ​​유도 노화

1. 진동 셀 (예를 들면, WI-38, IMR-90, 또는 다른 세포 유형) 희소 밀도 (즉, ~ 300,000 세포 / 6cm 접시) 분석의 유형 (단백질 즉 6cm 접시 적절한 접시 / RNA 마커 또는 SA-β-gal을 염색하는 6- 웰 접시). 다음 날에 60 %의 합류 - 젊고 (<30 PDL)을 증식하고 세포가 약 50이되도록 그들을 플레이트를 사용하여 초기 통로 세포.
2. 진공에 연결된 유리 피펫을 사용하여 성장 배지를 제거하고, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)을 첨가하여 세포를 세척한다. 두 세척 총에 대해이 단계를 반복합니다. 모두 "모의"치료와 전리 방사선 (IR)에 대한 처리 조건 (A 6cm 요리에 대한 ~ 750 μL)를 PBS의 얇은 층을 추가합니다.
3. IR 10 그레이 (Gy의)의 단일 투여에 셀을 노출시키기 위해 감마 조사 장치를 사용한다; 이것은 대부분의 세포 라인에 대한 일반적인 노출이다. 후드에서 PBS를 제거하고 성장 배지로 교체하십시오. 선택적으로, B 세포와 치료2 시간 동안 20 ㎍ / mL의에 leomycin.
4. 세포에있는 모든 48 -7 2 ​​시간을 매체를 변경하고 필요한 경우 셀을 분할합니다.
5. 10 D를 IR 처리 후 - 7 노화 마커 형태 변화 (세포의 대표적인 이미지를 개략적으로도 2의도 1 참조), 분석 용 광학 현미경 하에서 세포를 모니터링.
   참고 :이 프로토콜은 IR에 의해 유도 된 노화를 설명합니다. 노화는, 블레오 마이신 (조건을 상기 참조)을 포함하는 다른 스트레스로 H ₂ O ₂ ^{(22), (23),} 화학 약품 ^(24), 담배 ^(25), 변형 성장 인자 (TGF) -β1 ^{26, 27,} 및 다른 방법 ^(21)을 유도 할 수있다 ^{, 28, 29.}

3. 염색 CEL노화 관련 β - 갈 락토시다 아제에 대한 LS

1. 염색하기 전에, 형태 학적 변화를 모니터링하는 가벼운 현미경으로 세포를 검사합니다.
   주 : 노화 세포는 일반적으로, 스핀들 형태를 (개략 대표적인 결과를도 2에 대한도 1 참조)가 세포 증식 달리 확대 평면된다. 증식 세포를 음성 대조군으로 사용할 수 있고, IR 또는 다른 DNA를 손상 제 (섹션 2 참조)로 처리 된 세포를 양성 대조군으로 사용할 수있다.
2. 상업용 키트 (재료 표 참조)에서 시약을 사용하여 SA-β-gal을 활성 정량화. 모든 시약을 녹여 37 ° C로 예열하여 실온에 가져.
   1. 염색 액 필요한 고정액 용액의 양을 계산한다.
      주 : 일반적으로, 1 mL의 부피를 6 웰 플레이트의 한 웰에 충분하다. 다른 판의 크기는 사용할 수 있지만, 6 웰 플레이트의 크기는 아입니다각 조건 중으로 분석법을 수행하기 위해 L이 적합한. 이 농도는 일반적으로 세포의 과잉 수를 사용하지 않고 계산하는 필드 당 세포의 충분한 수를 제공한다.
   2. 증류수로 염색 액의 1:10 희석.
   3. 증류수 정착액 용액 1:10 희석.
   4. 1 mL의 예 X-GAL 20 mg을, N, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF 중의 X-Gal (5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 - β-D-갈 락토)의 20 배 스톡 용액 메이크업 DMF). 키트의 사용을 최대화하기 위해, 각각의 분석에 필요한 양의 X-GAL를 측정하고 용해 DMF의 계산 된 양을 추가한다. 또한, 한 달 동안 가벼운 보호 튜브에서 -20 ° C에서 원액을 저장합니다. 희석 X-GAL 용액을 저장하기위한 전용 폴리 프로필렌 (불투명) 튜브를 사용한다.
   5. 1X 염색 용액 930 μL, 염색 보조제 (A)의 10 μL, 염색 보충 B 10 μL, 20 mg을 50 μL / ㎖ X : β-gal을 염색 액을 준비DMF에 -Gal. 염색 할 필요가 얼마나 많은 우물에 따라 마스터 믹스를 확인합니다.
3. 조심스럽게 전송 피펫 또는 동등하여 세포의 배지를 제거한다.
4. 부드럽게 PBS 1X 실온 회 세포를 세척한다.
5. 각 웰에 1 ㎖의 1X 정착액의 용액을 첨가하고 10 부화 - RT에서 15 분.
6. 전송 피펫 정착액 솔루션을 제거합니다.
   주 : 고정 제 용액 (1 배)가 2 % 포름 알데히드 및 ​​0.2 % 글루 타르 알데히드를 포함하고 실험실 안전 사무실의 권고에 따른 유해 폐기물로서 폐기한다.
7. 부드럽게 1X PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
8. 완전히 PBS를 제거하고, 웰 (1 ㎖ / 웰을 6 웰 플레이트)에 1X β-gal을 염색 액을 추가한다. (이 버퍼의 pH를 낮추고 오염에 영향을 미칠 수 있으므로 바람직 CO _2의 부재) 37 ° C의 배양기에서 48 시간 - 알루미늄 호일로 완전히 커버 플레이트 (24)와 배양한다.
   1. 염색 24 시간에 세포를 확인하고 오염이 너무 밝을 경우, 또 다른 24 시간 동안 배양.
9. 배양 시간 후, β-여자 솔루션을 제거하고 1X PBS로 교체하십시오.
   참고 :이 단계는 배경 색상의 일부를 제거 할 때 영상 또한 X-여자 솔루션의 위험한 유출을 방지 할 수 있습니다.
   참고 : 실험실 안전 사무실의 권고에 따라, 제대로 β-여자 솔루션을 폐기하십시오.
10. 10 배 또는 그 이상의 목표를 이용하여 부착 된 카메라 광학 현미경에서 세포를 검사; SA-β-gal을 양성 세포는 파란색으로 표시됩니다. 실험에 대한 이미지의 수를 취득. SA-β-gal을 양성 세포의 비율을 계산하면, 화상의 해당 번호를 취득 (> 5) 정량 웰당. 이미지 내에서 각 웰 뷰의 다양한 분야에서 겹치지 않는 것을 보장한다.
11. 총 세포 수에 비해 세포 SA-β-gal을 양성 (청색)의 수를 세어SA-β-gal을 양성 세포의 비율을 산출한다. 조건 당> 100 개 세포를 계산합니다.
    참고 : 대표 사진도 그림에 사용할 수 있습니다. 너무 많은 세포가 어려운 각 셀을 차별화하고 너무 적은 수의 정량 및 통계에 대한 세포의 충분한 수를 제공하지 않을 수 있도록으로, 그 세포 포화 상태가 계산 세포의 경우 중요합니다. .JPEG 파일도 적합하지만, .TIFF 파일로 저장 한 경우 게시를 위해 인물 사진은 최적의 해상도입니다. 컬러 이미지를 300 dpi로해야한다.

γ-H2AX 4. 염색 세포

1. 24- 웰 플레이트에 커버 글라스의 섹션 1 또는 2로부터 셀 플레이트.
2. 다음 날, 1X PBS로 세포를 씻어. 노화 세포가 커버 슬립에 잘 고착되지 않고 쉽게 세척시 제거 할 수 있기 때문에, 신중하게 씻어. 대안 적으로, 직접적으로 세척하지 않고 세포를 고정한다.
3. PBS를 제거하고 PBS에서 새로 제조 한 3.7 %의 포름 알데히드와 세포를 고정RT에서 10 분.
4. 용액을 제거하고 10 분 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면.
5. RT에서 2 시간 동안 PBS에서 5 % FBS에서 용액 블록을 제거한다.
6. 39 ° C에서 37 ° C 또는 O / N에서 2 시간 동안 / 5 % FBS에 γ-H2AX (Ser139) 및 항 - 포스 FITC 접합체와 PBS를 부화. 빛으로부터 보호합니다.
7. 60 분 - 30 합계 37 ℃에서 PBS로 6X - 3 씻는다.
8. DAPI로 염색 (희석 1 : 15,000으로 PBS) RT에서 10 분 동안.
9. PBS로 세척 배.
10. antifade 시약 5 μL - 신속 염을 제거하고 3을 이용하여 유리 슬라이드의 커버 슬립을 장착하기 위해 물로 세척한다. 대안 적으로, DAPI를 포함하는 장착 용액을 사용한다.
11. 그것을 건조 O / N하자 및 63X 대물 이상을 사용하여 형광 공 초점 레이저 주사 현미경에서 염색 된 세포를 시각화.
12. 이하의 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 γ-H2AX 병소 정량화. 형광 현미경을 이용하여 눈으로 두 프로토콜에 대한 점수. 이상적으로, 우리를개 공 초점 현미경. Z 섹션을 가지고 (도 3에 도시되어 증식 및 세포 노화에 γ-H2AX 염색 용 대표 화상) 모든 초점 검출을 시각화하기 위해서는 하나 개의 평면으로 집광. 이미징 소프트웨어를 사용하여 눈으로 초점을 카운트; 일반적으로, ~ 100-200 핵 계산 충분합니다.
    1. γ-H2AX 양성 병소가 세포의 백분율을 정량화하기 위해 DAPI 염색 핵의 전체 수에 의해 적어도 하나의 포커스 표시 및 분할을 가지고, 각 셀 카운트.
    2. γ-H2AX의 병소의 수를 정량화하기 위해 세포 당 γ-H2AX의 초점을 계산합니다.
       참고 : γ-H2AX의 수준은 노화를 유발하는 특정 스트레스 또는 손상에 따라 달라질 수 있습니다.

SAHF 마커 5. 염색 세포

참고 : 인간의 노화 세포는 종종 응축 DNA / 염색질의 핵 지역이있을 것이다. 노화 세포,이 염색질 지역에서같은 E2F 가족 구성원으로 확산 촉진 유전자의 발현을 억제하는 것으로 생각된다. SAHF은 DAPI의 개편에 의해 가시화 될 수있다; 히스톤 H3 (H3K9Me2 및 H3K9Me3)에 Lys9의 디 - 및 트리 - 메틸화 포함 이질 관련된 히스톤 마크의 존재; 및 HP1의 이질 단백질 1 (HP1)를 포함 염색질 단백질 재구성에 의해, HIRA (히스톤 리프레 A) 및 ASF1a (항 입을 함수 1A)는 ³⁰ 염색질한다. SAHF는 OIS 모델 ^(30)에서 더 눈에 띄는대로 우리는 종양 유전자에 의한 노화 모델 (OIS)를 사용하도록 선택했습니다. IDH4 세포 때문에 SV40 큰 T 항원의 존재 덱사메타손의 존재 하에서 증식하지만, 매체 ^{(31)로부터의} 덱사메타손 제거 후의 노화된다. SAHF은 DAPI 염색에 의해 위의 특정 마커에 대한 항체로 염색하여 검출 할 수있다. 여기, 우리는 visualizat에 대한 DAPI와 H3K9Me2 염색을 설명셀 ^(28)의 이온 SAHF.

1. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 1 ㎍ / ㎖의 덱사메타손 보충 된 DMEM에서 IDH4 세포 성장. 노화를 유도하기 위해, 덱사메타손을 제거하고 목탄 - 스트립 FBS를 포함하도록 매체를 변경; 이 새로운 매체에 십일 ~에 대한 성장 후, IDH4 세포는 ³¹ 노화된다.
2. 플레이트 IDH4 셀 또는 섹션 1 또는 2에서 세포는 24- 웰 플레이트에 커버 글라스에 상술.
3. 다음 날, 1X PBS로 세포를 씻어. 노화 세포가 커버 슬립에 잘 고착되지 않고 쉽게 세척시 제거 할 수 있기 때문에, 신중하게 씻어. 대안 적으로, 세척없이 직접 세포를 고정한다.
4. PBS를 제거하고 실온에서 10 분 동안 PBS에서 갓 제조 된 3.7 % 포름 알데히드로 세포를 고정한다.
5. 1X PBS로 세포를 3 회 반복한다.
6. 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면.
7. 1 배와 세포를 씻으십시오PBS. PBS를 제거하고 3 % BSA를 함유하는 블록킹 완충액을 첨가하여 커버 슬립을 차단 (W / V) RT에서 5 분 동안 PBS있다. 항상 입자상 물질을 제거하기 위해 사용하는 BSA 전에 포함 된 솔루션을 필터링합니다.
8. 차단 완충액을 제거하고 안티 H3KMe2 항체로서 SAHF 마커에 대한 일차 항체와 함께 세포를 배양한다 (도 4, 자세한 내용은 재료 표 참조). 차단 완충액을 항체 희석하고 1 부화 - RT에서 2 시간.
9. 차 항체 용액을 제거하고 PBS에서 1 % (v / v) 트리톤 X-100으로 커버 슬립을 3 회 세척 하였다.
10. 버퍼 (재료 표)를 차단하는 이차 항체를 희석하고, RT에서 1 시간 동안 배양한다. 빛으로부터 보호합니다.
11. 1X PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. RT에서 10 분 동안; DAPI와 얼룩이 (PBS 15,000 재료 표 1 참조 희석).
12. 커버 슬립이 1X PBS로 3 배 씻으십시오.
    1. 빨리 염을 제거하기 위해 물로 씻어antifade 시약 5 μL - ND 3을 이용하여 유리 슬라이드에 각 커버 슬립을 장착. 대안 적으로, DAPI를 포함하는 장착 용액을 사용한다.
    2. 건조 O / N하자 및 63X 대물 이상을 (도 4의 대표적인 결과를 참조)를 사용하여 형광 공 초점 레이저 주사 현미경에서 염색 된 세포를 시각화. 4 절에 설명 된대로 SAHF 정량화.
       주 : (즉, 단독 보조) 이소 제어 일차 항체 또는 전혀 차 항체는 면역 형광 염색에 대한 대조군으로서 사용한다.

6. 면역 블 롯팅에 의해 노화 관련 단백질을 분석

주 : 노화의 표현형 ^INK4A P16, P21 및 p53의 세포주기를 포함한 레귤레이터의 상향 조절을 특징으로한다. 이 프로토콜은 세포 용 해물에서 이러한 단백질의 수준의 정량화를 설명합니다. 이러한 기술은 다양한 이용을 유도 노화를 평가하는데 사용될 수있다방법 ^{21, 28, 29.}

1. 섹션 1, 2 또는 다른 방법 ^{21, 28, 29을} 사용하여 설명 된 것처럼 세포 노화를 유도한다. (RNA 분리 지시 7 항 참조) 6cm 접시에서 세포를 플레이트와 동시에 단백질과 RNA 양을 분석, 세포 노화 마커를 분석.
2. 세포 배양 배지를 제거합니다. 얼음 트레이에 세포를 넣습니다.
   1. 차가운 1X PBS로 세포를 2 회 반복한다. 절차에 사용되는 볼륨의 측면에서뿐만 정확하게 할 수 있도록 모든 PBS가 흡입되는 것을 보장하기 위해 접시를 기울입니다.
   2. PBS의 마지막 세척을 흡입 한 후, 접시 (a 6cm 접시에 대한) 초기 1X PBS 200 μL를 추가한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어.
   3. RNA 분리에 대한의 RNase없는 튜브에 세포 / PBS 혼합물을 피펫. 취 약 150181; 새 튜브에이 혼합물을 피펫으로의 L. 이 나누어지는 단백질 분석에 사용, 각각의 튜브에서 동일한 금액을 피펫해야한다.
3. 75에 추가하여를 Lyse는 세포 - 개질 배 램리의 샘플 완충액 (60 개 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 12.5 % 글리세롤, 2 % SDS, 5 % β 메르 캅토 에탄올 (BME), 및 브로 모 페놀 블루 100 μL은;로 구성 될 수있다 큰 일괄 분주하고 사용할 때까지 -20 ℃로) 또는 동등한 샘플 버퍼에 저장된다.
   1. 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 10 분 동안 15,000 XG에 용해 완충액 원심 분리기 100 μL - 대안 적으로, 75에서 용균. 깨끗한 튜브에 뜨는 피펫을 제거합니다. 브래드 포드 단백질 분석 또는 동등한 단백질 분석법은 단백질의 동일한 로딩되도록 용 해물을 이용할 수있다.
      참고 : 단백질 분석은 샘플 버퍼에 용해 샘플을 수행 할 수 없습니다.
   2. 해물 ~ 25 μL를 가지고 2 배 샘플 버퍼의 15 μL에 추가합니다. 최대 피펫 및 수행샘플 버퍼는 WN 용균한다.
      주 : 용해 완충액 또는 샘플 버퍼 볼륨 셀 합류점에 따라 조정될 수있다. 샘플 인해 핵 용균에 "끈적 끈적한"인 경우, 희석 더 많은 샘플 버퍼 또는 PBS를 추가합니다. 샘플은 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
4. 18 % 트리스 - 글리신 겔에서 5 열 블록에 95 ° C에서 분 (또는 이와 동등한 장비) 및 부하 시료 완충액에 용해 된 시료 ~ 40 μL를 위해 샘플을 끓인다.
   주 : 구배 겔 (4 % -15 %) 또는 14 % 트리스 - 글리신 겔은 저 분자량 단백질을 검출하기에 충분하다. 아크릴 아마이드 겔의 종류는 사용하지만, 겔 및 시스템은 저 분자량의 단백질을 검출하기위한 적절한 것을 보장 할 수있다.
   1. (적층 겔을 통해)을 20 분 동안 일정한 100 V에서 1X 런닝 버퍼를 이용하여 실행하고 염료 프론트 방금 실행 또는 겔 바닥 위에 오도록 ~ 180 V. 60 분 겔 모니터 저분자 있도록 체중 단백질 연구를하지 않습니다겔의 해제되지 않은.
5. PVDF 막에 아크릴 아마이드 겔을 트랜스퍼 (활성화 100 % 메탄올로 예비 침지). 젖은 전송을하는 경우 만 1 시간이 (1.75 시간 ~ 정상 대) 전송을 위해 필요하다. 적절한 전송 시스템에 따라 조정; 사전 스테인드 분자량 마커를 사용하여 전송 효율을 평가하는데 도움이 될 수있다.
6. 물에 막 씻으십시오. 샘플의 동일한 로딩 모니터링 할 개양귀비 빛의 얼룩을 사용합니다. 물에 떨어져 개양귀비 빛을 씻으십시오.
   1. 교반하면서 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 용 TBST에서 5 % 무 지방 건조 우유에 막 (50 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨, 및 0.1 % 트윈 -20) 차단.
7. 워시 TBST 회 도말하고 RT에서 1 시간 동안 5 % 우유 TBST (항체 희석액과 권고 재료 표 참조)에 희석 차 항체와 함께 배양한다.
8. TBST 두 빠른 세척을 수행하고 ~ 총 ~ 30 분 (대한 쉐이커에 두 번 각각이었다 15 분을 씻어H).
9. RT에서 40 분 동안 이차 항체로 인큐베이션. 단계를 반복 6.10.
10. 갓 만든 웨스턴 블롯 기판에 품어 필름을 개발하거나 화학 발광 리더에서 읽어.
11. 제 P16의 ^{INK4A 항체와} 면역 프로브 (도 5). 물을 15 분, 0.2 N NaOH로 15 분, 그리고 물을 15 분 동안 배양하여 멤브레인 스트립. 안티 P21 항체를 사용하여 단계 6.9를 계속합니다.
12. 박리 액 50 ㎖마다 새롭게 추가 BME 300 μL 62.5 mM의 트리스 -HCl pH가 6.8, 2 % SDS를 사용하여 멤브레인 스트립.
13. 30 분 동안 50 ℃에서 인큐베이션 한 후 TBS와 TBST로 광범위하게 세척 하였다. 단백질 로딩 컨트롤 항 - 액틴 또는 항 GAPDH 항체로 프로브 (도 5는 대표적인 결과를 나타낸다).
    참고 : p53의 수준은 같은 막으로 평가 될 수있다. p53의 더 높은 분자량이기 때문에, 더 나은 (낮은 비율 젤에 해결 예를 들어, 10 % 트리스 - 글리신 구배 겔 (4 % -15 %)). 다른 노화 마커 단백질 수준은 γ-H2AX 및 SAHF 마커를 포함하는 면역 용해 액에 의해 평가 될 수있다.

7. 노화 마커 mRNA의 수준을 분석

참고 : RNA를 분리 할 때, 작업 표면의 RNase 제거 솔루션 또는 이와 동등한로 청소 한 것을 확인하고 재료가 모두의 RNase없는 것을.

1. 단계 4.2 셀 / PBS 혼합물을 사용하여 30 초 동안 RNA 추출 용액 및 와류 1 mL를 넣어 (보이는 세포 덩어리 또는 파편이 없어야한다).
2. 클로로포름 200 μL를 추가하고 15 초 동안 적극적으로 흔들.
3. 4 ℃에서 15 분 동안 최대 속도 (> 15,000 XG) 원심 분리기.
4. 상부 수성층의 RNA ~ 400 μL를 제거하고 새로운 미세 원심 분리 튜브로 피펫.
5. 및 PR 4 μL (총 이전 단계에서 피펫 수층의 용적 1) 400 μL의 이소프로판올을 추가RNA의 층 ecipitant.
6. 최대 속도 (> 15,000 XG)에서 15-30 분, 39 ° C 원심 분리기는 RNA 펠렛.
7. 상청액을 제거하고 75 %의 얼음처럼 차가운 에탄올 1 mL를 첨가.
8. 최대 속도 (> 15,000 XG)와 4 ℃에서 1 분 동안 원심 분리기.
9. 최대 속도 (> 15,000 XG)와 4 ℃에서 1 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 제거한다.
10. 2 분 동안 공기 건조하고 가능한 한 많은 액체를 피펫.
11. 배 DNase의 완충액 10 μL, H ₂ O 85 μL 재 중단하고 DNase의 1/5 μL.
12. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
13. 200 μL NT2 완충액 (50mM 트리스 - 염산 pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 1 ㎜의 MgCl _2, 0.05 % Nonidet P-40)를 첨가하고, 아세트산, 페놀 - 클로로포름 _(2)의 하층 300 μL를 추가한다.
14. 최대 속도로 5 분 동안 실온에서 1 분간 원심 분리 용 소용돌이 (> 15,000 XG).
15. 상부 RNA 층 (2 × 125 μL) 250 μL를 수집 추가 253 M 아세트산 나트륨 pH가 5.2, 100 %의 얼음처럼 차가운 에탄올 625 μL, 침전제 및 5 μL의 μL. 잘 섞어서 -20 ℃에서 O / N을 석출.
16. 다음날 섞어 최대 속도 (> 15,000 XG) 30 분 동안 4 ℃에서 회전하고 상층 액을 제거한다.
17. 반복 6.8-6.11 단계를 반복합니다.
18. 사용할 때까지 -80 ° C에서 핵산 분해 효소가없는 물과 저장소의 12 μL의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    참고 : 다른 RNA 분리 절차 및 키트는 물론 사용할 수 있습니다.
19. 임의 헥사로 역전사를 수행하고 SSII는 제조 업체의 프로토콜에 따라 역전사.
    참고 : 노화 세포에서 분리 된 RNA의 낮은 양을 감안할 때, 그것은 역전사 합성 RNA (12 μL)을 모두 사용하는 것이 가장 좋습니다. 대안 적으로, RNA는 분광 광도계를 사용하여 정량 할 수 있고, 동일한 양의 RNA는 역전사를 위해 사용될 수있다.
20. 양적 qPCR에 (RT-qPCR에) amplific을 실시간을 이용하여 mRNA 수준 분석ATION 및 유전자 특이 프라이머와 SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스.
    1. 일반적인 RT-qPCR의 반응에서와 같이, (의 RNase / DNase의없는 물) cDNA를 1:30 희석하고 더 나은 피펫의 정확성을 위해 실시간 96 웰 플레이트에 3 μL를 추가합니다. 유전자 특이 적 순방향 반응 마스터 믹스를 제조 및 역방향 프라이머 (2.5 μM 농도의 5 μL / 반응을 추가), SYBR 그린 PCR 혼합물 (6.25 μL / 반응; 제조자의 권고 미만 사용)과의 RNase 5.75 μL / 20 μL (프라이머 / SYBR 그린 / 물 17 μL 및 cDNA의 3 μL)의 최종 반응 부피에 대한 DNase의없는 물.
    2. 실시간 PCR 기계를 사용하여 RT-qPCR의 증폭을 수행; 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
       참고 : 앞으로 검증 인간의 목록과 실시간 프라이머 역은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 이 유전자는 SASP 단백질 및 기타 노화 관련 마커 및 / 또는 유전자를 포함한다. IR 유도 노화 대표 결과에 나타낸다 도 6.

제 정량화 SASP 단백질 수준

1. 섹션 1 또는 2 또는 다른 방법을 사용하여를 이용하여 노화를 유도한다. (~ 250,000 세포 / 6cm 판 또는 ~ 650,000 / 10cm 플레이트) 전술 한 바와 같이, 하나 또는 6 개 10cm 플레이트상에서 세포를 접시.
2. 어느 6cm 또는 5 ㎖에 대해 (2.5 mL의 셀 (10) (D) 후의 IR 처리 또는 복제 성 노화 세포 (적절한 대조군 세포)와 함께, 1X PBS로 세포를 세 번 세척하고 소량의 항생제와 무 혈청 배지를 추가 10cm의 경우).
3. 조직 배양 인큐베이터에서 CO _2, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, 5 _%. 다음 날, 매체를 수집하고 얼음에 원뿔 튜브에 넣어.
4. PBS로 세포를 2 회 반복 한 다음 (a 6cm 요리 용) 트립신 1 ㎖를 추가한다. 이후 세포 수에 따라서 농도 조정을 이용하여 혈구 세포를 카운트.
5. 원심 300 × g으로 5 분 동안 매체.
6. FILTER 배지 0.45㎛의 시린지 필터를 사용.
7. 직접 ELISA 또는 동등한 분석법을 사용하여 이용 또는 분석 할 때까지 -80 ℃에서 동결 배지 나누어지는.
8. 수집 된 매질의 총 세포 수 / 부피를 취하여 / ㎖ 농도 세포의 수를 계산한다.
9. 제조업체의 지침에 따라 적절한 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행합니다. IL-6, IL-8, GROα, 기타 사이토킨 / 케모카인 (도 6B)에 대해 분석하는 추천 ELISA 키트 용 재료 표 참조.
10. 측정 요소는 ELISA 키트의 선형 범위 내에 있도록하기 위해, 세포 증식 배지에 비해 노화 된 세포 배지 희석액을 만든다. 이 희석 및 IL-6의 양을 산출 부피를 차지한다. 일 셀당 분비 된 IL-6의 양을 확보하기 위해, 희석 mL의 세포 농도 별 (PG)에서 상기 키트로부터 얻어진 IL-6의 값을 계산 (FROM 단계 7.8).
    주 : 이러한 사이토 카인의 어레이와 같은 다른 방법으로는, SASP 단백질 수준을 검출하는데 사용될 수 SASP 인자 다수의 선별에 적합 할 수있다. SASP 인자 단백질 수준은 노화 유도, 세포 유형 또는 유도 된 노화의 종류 후의 시간에 따라 달라질 수있다.

결과

6 SA-β-gal을 염색에서 대표적인 결과를 보여준다 - 2도 γ-H2AX 및 SAHF위한 염색; P16의 ^INK4A, P21 및 p53의 단백질 수준의 평가; 및 mRNA의 노화와 관련된 분자의 단백질 수준. 증가 된 SA-β-gal을 염색 및 복제 성 DNA 손상 - ​​유도 노화 발생. 또한, 노화와 함께 일어나는 형태 학적 변화를 관찰한다. 세포는 섬유 아세포 증식 스핀들 외관에 비해 확?...

토론

여기에서는 인간의 배수체 섬유 아세포를 이용하여 복제 성 및 DNA 손상 - ​​유도 노화에 대한 방법을 설명 하였다. 또한, 다양한 단백질 및 노화 관련 단백질의 mRNA 수준을 정량화하기위한 기술이 포함될뿐만 아니라, 염색 SA-β-gal을위한 상기 DNA 손상 - ​​마커 γ-H2AX위한 것이다. 많은주의가 생체 ^(20)에 노화의 특성이 존재하지만,이 프로토콜은 널리 생체 외 및

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Tris-glycine gels	Invitrogen	XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A11031	1:300 dilution
Cell lifters	Corning Inc.	3008	Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibody	Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Molecular Probes	MP01306	stock 5 mg/mL in dH2O
GAPDH antibody	Santa Cruz	sc-32233	1:1,000 - 5,000 dilution
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody	Abcam	1220	1:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D8000C
Human GROa Quantikine ELISA assay	R&D systems	DRG00
N-N-dimethylformamide	Sigma	D4551	DMF
p16 monoclonal antibody	BD Biosciences	51-1325gr	1:500 dilution
p21 monoclonal antibody	Millipore	05-345	1:750 dilution
p53 monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-126	1:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody	Cell Signaling	9719	1:2,000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Pre-stained molecular weight markers	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
PVDF membrane	Thermo Scientific	88518
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028