쌍된 구슬 및 Microwells 가변 오목한 형상의 성형에 대 한 자석 배열

요약

이 원고는 복잡 한 높은 비용 시설에 대 한 필요 없이 오목 microwells 조작 하는 강력한 방법을 소개 합니다. 자기 힘, 강철 구슬, 및 구멍을 통해 배열을 사용 하 여, 몇 백 microwells 3 c m x 3 c m입니다 (PDMS) 기판에 형성 되었다.

초록

회전 타원 체 문화는 vivo에서제공 한다는 세포 행동을 이해 하기 위한 유용한 도구입니다-3 차원 환경 처럼. 다양 한 회전 타원 체 생산 방법 비 접착 표면, 스피너 플라스 크, 매달린 방울 및 microwells 셀 상호 작용, 면역 활성화, 심사, 마약의 연구에 사용 된 줄기 세포 분화 및 organoid 세대. 이러한 방법 중에서 3 차원 오목 형상 가진 microwells 과학자와 엔지니어, 균일 크기의 회전 타원 체 생성 및 개별 spheroids의 응답 될 수 있는 용이성의 그들의 이점을 주어진의 관심을 얻고 있다 모니터링. 유연한 막 및 얼음 리소 그래피의 사용과 같은 비용 효율적인 방법을 제안 되었습니다, 비록 이러한 기술을 높은 종횡비의 공적 및 생산의 패턴 크기 조절에 어려움 등 심각한 단점이 발생 microwells의 더 큰 지역입니다. 이러한 문제를 해결 하려면 복잡 한 높은 비용 시설에 대 한 필요 없이 오목 microwells 조작 하는 강력한 방법을 제안 한다. 이 방법을 활용 하 여 30 x 30를 통해 구멍 배열, 몇 백 마이크로미터-주문 강철 구슬, 및 3 c m x 3 c m입니다 (PDMS) 기판에 900 microwells 조작 하 자기 힘. 세포 생물학 응용 프로그램을 우리의 방법의 적용을 보여 우리는 3 일에 대 한 지방 줄기 세포를 배양 하 고 성공적으로 우리의 microwell 플랫폼을 사용 하 여 spheroids를 생산. 또한, 우리는 그것에 의하여 자기 힘을 통해-구멍에 강철 구슬 트랩 사용 메커니즘을 조사 하는 magnetostatic 시뮬레이션 수행. 우리는 제안 된 microwell 제조 방법 약물 검사, 조직 재생, 줄기 세포 분화, 암 전이 등 많은 회전 타원 체 기반 세포 연구에 적용할 수 있습니다 믿습니다.

서문

회전 타원 체 모양으로 성장 하는 세포는 2 차원 평면 문화¹보다 본문에 실제 조직에 더 비슷합니다. 이 이점을 감안할 때, spheroids 사용 하 여 셀에 셀 상호 작용^2,3, 면역 활성화⁴,⁵및 차별화⁶심사 약 연구를 개선 하기 위해 채택 되었습니다. 또한, 여러 셀 유형을 통합 하는 spheroids는 최근 organoids (근처 생리 3 차원 (3D) 조직), 인간 개발 및 질병⁷공부에 대 한 매우 유용한에 적용 되었습니다. 여러 가지 방법 spheroids을 생산 하기 위해 사용 되었습니다. 간단한 방법은 서로와 양식 spheroids 셀 집계 되도록 비 접착 표면에의 활용을 포함 한다. 페 트리 접시 소 혈 청 알 부 민, pluronic F-127, 또는 그것의 표면 비 접착제^89을소수 성 고분자 (예: 폴 리 2 hydroxyethl 메타 크리 레이트) 치료 될 수 있습니다. 회전자-플라스 크 방법은 spheroids^10,11의 다량 생산의 또 다른 잘 알려진 수단입니다. 이 방법에서는, 세포는 기판에 부착 되 고에서 그들을 방지 하기 위해 교 반에 의해 서 스 펜 션에서 개최 됩니다. 대신, 부동 집계 양식 spheroids 세포. 비 접착 표면 방법 및 회전자 플라스 크 방법 spheroids의 큰 금액을 생성할 수 있습니다. 그러나, 그들은 회전 타원 체 크기 뿐만 아니라 추적 제어와 각 회전 타원 체의 모니터링을 포함 하 여 제한 될 수 있습니다. 같은 문제, 다른 회전 타원 체 생산 방법에 대 한 구제 수단으로 서 즉, 교수형 드롭 방법 고용된¹²될 수 있습니다. 문화 접시의 뚜껑의 밑바닥에 세포 현 탁 액 방울을 입금 해야 합니다. 이러한 방울 일반적으로 크기에서 15 ~ 30 µ L 이며, 약 300 ~ 3000 셀¹³를 포함. 뚜껑을 거꾸로 때 물방울 표면 장력에 의해 장소에서 개최 됩니다. 각 드롭에 microgravity 환경 다음 무료 액체 공기 인터페이스에서 단일 spheroids 형성 세포에 집중 한다. 교수형의 혜택 드롭 메서드는 추적 하 고 모니터링 각 회전 타원 체 비 접착 표면 및 회전자 플라스 크 방법에 상대적으로 쉬운 반면 잘 제어 된 크기 분포, 제공. 그러나이 메서드 spheroids 및 생산 과정 자체의 대규모 생산은 지나치게 노동 1 개의 불리를 초래 하는, 집중.

Microwell 배열은 아파트 많은 마이크로 크기 웰 스, 직경 100에서 1000 µ m에 이르는 데 각 접시. Microwells를 사용 하는 경우 회전 타원 체 생산 원리는 비 접착 표면 메서드의 비슷합니다. 장점은 microwells 셀 또는 spheroids, 그것은 또한 쉽게 각 단일 회전 타원 체를 모니터링 하는 동안 회전 타원 체 크기를 제어 하기 쉬운 그런 분리를 위한 microwells 사이 공간을 제공 하는 사실. Microwells의 다 수, 높은 처리량 회전 타원 체 생산도 가능 하다. Microwells의 또 다른 장점은 다양 한 도형 형태 웰 스 옵션입니다 (육각, 원통형, 로그인 프리즘) 사용자의 독특한 실험 목적에 따라. 그러나 일반적으로,, 3 차원 (3D) 오목한 (또는 반구형) 모양 제복 크기의 단일 spheroids 생산을 위한 가장 적합 한 것으로 간주 됩니다. 따라서, 오목 microwells의 유용성 보고 되었습니다 검토 하는¹⁴, 배아 줄기 세포 cardiomyocyte 차별화 등 많은 세포 생물학 연구에 대 한 작은 섬 세포의 인슐린 분 비¹⁵, 클러스터는 hepatocytes¹⁶, 그리고 종양 spheroids¹⁷의 약물 내성의 효소 활동.

불행히도, 종종 microwells의 제조 필요 전문된 micropatterning 시설; 기존의 포토 리소 그래피 기반 방법 플라즈마와 이온 빔 장비를 필요 하는 반응성 이온 에칭-기반 방법 노출 및 개발 시설 필요 합니다. 이러한 장비는, 복잡 한 제조 공정에 함께 선물 항목에 높은 장벽이 microtechnology에 대 한 액세스 권한이 없는 생물학에 대 한 비용이 많이 드는. 이러한 문제를 해결 하려면 다른 비용 효율적인 방법을 같은 얼음 리소 그래피¹⁸ (냉동된 물 방울을 사용 하 여) 하 고 (막, 스루홀 기판 및 진공을 사용 하 여) 유연한 막 방법¹⁴ 제안 되었습니다. 그러나, 이러한 방법 또한 패턴 크기, 높은 종횡비의 달성 및 더 큰 지역 microwells의 생산을 통제 하기 어려운 되 고 같은 심각한 단점이 발생 합니다.

위의 문제를 해결 하려면 우리 소설 오목 microwell 제조 방법은 스루홀 기판, 강철 구슬, 자석 배열 활용 제안 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여, 오목 구면 microwells의 수백 포스를 이용한 자석 자동 폐쇄 금속 구슬 (그림 1)의 메커니즘을 활용 하 여 날조 될 수 있다. 제조 공정 거의 복잡 하 고 비싼 시설의 사용을 포함 하 고 많은 고급 능력을 요구 하지 않습니다. 따라서, 심지어 미숙한 사람이 제조 방법을 수행 쉽게 수 있습니다. 설명 하기 위해 제안된 된 방법, 인간 지방 유래 줄기 세포 생산 spheroids 오목 microwells에서 경작 되었다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 구멍을 통해 배열 알루미늄 판과 자석 배열 준비

1. 준비 하는 2 개의 50 m m x 50 m m (또는 더 큰) 알루미늄 플레이트. 각 플레이트의 두께 구슬 직경의 절반은 300 µ m 이었다.입니다.
2. Φ550 µ m 마이크로 드릴 조금 30 m m/s 하락 속도와 스핀 들 속도 8000RPM CNC 로타리 조각 사를 사용 하 여 알루미늄 접시 중 하나에서 30 x 30을 통해 구멍 배열을 형성 한다. 각 구멍 (센터에 센터) 사이의 거리는 1 m m (그림 1a 및 그림 2a, 나) 이었다.
3. 다른 알루미늄 접시에, 1.2 (그림 1a 및 그림 2a, ii)에 설명 된 것과 동일한 절차를 사용 하 여 구멍을 통해 Φ750 µ m의 30 x 30 배열을 형성 합니다.
4. 스티커 테이프를 사용 하 여 서로 두 접시를 연결 하 고 Φ3 mm 맞춤 구멍 두 알루미늄 판의 네 모서리의 각을 형성.
5. 12 h 그들의 표면 청소를 위해 15% 황산 알루미늄 플레이트를 담근 다. 때문에 알루미늄의 표면에 알루미늄 산화물의 얇은 층에 게 저항 하는 부식, 구멍 직경 및 판의 두께이 산 성 처리에 의해 변경 되지 않습니다.
6. 30 × 30 배열 1 x 1 x 1 m m 네오디뮴 자석 (0.363 N의 자석 힘)을 형성 한다. 각 자석 이웃에 반대 극성 인지 확인 합니다. 속보 또는 자석 배열의 산란을 방지 하기 위해, 자석 배열 더블 양면 테이프 (그림 2a, iii와에 삽입 된 그림 2)를 사용 하 여 아래쪽으로 30 x 30 m m 알루미늄 플레이트를 연결 합니다.

2. 구슬 트랩 프로세스

1. 정렬 하 고 스택 두 알루미늄 접시 (접시 탑: 750 µ m 구멍 판, 바닥판: 550 µ m 홀 플레이트) 준비 맞춤 구멍을 사용 하 여 각 접시 (그림 1b)의 네 모퉁이에서.
2. 정렬 구멍에 M3 볼트를 삽입 하 여 두 접시를 함께 고정 하 고 고정 볼트와 너트 (그림 1b).
3. 알루미늄 플레이트 어셈블리 (그림 1b, 2b, 2 c) 준비 자석 배열에 스택. 쌓기 과정에서 자석의 배열 및 알루미늄 플레이트에 구멍의 배열을 맞춥니다. 다음 끈 적 테이프를 사용 하 여 자석 배열 위치를 해결 하기.
4. 충분 한 수 Φ600 SUJ2 철강의 플레이트 어셈블리에 비즈 고 아크릴 (또는 비-금속)를 사용 하 여 구슬을 조작 같은 구슬 동안 각 구멍 (그림 1c, 1d, 1e)에 동시에 갇혀 된다 접시 제거 하지 구멍에 박 혀 있는 초과 구슬.
5. 조심 스럽게 제거 원치 않는 산란과 갇혀 구슬 (그림 1 층)의 탈을 피하기 위해 상단 플레이트.

3. 오목 microwell 제조

1. 오목 microwell 형, 페 트리 접시 위에, 단계 2.1 ~ 2.5에서에서 생산을 이동 합니다.
2. PDMS 단위체입니다 (PDMS) 단위체와 제조 업체의 지침¹⁹ 에 따라 경화제 혼합: 경화 에이전트의 비율은 10:1.
3. PDMS 혼합물에 갇혀 모든 거품을 제거 하는 desiccator 및 진공 펌프를 사용 하 여 탈 가스 PDMS 혼합물.
4. 오목 microwell 형으로 PDMS 혼합물을 부 어와 드 가스 3.3 (그림 1 층)에 설명 된 것과 동일한 절차를 사용 하 여 다시.
5. 구슬 포함 된 PDMS 기판 (그림 1 g)를 2 시간에 80 ° C에서 열판에 PDMS 혼합물을 구워.
6. 치료 PDMS 기판 형 (그림 1 g)에서 제거 합니다. 제거 과정에서 메탄올 세척 병을 사용 하 여 금형에서 PDMS 기판 분리 하 스프레이.
7. M m x 2mm 자석 Φ15를 사용 하 여, PDMS 기판 (그림 1 h)에서 갇혀 강철 구슬을 제거 합니다. 이 프로세스에 대 한 PDMS 기판에서 구슬 추출 하 충분히 강하다 어떤 자석 사용할 수 있습니다.

4. 회전 타원 체 문화

1. 이 연구에서 24-잘 접시에 장착 Φ14 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 오목 microwell 꽃무늬 PDMS 기판 절단.
2. 결과 Φ14 m m PDMS 기판 121 ° C와 15 psi에서 고압 소독 기에 소독.
3. 멸 균된 PDMS 기판을 24 잘 접시에 놓습니다.
4. Microwell 표면에 세포 부착을 방지 하기 위해 하룻밤 사이 4% (w/v) pluronic F-127 솔루션 전체 PDMS 기판 코트. 코팅 과정 pipetting 하거나 초음파 세탁 기술자를 사용 하 여 오목 microwells에 갇힌 모든 기포를 제거 합니다.
5. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 F-127 솔루션 세 번을 플러시.
6. PDMS 기판에 셀-매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간) 솔루션 (2 x 10⁶ 셀 포함) 하의 1 mL 씨앗 Note 시드 밀도 대상 회전 타원 체 크기 및 대상 셀 형식에 따라 변경 될 수 있습니다. 여기, 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 사용 되었다.
7. Microwells (그림 3)에 갇혀 있던 어떤 과잉 세포를 제거 하는 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 매체의 1 mL 발음
8. 36.5 ° c, 습도의 세포를 품 어 > 95%와 5% CO₂ 상태. 우리의 연구에 사용 된 ASCs 경우 셀 48 h에서 회전 타원 체를 집계.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

볼록 형 및 microwell 패턴 성공적으로 다음 단계 2.1 3.7에 의해 조작 했다. (그림 4)입니다. 상업 강철 구슬 30 x 30을 통해 구멍 배열에 갇혀 있었다. 구슬 구슬 및 해당 통해-구멍 (그림 4a) 사이 간격 없이 밀접 하 게 개최 했다. 조작된 오목 microwell의 모양 강철 구슬 (그림 4b)의 동일은 600 µ m의 직경을 가진 반구...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 제조 방법은 직면 주요 도전 알루미늄 플레이트의 구멍을 통해 배열에 구슬의 보안 수정 했다. 이 문제를 해결 하기 위해 30 x 30 자석 배열 형식에서 자력 구슬을 안전 하 게, 그림 6 과 7에서 같이 해결 하기 위해 사용 되었다. 자 속 밀도 반대 극성, 자석 배열의 각 자석 표면의 중심에 강한입니다. 자기 힘의 강도 자 속 밀도에 따라 달라 집니다, 때문에 그들은 위치에 열...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011