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요약

여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.

초록

수상 돌기는 흥분성 시냅스를 포함하는 신경 돌기 샤프트의 돌기입니다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변이는인지 및 기억 형성에 관여한다. Golgi 염색에 대한 몇 가지 접근법이 있으며, 모두 수지상 세포의 형태 학적 특성을 결정하고 명확한 배경을 생성하는데 유용합니다. 현재 Golgi-Cox 방법 (상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형)은 비교적 낮은 용량의 화학 요법 약물 인 5- 플루오로 우라실 (5-Fu)이 수지상 형태에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다 , 척추의 수 및 해마 안의 정강이 형성의 복잡성과 관련이 있습니다. 5-Fu는 수지상 복합체를 상당히 변조 시켰고, 해마 전역에서 척추 밀도를 영역 특이 적 방식으로 감소시켰다. 제시된 데이터는 Golgi 염색 방법이CA1, CA3 및 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 성숙한 뉴런을 fectively 염색했다. 이 프로토콜은 각 단계의 세부 사항을보고하여 다른 연구자가 뇌 전체에 걸쳐 조직을 안정적으로 얼룩지게하고 고품질의 결과와 최소한의 문제 해결을 가능하게합니다.

서문

Dendrites는 presynaptic 입력을 받아 처리하는 뉴런의 가장 큰 부분입니다 1 . 그들의 수지상 프로세스는 복잡한 기하학을 가지고 있는데, 근위부 가지가 원위부 가지보다 더 큰 직경을 가지고 있습니다. 수상 돌기가 발달함에 따라 돌기 arborization이라고하는 과정에서 다른 뉴런과 여러 연결을 형성합니다. 이 분기의 범위와 패턴은 수상 돌기가 적절하게 처리 할 수있는 시냅스 입력의 양을 결정합니다 2 .

수상 돌기 arborization은 활동 의존성 소성과 연결 회로의 적절한 개발을 위해 필요한 과정입니다. 확장, 후퇴, 분지 및 시냅스 생성은 내인성 유전 프로그램 및 외인성 요인으로부터의 영향을 포함하는 복잡한 과정이다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변화는인지 및 기억 형성에 관련되어있다돌기 복잡성의 변화는 병리 생리학 및 행동 변화와 관련이있다 5. 이상은 X- 증후군 및 다운 증후군을 포함한 여러 질병 상태와 관련이있다.

수상 돌기 (dendritic spines)는 중추 신경계 내에서 흥분성 입력을받는 돌기 아버의 특화된 세포 내 구획입니다. 각 계통의 크기와 모양에 따라 3 가지 형태의 계통 분류가 있습니다. 1) 버섯 계통은 다른 계통보다 글루타메이트 수용체가 많은 복잡한 계피 밀도를 가지고 있습니다. 2) 줄기가없는 멍한 등뼈; 3) 길고 좁은 줄기와 구상 머리로 구성된 얇은 등뼈 8 . 돌기 척추 부피는 부분적으로 사용되어 얇은 척추가 일반적으로 더 작습니다 (0.01 μm 3 )를 버섯 등뼈 (0.8 μm 3 )와 비교 9,10 . 등뼈는 성숙과 함께 안정됩니다. 예를 들어, 얇은 등뼈는 며칠 후에 수축되거나 버섯 등뼈로 발전합니다. 양자 택일로, 버섯 등뼈는 상대적으로 안정하고 오랜 기간 생존 할 수 있습니다. 연결 연결의 강도는 등뼈 및 / 또는 그들의 볼륨 11,12,13의 수를 기반으로 생각됩니다.

고전적인 Golgi 염색 방법과 그보다 현대적인 변형 모두 돌기의 척추 형태와 밀도를 검사하는데 유용합니다. Golgi 염색의 한 가지 독특한 측면은 무작위로 총 뉴런의 약 5 %를 얼룩이 지므로 개별 뉴런의 추적이 가능합니다 14 , 15 . 골지기의 정확한 메카니즘얼룩 개별 뉴런은 여전히 ​​알려져 있지 않습니다, 방법의 원리는은 크로메이트 (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 의 결정화를 기반으로합니다. Golgi 방법에는 세 가지 주요 유형이 있습니다 : 빠른 골지, Golgi-Cox 및 Golgi-Kopsch 18 , 19 . 세 가지 방법 모두 몇 일에서 몇 달 동안 크롬 염에서 초기 인큐베이션 단계로 시작하지만 몇 가지 주요 차이점이 있습니다. 빠른 Golgi는 첫 번째 단계에서 오스뮴 tetroxide를 사용하는 반면, Golgi-Kopsch는 paraformaldehyde를 포함합니다. rapid-Golgi와 Golgi-Kopsch에서의 염색은 약 7 일 동안 1 ~ 2 % 질산은 용액에서 배양한다. Golgi-Cox 방법은 질산은 대신에 염화 수은과 중크롬산 칼륨을 사용하며 2 ~ 4 주간의 함침 시간이 있습니다. 그 다음 조직을 절편 화하고 희석 된 암모니아염료를 제거하기위한 사진 용 정착액이 뒤 따른다. 세 가지 유형 중에서 골지 - 콕스 (Golgi-Cox) 방법은 배경 간섭이없는 돌기 아버를 염색하는 데 가장 좋은 것으로 여겨지는데 부분적으로는 크리스탈 아티팩트가 조직 표면에 발생하지 않기 때문에 (빠른 골지 방법과 달리) 17 , 20 , 21 .

현재의 방법은 상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형이며 5-Fu의 비교적 적은 양이 수지상 형태 학적 특성 및 척추 밀도에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다. 획득 된 모든 데이터는 화학 요법 치료가 어떻게 신경 회로에 영향을 미치는지에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

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프로토콜

실험은 UAMS 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인 한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다.

1. 동물과 5-Fu 주사 패러다임

  1. 6 개월 된 수컷 C57Bl6 / J 야생형 마우스를 구입하여 1 살이 될 때까지 일정한 12 시간의 명암주기하에 보관하십시오.
  2. 0.9 % 살균 식염수로 5 푸를 희석하십시오. 마우스 당 필요한 용량으로 60 mg / kg을 사용하십시오.
  3. 5-Fu의 복강 내 주사를 주십시오 (3 주 동안 1 주일에 한 번).
    1. 매일 같은 시간에 복강 내 주사를합니다. 예를 들어, 0900-1200 시간.
  4. 동물을 안락사시키고 마지막 주입 후 30 일 동안 두뇌를 추출하십시오.

2. 안락사 절차 및 뇌 추출

  1. 설치류를 억제하고 꼬리의 바닥을 잡아. 다른 한편으로, 엄지 또는 첫 번째 손가락을 th설치류 목의 바닥. 설치류의 목에 신속하게 압력을 가하고 꼬리를 잡고있는 다른 손이 뒤로 당기는 동안 앞으로 밉니다.
  2. 한 손으로 설치류를 잡고 다른 한 손으로 대형 수술 가위를 잡으십시오. 두 블레이드 사이에 설치류의 목을 놓고 신속하게 머리를 참견하십시오.
  3. 절단 된 마우스 헤드를 가져 와서 눈 위까지 두개골 위의 털을 다듬을 때 미세 가위를 사용하십시오. 그런 다음 가위 끝을 각 아이 소켓에 넣고 약간의 힘으로 가위를 닫으십시오.
  4. 소용돌이를 사용하여 두개골을 소뇌의 좌우로 자른다.
  5. 포셉을 사용하여 소뇌를 둘러싼 두개골 부분을 직접 들어 올리거나 떼어냅니다.
  6. 두개골의 midsagittal 라인을 따라 잘라 봄 가위를 사용하십시오.
  7. 포셉을 사용하여 두개골의 나머지 부분을 두뇌에서 들어 올리십시오.
  8. 주걱과 프로브를 사용하여 두뇌를 원하는 용기에 넣으십시오. 스테인리스 사용teel 블레이드, midsagittal 비행기를 따라 각 뇌를 잘라. 오른쪽 반구에 다음 Golgi-Cox 방법을 수행합니다.

3. Golgi 염색 및 조직 준비

  1. 갓 수확 한 반뇌를 10 mL 원뿔 튜브에 5 mL 염화 수은 기반 용액 (키트의 용액 A)에 담그십시오. 염화 수은 용액은 빛에 민감합니다. 호일로 튜브를 덮으십시오. 샘플을 실온에서 어둡게 보관하십시오.
    참고 : 솔루션 A는 표에 나와있는 키트로 제공됩니다. 주의! 용액 A (염화 수은 용액이라고도 함)에는 중크롬산 칼륨, 염화 수은 및 크롬산 칼륨과 같은 독성 시약이 포함되어 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
  2. 1 일 후, 용액을 일시적인 용기 (예 : 대형 계량 보트)에 천천히 방울을 옮겨 생물학적 유해 폐기물 용기에 버리십시오. 두뇌 (원래 10 ML 원뿔 튜브에 여전히) 5 ML과염화 수은 용액에 넣고 샘플을 실온에서 13 일 더 어두운 곳으로 되돌립니다.
  3. 증류수 또는 탈 이온수 (dH 2 O) 90 mL에 30 g의 함침 완충액을 넣는다. 6 잘 접시의 각 우물은 6.5 ML의 게시물 주입 버퍼, 하나의 우물 당 두뇌를 채우십시오
    참고 : 사후 주입 버퍼는 표에 나와있는 키트에 들어 있습니다.
    1. 염화 수은 용액에서 (총) 14 일 후 dH 2 O로 조직을 헹구십시오. 그런 다음 post-impregnation buffer가있는 6-well plates로 옮깁니다. 호일로 판을 덮고 어두운 곳에서 실온에서 보관하십시오.
  4. 침지 1 일 후 사후 침투 완충액을 피펫 팅하고 신선한 사후 침투 완충액으로 갱신한다. 실온에서 어두운 곳에서 1 일 동안 보관하십시오. 필요한 경우 4 ° C에서 최대 1 개월 22 동안 보관하십시오.

4. 섹션

  1. 뚜껑의 12- 웰 플레이트에 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위에서 아래로 숫자가 오름차순으로 레이블을 붙입니다.
  2. 전체 뇌를 절단하는 경우 뇌 당 2 ~ 3 개의 12- 웰 플레이트를 준비하십시오.
    1. 각 12 웰 플레이트 뚜껑의 상단에 분류 번호가 매겨진 뇌를 표시하십시오.
    2. 각 플레이트의 각 우물에 1X PBS 2 ML 피펫.
  3. 스테이지를 설정하고 vibratome을 켜십시오. 조직에 충분한 1x PBS가 있는지 확인하십시오.
    1. 플라스틱 파라핀 필름 두 장을 자르고 두 번 접습니다. 시편 홀더 손잡이의 구멍에 올려 놓고 1x PBS가 카운터에 새어 나오지 않도록하십시오.
    2. 시편 홀더의 티슈 블록에 테이프를 붙이고 시아 노 아크릴 레이트 접착제 접착제 (재료 표 참조)를 올려 놓으십시오.
  4. 6 - 웰 플레이트에서 두뇌를 제거하고 플라스틱이나 유리 접시에 놓습니다. 스테인리스 사용소뇌의 약 절반을 자르는 강철 양날 칼날.
    1. 소뇌를 꼬리로 자른다. 남아있는 소뇌 부분이 균일한지 확인하십시오.
  5. 즉시 접착제에 남은 소뇌의 평평한 표면을 놓으십시오.
    참고 : 조직 (대뇌 피질)의 지느러미 부분은 블레이드에 대해 왼쪽이나 오른쪽을 향해야합니다. 이전에 부착 된 후각 구를 포함하고 있던 주둥이 끝은 위쪽을 향해야합니다.
    1. 접착제가 완전히 마르도록 적어도 몇 분 정도 기다리십시오.
  6. 두뇌를 고정시키고있는 접착제가 건조되는 동안 1x PBS를 시험편 배스에 붓습니다. 접착제가 마른 후에, 표본 홀더를 조직과 함께 시험편 배스에 넣으십시오.
    1. 조직 샘플이 완전히 덮여 있지 않으면 표본 욕조에 1x PBS를 더 붓습니다.
  7. vibratome의 블레이드 홀더에 날을 장착하고 천천히 l블레이드가 1x PBS에 완전히 잠길 때까지 블레이드를 시험편 배스에 넣으십시오. 조직 상단보다 약간 아래쪽에 올 때까지 블레이드를 계속 낮 춥니 다.
  8. vibratome 속도를 7, 진폭을 6, 절단 각도를 12 °로 설정하십시오 (vibratome 모델의 재료 표 참조). 진동을 시작하고 200 μm 구간을 자릅니다 23 .
    1. 큰 그림 붓을 사용하여 조직 섹션을 표본 욕조에서 12 개의 웰 플레이트의 지정된 각 웰로 이동하십시오.
  9. 원하는 수의 조직 절편에 도달 할 때까지 조직 절개를 계속하십시오.

5. 포스트 염색법

  1. 다음의 각 염색 단계 및 헹굼물마다 웰당 지시 된 용액 2 mL를 사용한다. 전동 피펫 필러 (물질 표 참조)를 사용하여 용액을 우물로 옮긴다. 용액을 적당한 곳으로 옮기고 적절한 쓰레기로 옮기려면 전송 피펫 (재료 표 참조)을 사용하십시오컨테이너.
  2. 0.01M PBS-T로 30 분간 1 회 씻으십시오 (0.01 M PBS 1,000 mL에 세제 3.0 mL를 넣으십시오).
  3. 사용 직전에 dH 2 O로 수산화 암모늄 용액 (주의) 3 : 5를 희석하십시오. 희석 된 수산화 암모늄 용액에서 19-21 분 동안 부분을 염색합니다.
    1. 감광성 수산화 암모늄 용액을 호일로 보호하십시오.
      참고 : 용액 내의 수산화 암모늄은 ~ 10 % 농도이며 "위험한"것으로 분류됩니다. 수산화 암모늄 용액은 피부에 접촉하면 화상을 입을 수 있습니다. 흡입하면 호흡기도 자극을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
  4. 포스트 얼룩 버퍼 (500 ML dH 2 O에 시약 D 90g을 추가)에 섹션을 19 ~ 21 분 동안 얼룩. 포스트 염색 완충액은 빛에 민감합니다. 호일로 보호하십시오 22 .
  5. 세 부분을 헹구십시오.0.01 M PBS-T를 5 ~ 10 분 세척 하였다.

6. 설치, 청소 및 덮음

  1. 큰 붓으로 1 % 젤라틴 코팅 슬라이드에 섹션을 마운트하십시오. 실온에서 20-30 분 건조시키고 밤새 코플린 병에 넣으십시오.
  2. Coplin 항아리에서 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 꺼내 플라스틱 랙에 넣으십시오 (재료 표 참조). 플라스틱 랙을 100 % 에탄올이 들어있는 얼룩 접시 (재료 표 참조)에 넣습니다. 5 분 세 번 씻어서 탈수하십시오.
  3. 99 % 크실렌으로 5 분씩 두 번 씻으십시오. 슬라이드를 유리 선반에 놓고 랙을 금속 손잡이가있는 크실렌이 들어있는 유리 얼룩이 진 접시에 내려 놓으십시오 (재료 표 참조).
    참고 : 크실렌은 흡입하면 유해하며 피부에 닿으면 자극을 유발합니다. 그것은 액체 및 증기 상태에서 매우 가연성입니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
  4. 슬라이드를 xyl에서 꺼냅니다.한 번에 하나씩 주입하고 약 0.25 mL의 장착 매체로 조직을 신속하게 덮습니다 (재료 표 참조). 그런 다음 슬라이드 커버를 잡고 미디어 위에 올려 놓습니다.
    1. 슬라이드 덮개 아래의 갇힌 기포를 페인트 브러시의 끝과 같이 뾰족한 물체로 가장자리로 밀어 넣으십시오.
  5. 햇빛이 비치지 않는 곳에 슬라이드를 놓고 2 ~ 3 일 동안 말리십시오.
  6. 현미경을 사용하여 이미지를 수집하고 적절한 소프트웨어로 분석하십시오.

7. 이미지 스택 획득

  1. 이미징 프로그램을 엽니 다 ( 재료 표 참조). 슬라이드를 현미경 스테이지에 올려 놓습니다. 프로그램 상단의 메뉴에서 '수집'을 클릭 한 다음 '라이브 이미지'를 클릭하십시오.
  2. 현미경을 10X로 설정합니다. 특혜의 뉴런을 확인하고 빨간색 X처럼 나타나는 커서를 soma의 중심으로 가져옵니다. 참조 점을 설정하려면 왼쪽 버튼을 클릭하십시오.
  3. 현미경을 40X로 설정하십시오. 프로그램 상단의 메뉴에서 '이동'을 클릭 한 다음 '참조 점'을 클릭하십시오.
  4. 초점이 약간 벗어날 때까지 조직 위의 미세한 대상을 수동으로 스크롤하여 이미지 스택을 만듭니다.
    1. "Image Acquisition"제목 아래에서 프로그램의 오른쪽 하단에있는 "Set Top"을 클릭하십시오.
    2. 약간 초점이 맞을 때까지 조직 아래로 살짝 스크롤 한 다음 "Image Acquisition"아래의 "Set Bottom"을 클릭하십시오. 그런 다음 "이미지 스택 가져 오기"를 클릭하십시오.
  5. 이미지 스택을 얻은 후에 나타나는 창에 원하는 이미지 파일 이름을 입력하십시오. "MBF Ascii 파일"로 저장하십시오.
    1. 메시지가 나타나면 파일 형식을 "MBF JPEG2000 stack file"로 선택한 다음 "저장"을 클릭하십시오.

8. 신경 추적

  1. 툴바에서r 메뉴 아래의 "Contour Name"상자를 클릭하십시오. 드롭 다운 메뉴에서 "Soma"를 선택하십시오.
  2. soma를 수동으로 추적하십시오. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 추적이 완료되면 "셀 본문 완료"를 선택하십시오.
  3. "AutoNeuron"을 선택하여 "AutoNeuron Workflow"라는 다른 탭을 불러옵니다.
  4. "구성 유형"에서 "새로 만들기"를 선택하십시오. 매개 변수를 설정하고 "다음 단계"를 클릭하여 "Soma Detection"소제목을 불러옵니다.
    1. 매개 변수를 설정하려면 "Brightfield"를 선택하십시오. 다음으로, "Max Process Diameter"에서 "Start Measuring"을 클릭하십시오. 커서를 사용하여 수상 돌기의 바닥으로 가서 수동으로 직경을 설정하십시오.
  5. 사용자가 전체 이미지를 추적하도록 요청하는 창에서 "예"를 클릭하십시오. soma를 수동으로 추적하십시오. 클릭 한 다음 "다음 단계"를 클릭하여 "시드 배치"소제목을 불러옵니다.
  6. "Validate Seed"를 클릭하십시오."다음"을 클릭하여 "Neuron Reconstruction"소제목을 불러옵니다.
  7. "Neuron"에서 "Interactive"를 클릭하십시오. 수상 돌기의 프로그램 방향을 따라 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 프로그램에서 추적 한 강조 표시된 영역을 완료함으로써 대화식 추적을 수행하십시오. 모든 수상 돌기를 추적 한 후 "다음 단계"를 클릭하십시오.
  8. 새 창이 나타나면 원하는 제목으로 새 구성을 저장하십시오. '저장'을 클릭하십시오.

9. 분석

  1. 분석 프로그램을 엽니 다 (재료 표 참조).
  2. 상단 메뉴에서 "파일"을 클릭 한 다음 "데이터 파일 열기"를 클릭하십시오. 원하는 파일을 선택하십시오.
  3. 분석 소제목 아래에서 "Sholl Analysis"를 선택하십시오.
  4. "Sholl Analysis"창에서 시작 반경을 10 μm로 설정하십시오. "분석"에서 "수상 돌기"및 "지점 주문"상자를 클릭하십시오.
  5. 오른쪽 cl새로 열린 창을 클릭하고 "Excel 내보내기"를 클릭하십시오. '저장'을 클릭하십시오.
  6. 분석 아래에서 "Branched Structure Analysis"를 클릭하십시오. "가능한 모든 분석"을 선택하십시오.
  7. 새로 열린 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "Excel 내보내기" 24를 클릭하십시오.

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결과

수상 돌기 arborization에 5 -Fu 처리의 효력 및 Golgi 얼룩 두뇌 단면의 해마에있는 복합성은 상업적으로 이용 가능한 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 정량되고 추적되었다. 추적 후, 돌기 arborization, 척추 밀도 및 척추 형태학은 Sholl 분석 및 수지상 복합 지수 (DCI)를 사용하여 분석되었습니다. Sholl 분석은 수지상 세포 형태를 결정하는 데 사용할 수있는 정량 분석 ​​방법입?...

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토론

보다 현대적인 기술에 비해 Golgi-Cox 방법은 척추 형태를 검사하는 데 선호되는 몇 가지 장점이 있습니다. 1) 염색은 본질적으로 모든 조직에 사용할 수 있습니다. 2) 기본적인 광학 현미경 설정만으로 모든 것이 가능합니다. 3) Golgi-Cox 이미징은 공 촛점 영상보다 빠르다. 4) Golgi 염색 된 절편은 형광 라벨이 부착 된 샘플보다 몇 개월에서 몇 년 더 오래 실행 가능하다. 이러한 장점을 가지고 있어도 Gol...

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공개

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 NIH P20 GM109005 (ARA) 및 Translational Neuroscience IDeA 프로그램 상 P30 GM110702 센터의 파일럿 보조금에 의해 지원되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
superGolgi Kit Bioenno Lifesciences30100 Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrateFisher BP665-1
Triton X-100Sigma9002-93-1
Permount Fisher SP 15-100
Slide cover Fisher 12-546-14
7 mL Transfer pipette Globe Scientific 135030
10 mL Falcon tubes BD Biosciences 352099
Foil Fisher 01-213-105
12-well plate BD Biosciences 353043
200 proof Ethanol Pharmco-AAPER111000200
Xylene Acros Organics 1330-20-7Hazardous. 
Permabond 200Permabond LLCGF2492
25 mL serological pipetteSigmaSIAL1489
ParafilmMidsciHS234526C 
Vibratome World Precision Instruments NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice The Jackson Laboratory 000664
Axio Imager 2ZEISSMultiple components, see website for details. 
AxioCam MRc CameraZEISS426508-9902-000
Staining Dish , GreenTissue-Tek62541-12
Staining Dish Set Electron Microscopy Sciences 70312-20
Motorized Pipet Filler Fisher 03-692-168
Neurolucida mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer mbf Bioscience 
Prism GraphPad

참고문헌

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