분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

요약

Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

초록

Microtubules (MTs)는 역동적이 고 연약한 구조는 이미지에 vivo에서, 특히 척 추가 있는 태아에에서 게 도전 하는. Immunolabeling 메서드는 zebrafish 태아의 개발 신경 관에서 MTs의 명백한 인구 분석 여기 설명 되어 있습니다. 신경 조직에 포커스를 실행 하는 동안이 방법론은 다른 조직에 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나 절차는 일찍 중반 somitogenesis 단계 배아 (1 somite 12 somites에), 그들은 수 다른 단계 비교적 사소한 조정의 범위에 적응을 위해 최적화 됩니다. 첫 번째 프로토콜에는 안정적이 고 동적 MTs의 공간적 분포를 평가 하 고 이미지 처리 소프트웨어와 함께 이러한 인구의 정량 분석을 수행 하는 방법을 제공 합니다. 이 방법은 기존 도구 이미지 microtubule 역학 및 실시간, 사용 유전자 변형 라인 또는 태그 구문 과도 식에서 배포를 보완합니다. 그러나 사실, 이러한 도구는 매우 유용 합니다, 쉽게 역동적이 고 안정적인 MTs 사이 구분 하지 않습니다. 이미지 분석이 고유한 microtubule 인구를 셀 분극 및 morphogenesis 기본 이해 메커니즘에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 두 번째 프로토콜 초기 MTs를 구체적으로 분석 하는 기법을 설명 합니다. 이것은 약 nocodazole와 마약 유실 후 복구 기간 microtubule depolymerization 다음 시간이 지남에, MTs의 드 노 보 성장 특성을 포착 하 여 수행 됩니다. 이 기술은 zebrafish 태아에 있는 MTs의 연구에 적용 하지 않은 하지만 microtubule 어셈블리에 연루는 단백질의 기능 vivo에서 조사에 대 한 가치 있는 분석 결과 이다.

서문

Microtubules (MTs)는 중합체의 α-및 β-tubulin 선형 protofilaments, 몇 가지는 속이 빈 튜브^1,2형태로 결합으로 조립 이다. MTs는 끝 플러스 빠른 성장 하 고 느린-성장 하 고 끝은 centrosome 또는 다른 microtubule 조직 센터 (MTOC)³에서 앵커는 마이너스와 대립 된 구조. 드 노 보 MT 형성 nucleation 복잡 한 γ-tubulin 반지에서 (γ-TURC), 마운트 어셈블리⁴에 대 한 서식 파일을 제공 하 여 시작 됩니다. 어떤 주어진된 셀에 MTs의 두 인구 구분할 수 그 차례 이상의 서로 다른 속도로. 동적 MTs 성장의 단계 동적 불안정⁵라고 하는 과정에서 수축으로 전환 하 여 그들의 세포질 환경 탐구. 동적 MTs와 달리 안정적인 MTs 비 성장 고 동적 MTs⁶보다는 더 긴 반감기.

세포 생물학에 있는 연구의 십 년간은 정교한 배열의 마운트 구조와 기능을 공부 하는 도구를 제공 하 고 이러한 cytoskeletal 요소에 지식의 큰 몸이 귀착되. 예를 들어, MTs 설립 및 유지 보수 뿐만 아니라 안정적인 동적 MTs^7, 대의 차동 subcellular 배포에 뿐만 아니라 그들의 본질적인 극성에 기인은 세포 극성의 중심 역할을 담당할 ⁸. 반면, 훨씬 덜은 이해 MT 아키텍처 및 척 추가 있는 태아 같은 더 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 기능에 대 한 부분에서 높은 해상도에서 산 골격을 이미징의 도전 때문. 이 제한에도 불구 하 고 최근 세대 GFP 표현 유전자 변형 라인 라벨 MTs 또는 붙일 태그가 MT 마커의 과도 식 MTs 받 다 동적 변화 및 그들의 휴대에 대 한 우리의 이해를 증가 했다 고 zebrafish 태아에 있는 발달 역할. 전체 MT 네트워크 수 수 몇 군데는 tubulin에 유전자 변형 라인에 직접 레이블된⁹ 또는 tubulin 고분자는 직접 표시 하지 MT 관련 된 단백질을 사용 하는 Doublecortin 같은 키 (Dclk) 또는 Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. 다른 선 (및 구문) 생성 된 산 플러스 끝 으로써 특히 산 내장 극성의 평가 활성화 또는 끝^11,12,13, 마이너스 centrosome 고정 ¹⁴. 이러한 도구의 힘 유기 체를 개발, MT의 역학을 공부 하는 능력에 있다. 이러한 연구 결과 밝혀졌다, 예를 들어 특정 세포 인구에서 MTs의 공간 및 동적 배포, mitotic의 방향 스핀 들 겪고 morphogenesis (세포 분열의 비행기의 표시기), 조직에 산 폴리머의 극성 세포 신장 등 마이그레이션 프로세스와 관련 및 MT 성장률 혜성 속도^9,,1315에 의해 결정. 이러한 도구의 한계는 그들이 쉽게 안정적이 고 동적 MT 인구 사이 차별 하지 않습니다 이다.

풍부한 세포 생물학 문학에서 그리기, zebrafish 태아에 있는 안정적이 고 동적 MTs 이미지를 immunolabeling 방법 설명, 여기는 유전자 변형 라인의 사용을 보완 합니다. 제 브라에서 같은 immunolabeling 방법의 광범위 한 사용은 고정 절차 동안 MT 무결성을 보존 하기에 있는 어려움에 의해 약간 방해 되었습니다. 프로토콜 1 immunolabeling 총, 동적, 최적화 된 방법을 설명 하 고 있는 안정적인 MTs 개발 zebrafish hindbrain의 횡단면. 또한, 상업적으로 사용 하 여 간단한 메서드 사용 가능한 소프트웨어 계량 이러한 산 인구를 설명 되어 있습니다. 안정적인 MTs는 α-tubulin acetylation, detyrosination, 시간^16,17동안 안정적인 MTs에 축적 등의 여러 포스트 번역 상 수정에 따라 동적 MTs에서 구별 된다. Zebrafish 태아 acetylation 속눈썹 및 axonal MTs만 안정적인 interphase MTs¹⁸, 안정된 MTs의 하위 집합을이 마커의 유용성을 제한 하지에 발생 합니다. 대조적으로, detyrosination¹⁸zebrafish 태아 있는 모든 안정적인 MTs에 나타납니다. 이 포스트 번역 상 수정 α-tubulin (detyrosinated tubulin)¹⁸ 의 카 터미널 글루탐산을 노출 하 고 안티-Glu-tubulin¹⁹를 사용 하 여 검출 될 수 있다. Detyrosination 안정 MTs에 우선적으로 발생 합니다, 하지만 실험적인 증거가 포스트 번역 상 수정 산 안정성¹⁶의 원인 보다는의 결과 임을 나타냅니다. 동적 MTs 구성 상호 MT 인구, 항 체, 안티-Tyr-tubulin, 그 구체적으로 인식 하는 α-tubulin¹⁹의 tyrosinated 형태를 사용 하 여 구별 된다. 이러한 마커 및 confocal 영상 immunolabeling, 다음 MTs (길이, 번호, 및 관계 되는 풍부)의 정량 분석 개발 신경 튜브의 정의 된 영역에서 수행할 수 있습니다. 효율적인된 방안은 여기 3 차원 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여이 분석을 수행 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 주소 morphogenesis 설립 또는 세포 극성²⁰의 성숙에 관한 질문에 적용할 수 있습니다. 실제로, 안정적인 MTs의 편광 배열의 정교 포토 리셉터 morphogenesis²¹, 개발 신경 튜브¹⁸ 및 축 삭 형성⁸셀의 epithelialization를 포함 하 여 많은 개발 이벤트를 동반 한다.

프로토콜 2 그들의 어셈블리 단계 (nucleation/앵커리지와 성장)^22,23동안 MTs를 분석 하는 세포 생물학 분석 실험의 비보에 적응을 설명 합니다. 초기 MTs는 centrosome에서 nucleated 되며 이후 어머니 중심소체²³의 subdistal 부속에 고정. Depolymerization를 다음 초기 MT 자라나 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 MTs, 약 희미하게 절차와 치료 후 회복 기간 depolymerize nocodazole 치료에 세부 정보를 제공 합니다. MT 다시 성장에서 정기적 모니터링총 MTs에 대 한 마커 immunolabeling에 의해 s 게시물 유실 (β-tubulin) 안티는 centrosome에 대 한 표시와 함께 (안티 γ-tubulin)과 핵 (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), 프로토콜 1에서 설명 하는 일반 절차에 따라. 이 프로토콜의 MT depolymerization 단계 드 노 보 산 성장에 대 한 평가 보다는 기존 MTs의 확장 하면 필수적 이다. 이 기술은 다른 측정 하 산 성장 속도 (depolymerization의 부재) 끝 트 란 외.와 같이 녹색 형광 단백질 (GFP EB3), 융합 단백질 3을 묶는 등 플러스 팁 마커를 사용 하 여 다른 게시 된 절차 이므로 2012¹¹. 또한,이 분석 결과 배아 드 노 보 마운트 어셈블리에 결함 분석에 특히 유용 이전에 보고 된 NEDD1 돌연변이는 γ-tubulin는 centrosome에의 채용은 장애인 등에서 불완전 한 결과 신경 관 형성 및 신경 결함²⁴.

프로토콜

윤리 성명: 메릴랜드 볼티모어 카운티 동물 보호 지침의 대학 따라 아래 설명 된 절차.

1. 분석의 안정적이 고 동적 MTs 사용 하 여 Immunolabeling (프로토콜 1)

1. 고정 전에 배아의 수동 dechorionation
   1. 얻기 갓 초과 시스템 물을 붓는 하 여 배아를 생성 하 고 다음 플라스틱 페 트리 접시에 남은 배아를 수집 (테이블의 자료를 참조).
   2. 배아 중간 가득한 새로운 요리 시스템 물 및 전송 배아에서 어떤 파편 든 지 제거 (테이블의 자료를 참조)는 배아는 깨끗 한 환경에서 개발 되도록.
   3. 배아 28.5에 온도 제어 인큐베이터에서 원하는 단계로 개발 있도록 ° c.
   4. 장소 배아 24 h 보다 젊은 후 수정 (hpf) dechorionation 이전 유리 접시에.
      참고: 고정 정착 액 및 보존 MT 무결성의 빠른 침투를 극대화 하기 위해 이전 Dechorionate 배아. 있도록 추가 Ca ^{2 +} dechorionation 동안 필요한 시스템 물 대신 사용 배아 매체.
   5. 수동으로 해 현미경 미세 집게를 사용 하 여 배양 접시에 배아에서는 chorions를 제거 합니다.
      1. 막에 있는 파열을 만들려고 집게와 부드럽게 떨어져 당겨 집게의 쌍 태아 encircles 라운드, 투명 chorion에 작은 영역을 꼬집어.
      2. 집게를 사용 하 여 파열된 chorion에 섬세 하 게 캐 고 하 여 개방을 확대. 파열 수는 집게로 태아를 터치 하지 않도록 주의 하십시오.
2. 무대 배아의 고정
   1. 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 dechorionated 배아 전송 준비. 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 가능한 많은 배아 매체 제거.
      참고: 영 (중반-somitogenesis) 배아, 안락사 기간 동안 통증을 완화에 없는 추가 절차를 요구 하는 중재 통증 감각 신경 센터의 대형 이전에 고정 및 약물 치료를 수행 합니다. 발달 단계는 킴 외에 정의 된. 1995, ²⁵. 4-5, 11-12 somite 단계 그림 2와 3에 대 한 이미지를 가져오는 데 사용 되었다.
   2. 준비 4 %paraformaldehyde (PFA) /MT 어셈블리 버퍼 (MAB) 정착 제 (테이블의 자료를 참조) 8 %1 mL을 결합 하 여 당 1 mL 2 X MAB 및 추가 2 µ L 100 %PFA 총 볼륨의 1 mL 당 트라이 톤 X-100.
      주의: PFA와 트라이 톤 X-100 피부 irritants을 포함 하는 솔루션을 처리 하는 동안 장갑을 착용.
   3. 28.5에 5 분 동안 4 %PFA / MAB 정착 액 1 mL에에서 수정 배아 ° C. Aspirate는 피 펫과 정착 액 1 mL 신선한 정착 액 교체 및 로커에 실 온 (RT)에서 3 h에 대 한 품 어.
      참고: 샘플 수정 해야 합니다 신속 하 게 그들의 생물 학적 온도 (zebrafish 28.5 ° C)에 온도 따른 산 depolymerization를 방지 하기 위해.
3. 정착 액을 발음 하 고 NP40에 식 염 수 Tris 버퍼 x 1 mL 1 추가 (TBS NP40) 버퍼. 부드럽게 교 반 하십시오 RT에 5 분에 대 한 세 번 로커에. 1 mL 신선한 1에에서 4 ° C에서 배아를 저장 X TBS-7 일 동안 NP40.
   주의: NP-40, 피부 자극을 포함 하는 솔루션을 취급할 때 장갑을 착용.
4. 단면화 배아 immunolabeling 위한
   1. 열 RT 4% 낮은 융해 점 (LMP) agarose 솔루션 뜨거운 접시를 사용 하 여 취소 될 때까지 닫힌된 컨테이너에 매체를 포함 해 현미경 가까이 위치 하는 50 ° C로 설정 . 컨테이너 샘플 사이 닫히고 포함 과정 (단계 1.4.4-1.4.6)을 통해가 열 유지.
   2. 1.5 mL에서 전송 배아 원심 튜브 유리 피 펫을 사용 하 여 배양 접시를 하 고 1 입력 X TBS NP40.
   3. ²⁶ 해 현미경 배율 아래 미세 집게를 사용 하 여 페 트리 접시에 somitogenesis 단계 배아 (4-5, 11-12 somites)에서 큰 노 른 자 세포를 제거 합니다. 한 쌍의 집게와 꼬리 새싹에 의해 태아를 보유 하 고 hindbrain 조직을 유지 하기 위해 다른 쌍으로 노 른 자 세포를 벗 겨. 노 른 자 파편의 무료 페 트리 접시의 지역 데 노른자위 배아 전송.
      참고: LMP agarose의 조기 경화를 방지 하기 위해 개별적으로 agarose 가득 금형에 배아를 포함.
   4. 채우기 한 12 x 5 mm x 3 mm 200 µ L 가진 단면 형의 잘 녹아 LMP agarose는 micropipette를 사용 하 여. 수행 단계 1.4.5.-1.4.6. 신속 하 게 (20 내 금형의 s) LMP agarose RT를 냉각 하 고 고형화 하기 전에 배아를 포함.
   5. 미세 집게를 사용 하 여 전송 드 노른자위 배아는 tailbud에 의해 배양 접시에서 해 현미경의 테이퍼 끝으로 agarose 가득 금형.
   6. 는 vibratome 원하는 평면에서 삭감 되도록 금형에 태아 하 좋은 집게를 사용. Hindbrain 조직 가장자리를 직면 하 고 그것의 등 쪽 표면 및 테이퍼 지역 끝을 직면 하 고 그 앞쪽 표면 금형의 길이에 평행 하 게 실행 되도록 태아를 향하는 여 가로 섹션을 만듭니다. 잔여 배아에 대 한 단계 1.4.4-1.4.6 반복.
   7. 실시간에서 5 분을 강화 하기 위해 agarose 포함 허용
   8. 는 agarose의 높은 축 생성 40 µ m 섹션 포함 배아 (단계 1.4.1-1.4.7)는 vibratome을 사용 하 여 1로 가득 단면 접시와 함께 TBS NP40 x. 500 µ L 1에서에서 24-잘 접시에 관심의 섹션을 전송 TBS NP40 미세 집게를 사용 하 여 x. 잘 당 하나의 배아의 섹션을 놓습니다.
      참고: ¹⁸ 대 한 자세한 내용은 참조를 참조 하십시오. 유지는 섹션 버퍼 및 저속 (10-25 rpm) agarose 포함에서 분리를 방지 하는 나머지 단계에서 바위의 적어도 250 µ L에 있는 모든 시간에 수산화. 세제는 차단에 제시 하 고 세척 솔루션 액체 매체의 표면 장력을 감소 하 고 섹션의 침수를 허용 한다. 모든 조작 전후 동안 섹션 우물에 남아 있는 것을 확인 하십시오. 주의 사용 하 여 세척 하는 동안 실수로 버린 섹션 방지.
5. 버퍼를 제거 하 고 차단 하는 솔루션의 500 µ L를 추가. 실시간에서 적어도 1 시간을 위해 바위
   참고: 사용 차단 솔루션을 사용할 각 이차 항 체의 호스트 종에서 5% 세라 (테이블의 자료를 참조).
6. 품 300 µ L 1 차 항 체는 로커에 4 ° C에서 36-72 h에 대 한 블로킹 버퍼에 희석에. 600 µ L 1에 두 번 씻고 30 분 각, 로커에 TBS NP40 x 실시간에
   참고: 더블-레이블 섹션 잠복기 (β-tubulin, 안티 또는 α-tubulin 안티) 총 MTs와 안정적인 MTs (안티-Glu-tubulin) 또는 동적 MTs (안티 Tyr tubulin)에 대 한 1 차 항 체에 의해. Α-tubulin 인구 수정 더블 라벨 총 및 post-translationally 다른 호스트 종에서 발생 한 1 차 항 체를 선택 합니다. 항 체 희석에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
7. 품 300에서 µ L fluorophore 활용 된 이차 항 체의 어둠 속에서 4 ° C에서 16-24 h에 대 한 로커에 블로킹 버퍼에 희석. 600 µ L 1에 두 번 씻고 30 분 각, 로커에 TBS NP40 x 실시간에
   참고: 랩 호 일 이후이 시점에서과 냉각을 방지 하기 위해 각 조작 후에 이차 항 체를 포함 하는 다 잘 요리. 호스트 면역 글로불린의 1 차적인 항 체와 반응 하는 2 차 항 체를 선택. 이차 항 체 fluorophores, 겹치지 않는 별도 방출 스펙트럼을 선택 합니다. 항 체 희석에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
8. TBS NP40 락 RT에서 5 분에 3 번 실시간 세척에서 30 분 동안 로커에 DAPI 솔루션의 500 µ L에 태아를 품 어.
   참고: 핵 라벨 MT 정량화 단계 1.12에서에서 수행에 대 한 셀룰러 컨텍스트를 제공 합니다.
9. 먼지 무료 슬라이드의 중앙에 방지 페이드 에이전트 설치 매체의 한 방울을 배치합니다. 미세 집게를 사용 하 여 장착 중간 물방울에 섹션을 전송. 먼지가 coverslip 샘플 위에 놓습니다. 슬라이드 이미징 수행 될 때까지 호 일에 싸여 건조 하 고, 어둡고, 차가운 장소에 저장.
   참고: 때 현미경을 사용 하 여 섹션을 식별 하는 데 도움이 됩니다 이미징 이전 뾰족한 영구 마커를 사용 하 여 슬라이드의 뒤쪽에 섹션을 돌고.
10. 1. 는 거꾸로 레이저 confocal 현미경 목표를 직면 하는 coverslip로 무대에 슬라이드를 추가 하 여 검색에 마운트 섹션 confocal 영상. 컨트롤 슬라이드에 적절 한 광학 (목표, 레이저, 및 채널 설정 같은 이득 및 오프셋)을 확인 하 고 샘플 ²⁷ 사이의 일관성 유지. 데이터 손실을 방지 하기 위해 픽셀을 밀어붙이는 방지.
    2. Z 스택 confocal 이미지 선택 된 이차 항 체 fluorophores에 대 한 채널 설정을 사용 하 여 캡처하고 ²⁷ 이미지 파일 저장 합니다. 각 섹션에 대 한 Z-스택 확보.
       참고: 다음 인수 설정을 사용 하 여 그림 2와 3에서 이미지를 수집 하는 데 사용 하는 매개 변수 복제: 모드 = XYZ; 객관적인 확대 = 63 X 기름 침수 렌즈; 객관적인 숫자 조리개 1.4; = Z-단계 = 0.1 µ m; Z-깊이 = 16.23 µ m.를 사용 하 여 다음 채널 설정: 20 %UV 범위 레이저, 방출 필터 범위 DAPI 여기 430-480 nm, 광 전 증폭 관 (PMT) 이득 = 525 V, 및 PMT 오프셋 =-1.72 = %; 448 nm fluorophore (테이블의 자료를 참조) 여기 20 %488 nm 레이저, 방출 필터 범위 = 493-573 nm, PMT 이득 689 V, 및 PMT 오프셋 = =-0.2%; 32 %594 nm 레이저, 방출 필터 범위 594 nm fluorophore 여기 608-706 nm, PMT 이득 = 768 V, 및 PMT 오프셋 =-6.8 = %.
    3. 고유한, 설명 파일 이름을 가진 원시 데이터 파일을 저장 하 고 이미지 분석 소프트웨어에서 편집 복사본을 만듭니다.
11. Z-스택 최대 예측 표시의
    1. 공개 3 차원 이미지 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)를 사용 하 여 데이터 파일 복사본을 엽니다. 각 채널 개별 이미지 순서 (Z-스택)으로 나타나는 확인.
    2. 다음 메뉴 순서를 사용 하 여 이미지 채널 분할: “ 이미지/색상/분할 채널 ”.
    3. 다음 메뉴 순서를 사용 하 여 관심의 채널을 오버레이하여 병합 된 이미지를 만들: " 이미지/색상/병합 채널. " 선택는 594 nm, 488 nm, 및 각각 거짓 색된 빨강, 녹색 및 파랑, 되도록 DAPI 채널. 체크 " 만들기 합성 " 선택 " 확인 " ²⁸.
       참고: 더 나은 전달 그림 2와 3, 최대 투영에 해당 MTs 하는 세부 의해 다른 두 채널에 대 한 거짓 색상 선택만 DAPI 채널 생략.
    4. 병합된 Z 스택 검토 하 고 시작 및 끝 표시 모든 채널에 대 한 내부 최고의 Z-비행기의 위치를 기록. 외부 차선 신호 섹션의 불규칙 한 표면 때문에 일반적으로 있는 Z-비행기를 닫습니다. ²⁹ 대 한 자세한 내용은 참조를 참조 하십시오.
    5. 다음과 같은 3 차원 이미지 분석 메뉴 순서를 사용 하 여 Z 스택의 최대 강도 투영을 수행 하 여 단일 2 차원 이미지로 병합된 Z 스택 시각화: " 이미지/스택/Z-프로젝트 " 시작과 끝의 내부 최고 위치 입력 1.11.3 단계에서 Z-비행기는 " 시작 슬라이스 " 및 " 정지 슬라이스, " 각각. 선택 " 최대 강도 " 투영 유형 및 클릭으로 " 확인 ". ²⁸ 대 한 자세한 내용은 참조를 참조 하십시오.
12. 분석 MT 라벨
    1. 상용 3 차원 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다. 선택 " 만들 라이브러리 " 이미지 라이브러리에 대 한 설명이 포함 된 이름을 제공 하는 고. 클릭 " 만들기. " 라이브러리에 confocal 현미경에서 생성 된 raw 이미지 파일을 끕니다. 큰 파일 전송에 더 많은 시간 필요.
    2. 파일 분석을 선택 합니다. 선택 " 확장 초점 "에서 " 보기 " 메뉴는 메인 창에서 채널 병합 이미지를 표시 합니다.
    3. 배경 신호 감소 되 고 진정한 신호는 강력한 때까지 왼쪽 또는 오른쪽에 각 채널에 대 한 슬라이더 도구를 드래그 하 여는 임계 처리를 조정 합니다. 각 채널 (예를 들어, 직사각형 또는 mitotic 핵만 하지 자동-형광 세포질 또는 agarose에서 보여주는 DAPI 채널) 라는 분자에 대 한 진정한 신호를 보여준다 관찰.
    4. 선택은 " Freehand 관심 영역 (ROI) " 도구 및 분석 관심 영역 윤곽. 선택은 " 작업 " 탭 뒤에 " 선택 자르기 " 이미지를 자르려면. 자른된 이미지 파일 새 이름으로 저장 합니다. 클릭은 " 측정 "를 만드는 3 차원 분석에 관련 된 특정 개체를 필터링에 대 한 프로토콜 탭.
    5. 드래그 " 찾아 개체 " 프로토콜 창. 첫 번째 프로토콜 이름을 " DAPI. " DAPI 채널 드롭다운 메뉴에서 선택 합니다. 다음 설정을 DAPI 프로토콜 끌어서 넣어 아래 " 찾을 개체 " 다음 순서로 (표 1): " ObjectsŔ에서 구멍 채우기 " ObjectsŔ 감동 별도 " 개체 SizeŔ에 의해 제외 " 안 만질 ROIs 제외 ".
       주: 표 1에 설정의 목표는 먼저 그의 배급의 신호를 무시 하는 임계값을 설정 하 고 크기 분석 되 고 개체의 크기와 일치 하지 않습니다. 예를 들어 세 핵 핵을 충분히 큰 신호 제거.
    6. 나머지 조립 시퀀스 (단계 1.12.9) β-tubulin 및 표 1에 설정을 사용 하 여 다른 표식에 대 한 필터 수행.
    7. 선택 " 측정 " 각 프로토콜의 밑에. 선택 " 강도와 볼륨 측정 " 및 " 골격 길이 " 모든 tubulin 라벨, 하지만 DAPI 신호에 대 한 전.
    8. 측정 지역의 ROI를 그립니다. 관찰에서 측정 된 " 요약 " 탭 영역을 처리 하는 소프트웨어 후. 데이터를 복사 하 고 실행할 수 있는 스프레드시트, 표 2에 저장. 나중에 분석에 대 한 스프레드시트의 백업 복사본을 만듭니다.
    9. 선택 측정 (예를 들어 길이 산 번들, 수 산 번들/핵와 공개의의 다른 마커) 스프레드시트에서 각 그룹에 대 한 평균을 결정 하기 위해 분석.
       참고: 평균 MT 번들 길이 =의 합계는 ' β-tubulin 골격 길이 의미 ' 배아의 총 수로 나눈 각 태아에 대 한. 행 20 표 2를 참조 하십시오. 변수 및 실험적인 그룹은 그래프로 쉽게 있도록 스프레드시트 포맷.

2. 드 노 보 MT 어셈블리 분석 결과 (프로토콜 2)

1. 구축 및 테스트는 다 잘 흐름을 통해 장치 ( 그림 1) 2 일전 실험.
   참고: 장치 nocodazole 치료 공급 재료의 테이블에서에서 사용 하 여 다음과 같은 여러 실험적인 그룹의 동시 유실 수 있습니다. 실리콘 마감재 배아를 독성 위험 포즈 건조 시간 24 시간 이상 필요 합니다.
   1. 분할 반 50 mL 원심 분리기 튜브 지 그 또는 밴드 톱을 사용 하 여 세로로.
   2. 70 µ m 나일론에서 3 cm의 반경으로 잘라 7 세미 원, 메쉬 및 하 여 맞게 단단히 하나로 분할의 절반 원심 관. 원심 분리기 튜브 수족관 안전한 실리콘 마감재를 사용 하 여 10 mL 그라데이션 표시에 평행으로 세미 서클을 붙입니다. 장치를 2 일 동안 건조 하 고 물 2-3 헤 한 비 커에 몸을 담글 하 여 씻어 수 있도록
   3. 그런 흐름을 통해 장치에 유지 하는 액체의 높이 ¼ 인치 ( 그림 1, 2와 3)의 깊이 클레이 모델링 컷된 원심 분리기 튜브 (스레드) 최고급 라인.
   4. 50 mL 주사기에서 플런저를 제거 하 고 끝에 좋은 튜브의 12 인치 삽입 여 희미하게 기구를 준비 합니다. 그것은 갈 것 이다 고 모델링 점토를 사용 하 여 공동 주위 인감 튜브를 밀어.
   5. 사전 젖은 메쉬를 사용 하 여 전체 흐름을 통해 장치를 통해 실행 하는 액체 수 있도록 배아 중간. 각 얼음 그 액체 모든 구획에 풀 하지만 여전히 앞 빈 찰 흙 테두리는 장치. 얼음 ( 그림 1)에 흐름을 통해 장치 위에 희미하게 장치 일시 중단 링 스탠드를 사용 하 여.
   6. 얼음에 배아 매체의 200 mL를 진정 하 고 모든 기포를 삭제 하 고 유량 주사기의 높이 변경 하 여 약 7 mL/분 조정 흐름 율은 희미하게 장치에 충분 한 부.
2. Dechorionate 배아 효소
   1. 게 일반적인 효소의 작업 솔루션 10 mg/mL의 1 mL를 diluting 하 여 일반적인 효소 주식 20 mL 배아 중간에.
   2. 배아 timepoint 그들이 원하는 개발 단계에 도달 하는 예상 되는 전에 1 시간에 수행 화학 dechorionation. 100 mm 페 트리 요리에서 배아 매체를 제거 하 여 다이제스트 chorions 배아와 관련 되지 않은 효소 작업 솔루션의 20 mL를 추가 준비.
   3. 5 분 동안 37 ° C에 품 배아
      참고: 5 분을 초과 하지 않거나 사용 하 여 일반적인 효소 솔루션의 높은 농도이 떨어지는 태아 귀 착될 것 이다 떨어져 한 번 nocodazole 치료.
   4. 신속 하 게 일반적인 효소 밖으로 플라스틱 하 고 약 25 mL 배아 매체와 요리를 리필. 한번 반복.
   5. 1 mL 유리 피 펫, 24 보다 전송 배아를 사용 하 여 유리 hpf 손상 으로부터 그들을 보호 하기 위해 요리.
   6. 단계 1.1.5에서에서 설명한 대로 수동으로 미세 집게의 쌍을 사용 하 여 chorions를 제거 하 여 완전 한 dechorionation.
   7. 유리 접시 원하는 개발 단계를 도달할 때까지 dechorionated 태아 30 분의 최소 28.5 ° C 배양 기에서 포함 된 곳.
3. Depolymerize 기존 MTs
   1. 50 µ L 1 mg/mL 재고 nocodazole 10 mL 얼음 차가운 배아 매체와 결합 하 여 5 µ g/mL nocodazole의 작업 솔루션 준비.
      주의: nocodazole, 피부 자극을 처리 하는 경우 장갑을 사용.
   2. 10 mL 찬 nocodazole 작업 솔루션 nocodazole 치료 그룹의 배아 매체를 교환합니다. 개발 단계 (4-5 somite 배아에 대 한 예를 들어 1 시간)에 대 한 적절 한 시기에 대 한 얼음에 접시를 놓습니다. 정해 치료 제어 배아 배양 접시에서 희미하게 샘플 단계 2.3.4.1에서에서 함께 고정 될 얼음에.
   3. 이전 배아 실험 그룹별로 별도 구획을 사용 하 여 흐름을 통해 장치를 화재 광택된 1 mL 유리 피 펫을 사용 하 여. 50 mL 주사기의 상단에 따르고 얼음 차가운 배아 매체에 의해 nocodazole 희미하게 시작.
      참고: 실험 그룹 당 적어도 30 배아를 사용 합니다. 실험 그룹 제어 배아 또는 morpholino 또는 RNA 주입 태아의 다양 한 구성 수 있습니다. 희미하게 얼음 산 성장을 억제 하면서 희미하게 8-10 분 마다 추가 배아 매체의 약 150 mL의 총은 nocodazole가 필요 합니다. MTs는 찬 온도에 안정 하 고 감기 초기 배아의 개발 지연 때문에 얼음에 배아를 유지 하는 것입니다이 분석 결과의 성공에 필수적인.
   유리 접시 포함 하에 배아를 전송 하 여 실시간에 희미하게의 20 분 후 regrow 허용 MTs
   4. 따뜻한 (28.5 ° C) 배아 중간 화재 광택된 1 mL 유리 피 펫을 사용 하 여. 최대한 빨리 배아 전송 타이머를 시작 합니다.
      1. 1 분 제어 및 희미하게 배아 수정, 5 분 및 10 분 1.5 mL로 약 10 배아를 pipetting 원심 튜브 1 mL 4 %PFA / MAB 수정 (28.5 ° C)로 가득와 지시에 따라 1.2.3 단계.
4. Immunolabeling에 설명 된 대로 섹션 1.3-1.5 샘플 준비.
5. Immunolabel 부동 섹션 및 이미지 배아로 섹션에에서 설명 1.6 1.10 다음 변경 기본 항 체 사양: 사용 1: 500 토끼 안티-γ-tubulin 및 1: 200 마우스 안티-β-tubulin.
6. 프로세스 단계 1.12에서에서 설명한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 하 고.

결과

Immunolabeling를 사용 하 여 안정적이 고 동적 MTs의 분석
프로토콜 1, 산 초 (신경 용골) 동안 부분 모집단의 분포와 신경 관 발달의 늦은 (신경 대) 단계 드러났습니다, 각각 사용 하 여 Glu tubulin 및 Tyr tubulin 표식으로 안정적이 고 동적 MTs에 대 한. 동적 MTs는 hindbrain에 신경 용골 단계 (4-5 somites)에서 지배 (그림 2A-D). ...

토론

현재 많은 방법이 있다 초기 zebrafish 개발에서 산 역학 이미징을 위한 조직^11,12,,1314고정 태그 분자의 라이브 영상에서의 immunolabeling에 이르기까지. 단일 셀에 MTs 동적 또는 안정 상태에 있을 수 있습니다, 있지만 epithelialization는 MTs는 시간이 지남에 따라 점차적으로 안정화 과정 이다. 안정적이 고 동적...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose			Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized.
Kpipes	Sigma	P7643
NaCl	Sigma	S7653
Tris-HCl	Sigma	T3253-500G
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
NP-40	American Bioanalyticals	AB01424
EGTA	Sigma	E3889-25G
MgCl2	Sigma	M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1605
Triton-x	American Bioanalyticals	AB02025
Anti-Fade mounting medium	Invitrogen	P10144
Mouse anti-β-tubulin	Developmental studies Hybridoma Bank	E7	1/200
Rabbit anti-γ-tubulin	Genetex	GTX113286	1/500
Rabbit anti-α-tubulin	Genetex	GTX108784	1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin	Millipore	AB3201	1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin	Millipore	ABT171	1/500
Mouse anti-centrin	Millipore	04-1624	1/1000
Goat 488 anti-rabbit	Thermofisher	A11008	1/500
Goat 594 anti-rabbit	Thermofisher	A11012	1/500
Goat 594 anti-mouse	Thermofisher	A11005	1/500
Goat 488 anti-mouse	Thermofisher	A11001	1/500
Vibratome	Vibratome	1500
Forceps	World Precision Instruments	555227F
100 mm petri dish	Cell treat	229693
35 mm petri dish	Cell treat	229638
50 ml falcon tube	Fisher	14-432-22
Woven nylon mesh 70 um	Amazon.com	B0043D1SZG
Micropipette	Gilson	F123602
Glass pipette	Fisher	NC-999363-9
Aquarium sealant	Amazon.com, by MarineLand	Silicone Sealer 1 oz (Tube)
Ring stand	Fisher	14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID	Cole-Parmer	WU-06417-21
Modeling clay	Amazon.com	Sargent Art 22-4000	Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp	Fisher	02-215-466
60ml syringe	Fisher	14-820-11
Embryo medium (E3)			34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.
Blocking Solution			50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6)			155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4)			160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software	PerkinElmer	Volocity (V 6.2)
Dry block heater	VWR	12621-108	Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope	Leica	MZ12
Confocal Microscope	Leica	SP5
Flat embedding mold	emsdiasum.com	BEEM 70904-01
Public domain image processing software	NIH	ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number