학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

요약

이 프로토콜은 구애 조건 조절이라고 불리는 Drosophila 학습 및 기억 분석을 설명합니다. 이 고전적 분석은 비 수용성 전제 암컷에 의한 성적 거부 이후의 남성 구애 행동의 감소에 근거합니다. 이 자연적 형태의 행동 소성은 학습, 단기 기억 및 장기 기억을 시험하는데 사용될 수 있습니다.

초록

과일 파리, Drosophila melanogaster 와 같은 모델 생물체에서 간단한 행동 분석을 사용하여 학습과 기억의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 많은 통찰력이 밝혀 졌습니다 . Drosophila 는 지적 장애 (ID) 및 자폐증과 같은 인간의인지 장애와 관련된 유전자의 돌연변이로 인한인지 적 결핍의 기본 신경 생물학을 이해하는 데 유용합니다. 이 연구는 구애 조건 조절 (depthere conditioning) 이라고 알려진 Drosophila 의 전통적인 패러다임을 사용하여 학습과 기억을 테스트하는 방법론을 설명합니다. 남성은 쉽게 알아볼 수있는 행동의 뚜렷한 패턴을 사용하여 법원 여성을 날 듭니다. 전 암컷은 교미에 대한 수용력이 없으며 남성의 교접 시도를 거부합니다. 이 거절에 대한 응답으로, 수컷 파리는 구애 행위를 줄입니다. 구애 행동의 학습 된 감소는 시간이 지남에 따라 측정되며 학습 및 기억의 지표 역할을합니다. 기본 nume이 분석의 실제 결과는 남성이 10 분 간격으로 구혼하는 데 걸리는 시간의 백분율로 정의되는 구애 지수 (CI)입니다. 학습 지수 (LI)는 이전의 사회적 만남이없는 순진한 파리와 비교하여 전제 여성에게 노출 된 파리의 CI의 상대적 감소량입니다. genotypes 사이의 LI의 통계적 비교를 위해, 부트 스트래핑 (bootstrapping)을 이용한 랜덤 화 테스트가 사용됩니다. 이 분석법이 학습 및 기억과 관련된 유전자의 역할을 다루는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 설명하기 위해 Dihydroxyacetacet phosphate acyltransferase ( Dhap-at )의 팬 - 뉴런 넉다운이 여기서 특징 지어 졌다. glyceronephosphate O-acyltransferase ( GNPT ) 인 Dhap-at 의 인간 ortholog는 rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2에 속하며 심한 신드롬을 특징으로하는 상 염색체 열성 증후군이다. 구애 조건 분석을 사용하여 Dhap-at는 장기 기억에 필요하지만,단기 기억. 이 결과는 기본 분자 메커니즘에 대한 추가 조사의 기초 역할을합니다.

서문

학습과 기억의 기초가되는 분자 메커니즘은 많은 종에 걸쳐 보존되어있다. 후각 학습과 기억의 결함에 대한 Drosophila melanogaster 돌연변이 선구를 선구 적으로 선별하는 작업은 학습과 기억의 기초가되는 과정에 중요한 분자 통찰력을 제공합니다 ¹ . 이 연구는 rutabaga ² , 기억 상실증 ³ 및 dunce ⁴ 와 같은 학습 및 기억에 관여하는 최초의 유전자 중 일부가 사이토드 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 신호 전달에 중요한 역할을한다는 것을 확인했다.

기억 돌연변이에 대한 초기 유전 스크리닝은 주로 후각 조절을 사용하여 수행되었습니다. 그러나 다른 형태의 학습과 기억을 측정하는 몇 가지 방법이 시간이 지남에 따라 등장했습니다. 가장 널리 사용되는 학습 및 기억 패러다임 중 하나이며 여기에 설명 된 분석은 coursehip conditioning은 시겔 (Siegel)과 홀 (Hall) ⁶ 에 의해 처음 기술되었으며 후에 다른 여러 연구 그룹 ^{7 , 8 , 9} 에 의해 정제되었다. 구혼 컨디셔닝은 특정 페로몬, cis- vaccenyl acetate (cVA)가 여성 복부에 존재하는지 여부에 달려 있는데, 이는 교미 중에 남성에 의해 기탁된다. 여성 복부에서 cVA를 감지하면 구혼 행동이 자연스럽게 줄어들고 여성이 거절하는 행동과 결합하면 남성 구애 감소에 대한 cVA의 효과가 크게 향상됩니다. 이 분석에서 수컷 파리의 반응은 암컷을 향한 뒤를 따라 가며, 날개를 두드리며, 늘리거나 진동시키고, 핥고, 교미 ¹⁰ ( 그림 1A )을 시도함으로써 특징 지워지는 독특한 구애 행동을 관찰함으로써 쉽게 정량화 될 수있다. 수컷 파리는 구별하기 위해 배웁니다. h이고, 성 거부 이후에는 9 일까지 비 수용성 여성에 대한 구혼 행동이 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 자연스런 행동은 학습, 단기 기억 (STM), 장기 기억 (LTM) 8,9,12의 기본 메커니즘을 밝히는데 사용될 수 있습니다. 학습은 훈련 기간 중 발생하는 구혼 행동의 즉각적인 감소로 정의되며, 암환자 ^{6 , 8에} 노출 된 후 0 - 30 분 측정 된 즉각적 리콜 메모리로 종종 지칭됩니다. STM은 훈련 후 30 분에서 1 시간 사이에 측정되는 반면 LTM은 훈련 ⁸ 시간 후 24 시간에 가장 자주 측정됩니다 ( 그림 1B ). STM은 1 시간의 훈련 기간을 사용하여 유도 할 수 있지만 2-3 시간 동안 만 지속됩니다.s = "xref"> 6 ^{, 8} . 대부분의 학습 패러다임에서, LTM은 반복 훈련의 간격을두기 만 유도 할 수 있습니다. Mcbride et al . (1999) ⁸ 은 세 번의 간격으로 1 시간짜리 훈련 세션이 최대 9 일간 지속되는 구애 기억을 유도하는데 충분하다는 것을 보여 주었고, 단 1 시간의 훈련 세션으로 인한 2-3 시간과는 대조적이었다. McBride et al . ⁸ 은 또한 단일 5 시간 교육 세션이 최대 9 일 동안 유사한 LTM 응답을 생성 함을 입증했습니다. 파리는이 5 시간 동안 지속적으로 법원에 출두하지 않으며, 실제로 단일 훈련 세션에서 LTM을 유도하기 위해 자체 간격 훈련을 실시합니다. 이것은 실용적인 관점에서 매우 중요하며, LTM을 조사하기 위해이 분석법을 사용할 수있는 용이성을 대폭 증가시킵니다. 현재 프로토콜은 주로 LTM ^{11 , 12} 에 대해 7 시간의 단일 교육 세션을 사용합니다. 여러 연구에서구애 학습의 다른 측면에서 특정 결함이있는 돌연변이 조건. 예를 들어, 버섯 체 절제는 STM과 LTM에 영향을 미치지 만, 학습을하지는 않습니다. 후각 조절 ^3을 사용하여 기억의 특정 조절 자로 처음 정의 된 기억 상실 유전자의 돌연변이는 STM에는 영향을 주지만 학습에는 영향을 미치지 않습니다 ⁶ . 번역 조절기 orb2 (oo18 RNA- 결합 (orb) CPEB2 서브 패밀리) 및 엑 디손 시그널링 만의 혼란은 LTM ^{9 , 13} 에만 영향을 미친다. 따라서 구애 조건 조절은 학습과 기억의 다른 단계의 기초가되는 메커니즘을 해부하기위한 유용한 패러다임이다.

이 작업은 구속 조건 조절에 대한 상대적으로 높은 처리량 테스트를 허용하는 최적화 된 실험 설정을 보여줍니다. 또한, 통계 분석 스크립트를 설명하고 분석의 중요한 요소에 대해 설명합니다. 그것은 쉬다.Drosophila 유전자 인 Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase ( Dhap-at ) LTM에는 뉴런이 필요하지만 STM에는 필요하지 않습니다. 이 유전자 인 glyceronephosphate O-acyltransferase ( GNPAT )의 인간 ortholog는 rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2 ¹⁴ 에서 돌연변이된다. 상 염색체 열성 장애는 심각한 지적 장애, 발작 및 여러 가지 임상 특징을 특징으로한다. 이러한 맥락에서 구애 조건 조절은 기능적으로 인간의 질병 유전자가 학습과 기억에 미치는 역할을 검증하고 기계 론적 연구를위한 기초를 제공하는 데 사용될 수 있습니다.

프로토콜

참고 : 아래에 요약 된 프로토콜에는 수집, 교육 및 테스트의 복제본이 설명되어 있습니다. 결과의 재현성을 테스트하기 위해 이러한 단계를 병렬로, 여러 날에, 그리고 별도의 파리 그룹으로 반복해야합니다 ( 표 1) . 이 프로토콜은 25 ° C, 70 % 습도 및 12 시간의 명암 사이클 조건에서 파리를 키울 때 정상적인 계란에서 성인까지의 10 일 수명주기를 기반으로합니다. 이 프로토콜의 모든 측면은 조건이 전체 분석을 통해 일정하게 유지된다고 가정합니다. 인큐베이터에서 라이트 켜기 (BLO) 또는 라이트 켜기 (ALO)하기 전 시간은 연구원이 선호하는 시간대에 따라 편리하게 설정할 수 있기 때문에 시간으로 표시됩니다. 순진한 수컷 파리의 초기 수집 및 전 암수 수집을 위해서만 CO ₂ 가스를 사용하십시오. 구혼 컨디셔닝을위한이 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다.

1. 이자형전제 여성 수집 문화 확립
2. 남성 시험 대상자 수집을위한 문화 확립
3. 주택 블록의 준비
4. 표준화 된 전임 암컷의 생산을위한 짝짓기 바이알의 설립
5. 남성 시험 과목 모음
6. 훈련
7. 테스트
8. 비디오 데이터 분석 및 통계

1. 전신 여성 컬렉션 문화 확립

1. 파워 푸드 준비 ¹⁶ . 8 % (w / v) 효모, 2 % (w / v) 효모 추출물, 2 % (w / v) 펩톤, 3 % (w / v) 자당, 6 % 0.05 % (w / v) MgSO ₄ , 및 0.05 % (w / v) CaCl2를 함유하는 용액에 15 분 동안 담지 하였다. 0.05 % (w / v) 메틸 파라벤 (주의 : 독성)과 0.5 % (v / v) 프로피온산 (주의 : 독성)을 첨가하기 전에 용액을 70 ° C로 식힌다. 균질 한 용액을 얻기 위해 50 ℃로 더 냉각하면서 잘 저어 준다.
2. 음식을 먹기 전에실온에서 뚜껑을 덮고, 각 175 mL 플라스틱 바이알에 ~ 50 mL의 파워 푸드를 첨가하십시오. 음식을 더 식히십시오. 바이알을 플러그로 막으십시오.
   참고 : Powerfood는 특히 많은 양의 파리를 생산하기 위해 특별하게 제정 된 특수 식품 혼합물로서 아마도 알을 낳는 것을 유도합니다. Powerfood는 비정형식이 요법과 잠재적 인 인구 밀집 현상이 개발에 영향을 줄 수 있기 때문에 행동 분석에 사용되는 수컷 파리를 생산하는 데 사용되지 않습니다 (2 단계).
3. 11 일째 ( 표 1 ) 파워 피드 바이알에 약 60-100 마리의 파리 (남성과 여성의 혼합)가있는 5-20 개의 야생형 배양을 시작하십시오. 이것들은 4 단계에서 표준화 된 전제 암컷을 생산하는데 사용된다. 유충이 번식 할 수있는 영역을 늘리기 위해 각 바이알에 여과지를 추가하십시오. 이것은 eclose 할 수있는 파리의 수를 증가시킬 것입니다.
4. 실험을 통해 1.1-1.3 단계를 주기적으로 반복하여"표준화 된 전임상 암컷의 생산을위한 짝을 이루는 유리 병 설치"(4 단계).

2. 남성 시험 과목 수집을위한 문화 확립

1. 한천, 0.5 % (w / v) 한천, 2.75 % (w / v) 효모, 5.2 % (w / v) 옥수수 가루, 11 % (w / v) 설탕, 0.05 % ) 메틸 파라벤 및 0.5 % (v / v) 프로피온산을 사용하여 수행 하였다. 플라이 바이알 플러그로 175 mL 플라스틱 바이알을 닫으십시오.
2. - 10 일 ( 표 1 ), 정상적인 음식이 들어있는 각 175mL 유리 병에 약 30 ~ 75 명의 처녀 암컷 ( 재료 / 장비 표 )을 10-20 마리 정도 배치하십시오. 파엽의 표면적을 높이고 생산성을 극대화하기 위해 여과지를 추가하십시오.
3. 유전자형 당 3 ~ 6 개의 175 mL 바이알을 수립하여 필요한 피검자 수를 얻으십시오.
   참고 : 원하는 병의 생산성에 따라 더 많은 약병이 필요할 수 있습니다.otype.

3. 하우징 블록의 준비 ( 그림 2A )

1. 전자 레인지에서 하우징 블록 당 약 50 mL의 파워 푸드를 녹이거나 신선한 상태로 준비하십시오.
2. multidispenser 피펫을 사용하여 96 - 웰, 평면 - 바닥 블록의 각 우물에 powerfood의 500 μL를 추가합니다.
3. 음식물을 실온에서 고화 시키십시오.
4. 블록을 PCR 접착 필름으로 덮고 바늘을 사용하여 우물마다 4 개의 구멍을 만들어 파리에 신선한 공기를 공급하십시오.
5. 각 우물을 열 수 있도록 면도날을 사용하여 각 열 사이에서 접착 필름을 세로로 자릅니다. 블록의 한쪽 끝 부분에 필름을 그대로 두십시오.
6. 블록은 최대 2 일 동안 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
   참고 : 블록을 사용하기 전에 실온으로 재 평형을 유지하십시오.

4. 표준화 된 조기성 암컷의 생산을위한 짝짓기 약병의 설립

1. -1 일에2 시간에서 5 시간까지 BLO로 사전 수집 된 여성 컬렉션 문화의 모든 야생형 파리를 폐기하십시오.
2. 2 시간에서 3 시간 간격으로 ( 예 : 30 분, 2.5 시간 및 5 시간에 ALO)이 바이알에서 흡인기 ( 그림 2B )를 사용하여 파리를 수집하고 소량의 효모가 첨가 된 새로운 파워 푸드 바이알에 넣으십시오 붙여 넣기 및 여과지.
3. 혼잡을 피하고 최적의 짝짓기 분위기를 조성하려면 150-200 개 이상의 파리를 각 새 약병으로 옮기지 마십시오. 최소 25 %의 남성을 제공하여 모든 여성의 교미를 보장하십시오. 실험의 크기를 수용하기 위해 짝짓기 바이알에 충분한 암컷이 있는지 확인하십시오.
   참고 : 이것은 프로토콜의 중요한 단계이므로 새로 접종 한 파리와 늙은 파리, 유충 또는 번데기는 새로운 짝짓기 바이알로 옮겨지지 않아야합니다.
4. 이 "짝이되는 약병"을 4 일 동안 부화시켜 모든 암컷이 교미 할 수있는 충분한 시간을 허용하십시오.

5. 열남성 시험 과목의 과목

1. 2 ~ 3 시간 BLO 인 1 일 ( 표 1 )에 CO ₂ 를 사용하여 수컷 수집 바이알에서 성인 파리를 모두 제거하십시오 (2 단계). 그러나 앞으로 몇 시간 동안 더 많은 파리들이 번성하게하십시오.
2. 다음 5-6 시간 동안 CO ₂ 를 사용하여 매 20-30 분마다 새롭게 처리 된 파리를 제거하고 흡인기 ( 그림 2B )를 사용하여 각 수컷을 하우징 블록 (단계 3)의 개별 우물에 넣으십시오.
3. 접착 PCR 필름으로 웰을 다시 밀봉하십시오.
   참고 : 이는 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 수컷은 자주 수거해야합니다. 수혈 된 수컷은 반투명 복부에서 창백한 색소 침착과 맹장의 존재를 증명할 때, 기립시기와 가까운 주거 구역에서 격리되어야합니다.
   참고 : 흡인기를 부드럽게 사용하면 파리를 옮길 수 있습니다. 그러나, 부적절한 사용은 파리에 스트레스를 줄 것이고, 분석에 차이를 유발할 것이다 (토론 참조).
4. 공동을 목표로유전자형 당 최대 48 마리의 남성을 수색하십시오. 이것은 나이브 및 훈련 된 조건 모두의 분석에 필요한 수컷의 최대 수에 약간의 과잉을 제공하여 이후의 이송 단계에서 약간의 손실을 허용합니다.

6. 훈련

1. CO ₂ 를 사용하여 짝짓기 바이알 (단계 4.2)에서 파리를 제거하고 남성에서 전제 암컷을 분리합니다.
2. 흡인기를 사용하여 새 하우징 블록의 한 열에있는 각 우물에 마취 된 단일 여성을 추가하십시오.
3. 흡인기를 사용하고 마취없이, 5.2 절에서 설정된 하우징 블럭에서 개별적인 순진한 수컷을 전치 암컷이 들어있는 우물로 옮긴다. 수컷을 우물에 넣은 후 즉시 접착 필름으로 다시 밀봉하십시오. 수컷이 도망 칠 수 없도록하십시오.
   참고 : 자연적인 "부정적인 지구력 (geotaxis)"거동을 이용하여 수면기를 흡입 블럭으로 옮기십시오 (토론 참조).
4. 단계 반복충분한 남성 - 여성 쌍이 성립 될 때까지 6.2-6.3. 이상적으로는, 유전형 당 24 쌍, 하우징 블록의 2 개의 전체 행을 구축하십시오. 남은 순진한 남성은 5.2 단계에서 설정 한 원래 주택 블록에 그대로 두십시오.
5. 훈련 기간 동안 수컷 - 암컷 쌍을 그대로 두십시오 ( 표 2 , 그림 1B ).
   참고 :이 시간 동안 남성은 법원에서 전처리 된 여성에 의해 거부됩니다. 학습 및 STM의 경우 교육 기간은 1 시간이며 LTM의 경우 교육 기간은 7-9 ​​시간입니다.
6. 전처리 된 암컷과 수컷을 부드럽게 분리하기 위해 흡인기를 사용하여 훈련을 종료하십시오 ( 표 2 , 그림 1B ). 마취를 사용하지 마십시오. 분리 된 수컷을 새로운 주택 블록에 배치하십시오.
7. 흡입기를 사용하여 모든 순진 남성을 단계 5.2에서 설정된 하우징 블록에서 새 하우징 블록으로 천천히 그리고 마취없이 옮깁니다.
   참고 :이 단계는 STM 및 lea의 경우 선택 사항입니다.LTM을 테스트하기 위해 24 시간 동안 비행하기 때문에 LTM은 매우 중요합니다.
8. STM과 LTM의 경우, 시험 전 (단계 7) 수컷이 각각 1 시간과 24 시간 동안 휴식을 취하게하십시오 ( 표 2 , 그림 1B ).
9. 학습을 위해 훈련 받고 순진한 남성을 즉시 테스트하십시오 (7 단계).

7. 테스트

1. CO ₂ 를 사용하여 짝짓기 바이알 (단계 4.2)에서 파리를 모으고 수컷과 전 암컷을 분리합니다.
2. 암컷이 정상적인 음식을 담고있는 유리 병에서 적어도 1 시간 동안 마취로부터 회복되도록하십시오.
3. 테스트가 시작되기 전에 모든 장비를 준비하려면 비디오 레코더를 미리 장착하십시오 ( 그림 2C ).
4. 학습, STM 및 LTM ( 표 2 , 그림 1B )에 대한 서로 다른 일정에 따라 테스트를 시작합니다. 훈련 직후에 테스트를 수행하십시오.학습을 위해, STM을위한 훈련 후 1 시간, 그리고 LTM을위한 훈련 후 24 시간.
5. 흡인기를 사용하여 배우자가 닫혀있는 상태에서 배우는 것이 시험되고 있다면 (단계 6.7, 훈련 된, 단계 6.8, 순진) 구획실이 닫힌 상태의 절반에 이르기까지, 휴식중인 주택 블록이나 훈련 하우징 블록에서 개별 남성을 부드럽게 옮기십시오 ( 그림 2D 파일 S1을 참고하십시오).
   참고 : 자연스러운 "부정적인 geotaxis"행동의 사용은 남성 파리를 흡인기에서 구애 아레나 (토론)로 옮기는 데 충분해야합니다.
6. 부드럽게 천천히 입문장을 다음 경기장으로 옮기고 모든 18 개의 경기장에 1 명의 수컷이 들어갈 때까지 7.5 단계를 반복하십시오.
7. 흡인기와 CO _2를 사용하지 않고 18 명의 경기장 전부의 나머지 절반에게 사전 준비된 여성 (7.2 단계에서 수집)을 추가합니다.
8. 조심스럽게 우물의 입구가 아래로 향하게하여 구직 챔버를 카메라 아래에 놓습니다 ( 그림 2C ).
9. 수컷과 전제 암컷이 직접 상호 작용할 수 있도록 경기장의 칸막이를 제거하십시오.
10. 적어도 10 분 동안 행동을 기록하기 시작하십시오.
    참고 : 두 개의 카메라 설정을 사용하는 경우 효율성을 극대화하기 위해 두 개의 구애 용 판을 동시에 겹쳐서 기록 할 수 있습니다.
11. 핸드 헬드 진공 청소기를 사용하여 구애 경기장을 비우고 재사용하기 전에 구 求실을 환기 시키십시오.
12. 모든 유전형 및 조건 ( 즉, 순진하고 훈련 된)의 시험이 완료 될 때까지 7.4-7.11 단계를 반복하십시오.

8. 비디오 데이터 분석 및 통계

1. 테스트 기간의 처음 10 분 동안 남성 법원이 각 남성 플라이에 대해 시간의 백분율로 정의한 구애 지수 (CI)를 계산합니다.
   참고 : 이것은 stereotypical 구애 행동을 관찰하여 수동으로 수행 할 수 있습니다 ( 그림 1A ) 또는구애 행동의 자동 부량을위한 컴퓨터 소프트웨어를 부릅니다 (토론).
   참고 : 충분한 통계력을 얻고 CI 데이터의 일관성을 판단하기 위해 3 일 동안 조건 당 40-60 명의 남성을 분석하는 것이 좋습니다.
2. 순진한 남성 (LI = (CI _순진 - CI _연수 ) / _순진 CI _순 )과 비교하여 훈련 된 수컷의 CI 평균 감소율로 정의 된 학습 지수 (LI)를 계산하십시오. 테스트의 각 날에 대해 LI를 평가하고 모든 테스트 일수를 합산 한 누적 LI와 비교하십시오.
3. "Genotype"과 "CI"를 헤더로 사용하여 별도의 2 열 탭 데이터 파일을 만듭니다.
   참고 :이 제목은 대 / 소문자를 구분합니다. 각 CI에 대한 유전자형의 이름은 유전자형에 대한 설명 뒤에 밑줄과 훈련 조건 ( 예 : genotype_N 및 genotype_LTM 등, N = naïve 및 LTM = 장기기억; 예를 보충 파일 S2 참조). 이 주석은 필수적입니다. 왜냐하면 analanner는 "Genotype"열의 첫 번째 밑줄 뒤에 나오는 문자를 기반으로 훈련되고 순진한 파리를 식별 할 것이기 때문입니다.
4. analearn R 스크립트 (Supplemental File S3)를 사용하여 다른 유전자형의 LI 값 사이의 차이에 대한 통계적 유의성을 판단하는 무작위 테스트를 수행하십시오.
   1. "analearn"이라는 함수를 정의하는 R18에 스크립트 (Supplemental File S3)를 제공하십시오.
      참고 : 함수 정의는 다음과 같습니다. analearn <- function (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. R 명령 행에 "analearn ()"을 입력하고 팝업 창을 통해 분석 할 데이터 파일 (8.3 단계에서 생성)을 선택하여 기능을 시작하십시오.
   3. 기준 돌연변이를 선택하십시오.해당 숫자를 입력하고 Enter 키를 눌러 컨트롤 유전자형입니다.
      참고 : 참조 유전자형을 선택한 후 스크립트는 10,000 부트 스트랩 복제를 수행하는 데 몇 초가 걸립니다.
   4. 유전자형, 학습 조건 ( 즉, 학습, STM, 또는 LTM), 평균 CI 평균, 훈련 된 CI, LI, 실험 조건과 비교 한 대조군의 차이를 포함하는 출력 표 (표 3) (LI dif), LI dif의 95 % 신뢰 구간의 하한 (LL) 및 상한 (UL), 및 유의 차가 없을 확률을 나타내는 p 값을 포함한다.
      참고 : analearn은 데이터 파일이있는 디렉토리에 출력 텍스트 파일을 저장합니다. 그러나 출력 테이블은 R-Studio 콘솔에도 나타납니다. 기본 이름은 제공된 데이터 파일의 이름에 따라 구성됩니다.
   5. analarn 함수에는 de를 변경하는 데 사용할 수있는 몇 가지 인수가 있습니다.기능의 오류 설정은 부트 스트랩의 매개 변수를 조정합니다.
      참고 : "nboot"는 부트 스트랩 복제 수를 정의하며 기본적으로 10,000으로 설정됩니다. 이 값은 0보다 큰 정수로 변경할 수 있습니다. 표 5에는 함수의 기본 설정을 변경하는 데 사용할 수있는 몇 가지 인수가 있습니다. 그러나 적은 수의 부트 스트랩 복제로 생성 된 데이터는 사용하지 않는 것이 좋습니다.

결과

구애 조건 분석은 Drosophila 에서 학습과 기억을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이것을 증명하기 위해 여기에 제시된 결과는 Dhap-at의 신경 세포 특이 적 knockdown을 가진 파리에 비해 대조 파리에서 STM과 LTM을 분석합니다. 대조 수컷은 Caenorhabditis elegans 특이 적 유전자 (추정 징크 핑거 단백질 C02F5.12 ^)를 표적으로하는 RNA 간섭 헤어핀 서열을 발현한다. 이 조절 균주는 동일한 유전 적 배경에서 knockdown과 control 사이의 동일한 수의 upstream activation sequence (UAS) 요소를 보장하며 RNAi 시스템의 비특이적 효과를 제어 RNAi 헤어핀이 설명합니다. 대조군 (유전자형 : UAS-dcr2 / +, P {KK108109} VIE-260B / +, elav-Gal4 / + )은 STM ( 그림 3A , p = 1.2 x 10- ⁴ , Mann-Whitney U-test)와 LTM ( 그림 3B , p = 1.2 x 10 ^-4 , Mann-Whitney U-test). 이 결과는이 파리의 정상적인 학습 및 기억 능력을 반영합니다. Dhap-at at davr2 / + (유전자형 : UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / +, elav-Gal4 / + )은 STM에 대한 훈련 된 대 naive 플라이에서 CI의 유의 한 감소를 보여준다 ( 그림 3A , 1.2 x ^10-4 , Mann-Whitney U-test). 그러나, 그들은 LTM 훈련 후에 CI에서 유의 한 감소를 보이지 않았다 ( 그림 3B , p = 0.33, Mann-Whitney U-test). Mann-Whitney U-test는 일부 조건 ( 그림 3A 및 3B )에서 CI 데이터의 비모수 분포로 인한 순진 및 훈련 된 파리의 평균 CI를 비교하는 데 사용되었습니다. CI 분석을 통해 관찰 된 차이점은 각 유전자형에 대한 LI에 반영됩니다.이 차이는 reducti순진한 대 훈련 된 파리의 CI에서 ( 그림 3C ). LTM에 대한 LI는 Dhap-at knockdown 파리 ( p = 0.115, 10,000 bootstrap replicates, 그림 3C , 표 3 )에서 유의하게 낮았지만 STM에 대한 knockdown 파리 에서 Dhap- 0.0034, 10,000 부트 스트랩 복제본, 그림 3C , 표 3 ). 유전자형 사이의 LI의 비교를 위해 Kamyshev et al. ⁷ 이 사용되었습니다. LI는 모집단 데이터 ( 즉, 평균 CI- 평균 및 평균 CI- 훈련)로부터 유도 된 단일 값이기 때문에, 실험적으로 유도 된 분포에 의존하는 표준 통계 방법은 적용되지 않습니다. 랜덤 화 테스트는 배포가 필요 없으며 부트 스트래핑을 사용합니다 ( 예 : 임의 샘플실제 데이터에서 파생 된 가상의 데이터 세트를 생성 할 수 있습니다. analearn 스크립트 (파일 S3)는 각 유전자형에 대해 일련의 가상 LI를 생성하고 대조군과 시험 유전자형 (LIdiff) 간의 차이를 계산합니다. 이 과정을 10,000 번 반복하고 결과 값을 사용하여 LIdiff의 95 % 신뢰 구간을 결정합니다 ( 표 3 ). 이 데이터는 두 유전자형의 LI가 다를 확률을 나타내는 p 값을 생성하는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 결과는 Dhap-at가 LTM에 대해서는 뉴런에 필요하지만 STM에는 필요하지 않음을 보여줍니다.

매일의 변동성을 통제하기 위해 CI와 LI를 반복 일 (replicate days) 사이에서 비교합니다 ( 표 4 ). LI의 변동은 날마다 관찰되지만 결과는 일반적으로 재현 가능합니다. CI 데이터는 컨트롤 str에 따라 크게 달라질 수 있습니다.사용 된 환경 및 테스트 환경 조건 여기에 표시된 CI 데이터는이 컨트롤 유전형에 대해 일반적이지만 다른 유전형은 더 높거나 낮은 평균 CI 및 분포를 나타낼 수 있습니다.

그림 1 : 구애 색인 및 실험 개요 결정. ( A ) 여성 비행에 대한 진부한 남성 구애 행동을 보여주는 이미지. 구배 행동 (I), (II), 날개 진동 (III), 핥기 (IV) 및 교차 시도 (V)와 같은 구애 행동의 다른 단계가 표시됩니다. ( B ) 시간으로 표시된 인큐베이터 라이트 사이클과 관련된 교육 및 테스트 시간의 개략적 개요. 훈련 시간은 막대로 표시되고, STM 및 LTM의 휴식 기간은 점선으로 표시되며 시험 시작점은 화살표로 표시됩니다. 참고로LTM 시험 시간은 훈련 후 하루입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : Drosophila Courtship Conditioning Assay에 사용 된 장비. ( A ) 하우징 블록은 우물 당 500μL의 파워 푸드가있는 평평한 바닥 블록이다. 0.8mm 직경의 주사기 바늘을 사용하여 만든 구멍 당 적어도 4 개의 구멍이있는 qPCR 접착 필름으로 봉인되었습니다. 면도날을 사용하여 개개의 행을 길이 방향으로 절단하여 열고 닫을 수 있습니다. ( B ) 마취제를 사용하지 않고 수컷과 암컷 파리를 부드럽게 옮기는 데 흡인기가 필요합니다. 삽 입기는 흡입기의 끝 부분을 보여 주며 코튼 조각으로 닫혀 있습니다.ep 안에있는 파리들. ( C ) 두 개의 구애 실을 동시에 기록하기위한 두 대의 카메라 시스템 설치. ( D ) 18 개의 경기장이있는 구애 실. 슬라이딩 입구 구멍은 경기장에 파리를 배치하는 데 사용됩니다. 흰색 분배기는 남성과 여성 간의 상호 작용을 시작하기 위해 동시에 열 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 제어 및 Dhap에서의 STM 및 LTM 분석 - 최저 거동. (A) 및 LTM (B)에 대해 테스트 한 Dhap-at knockdown (white) 유전자형의 나이브 (N) 및 훈련 된 (T) 파리의 CI 값 분포를 보여주는 Boxplots . ( C ) CorrespoDhap-at at knockdown 파리는 STM 및 LTM에 대해 테스트되었습니다. 무작위 테스트 (10,000 bootstrap replicates)를 사용하여 대조군과 knockdown 유전형 간의 LI의 차이를 비교했습니다. 오류 막대는 다른 시험 일에 계산 된 LI 값에서 파생 된 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 유전자형은 다음과 같다 : w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; 및 elav-Gal4 / + (대조군) 및 w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; 및 elav-Gal4 / + ( Dhap-at- RNAi). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

	일반	수집	기차	테스트
일 -11	전제 여성 컬렉션 문화 시작 (1.3 단계)
10 월 -10 일	수컷 피험자 수집을위한 문화를 시작하십시오 (2.2 단계).
1 일째		대표. 1
2 일째		대표. 2
3 일째		대표. 삼
4 일째		대표. 4	대표. 1
5 일째			대표. 2	대표. 1
6 일째			대표. 삼	대표. 2
7 일째			대표. 4	대표. 삼
8 일째				대표. 4
9 일째	비디오 데이터 분석 및 통계 (8 단계)
담당자 = 반복

표 1 : 개별 일에 3 개의 복제본에 대한 LTM 테스트 예제 타임 라인.

	배우기	STM	LTM
교육 시간	1 시간.	1 시간.	8 시간.
휴식 시간	0 시간.	1 시간.	~ 24 시간.
훈련 시작	0h. 알로	0 시간. 알로	4 시간. 블로
훈련 중지	1 시간. 알로	1 시간. 알로	4 시간. 알로
시험 시작	1 시간. 알로	2 시간. 알로	0 시간. ALO (다음 날)
ALO = 조명이 켜진 후, BLO = 조명이 켜지 기 전, STM = 단기 기억, LTM = 장기 기억

표 2 : 학습 기간, 교육 시간 및 학습 시간, STM 및 LTM 테스트 시간.

유전자형	배우기 조건	CI 소박한	CI 훈련 된	리	리 차	하한 (95 % 신뢰 구간)	상한 (95 % 신뢰 구간)	p- 값
제어	STM	0.467	0.116	0.752	없음	없음	없음	없음
Dhap-at-RNAi	STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.030	0.265	0.116
제어	LTM	0.590	0.384	0.348	없음	없음	없음	없음
Dhap-at-RNAi	LTM	0.697	0.650	0.068	0.280	0.103	0.446	0.003

표 3 : Analearn 스크립트에서 생성 된 통계 데이터.
analearn 스크립트에서 생성 된 통계 데이터. 유전자형, 학습 조건 (학습, STM, 또는 LTM), 평균 CI 평균, 훈련 된 CI, LI, 실험 조건과 비교 한 대조군의 차이 (LI dif)를 포함하는 부트 스트랩 핑 R 스크립트의 출력 파일 , LI dif의 95 % 신뢰 구간의 하한 (LL) 및 상한 (UL), 그리고 유의 차가 없을 확률을 나타내는 p 값.

		제어			Dhap-at-RNAi
		평균 CI 순진	평균 CI 교육	리	평균 CI 순진	평균 CI 교육	리
STM	1 일째	0.300	0.125	0.584	0.679	0.239	0.648
	둘째 날	0.634	0.107	0.831	0.720	0.276	0.617
	모든 요일	0.467	0.116	0.752	0.699	0.257	0.633
LTM	1 일째	0.590	0.441	0.252	0.630	0.646	-0.027
	둘째 날	0.640	0.363	0.432	0.709	0.710	-0.002
	3 일째	0.547	0.349	0.363	0.738	0.598	0.190
	모든 요일	0.590	0.384	0.348	0.697	0.650	0.068

표 4 : 별도의 테스트 일에 얻은 CI 및 LI 값

"naivelevel"은 각 유전자형에 대해 순진한 값을 식별 할 텍스트를 결정합니다. 기본값은 "N"이지만 다른 영숫자 텍스트로 변경할 수 있습니다.

"refmutation"은 기본적으로 "NA"(적용되지 않음)로 설정되지만 통계 비교를 수행하기 위해 컨트롤 또는 유전자형의 이름으로 변경할 수 있습니다. 이로 인해 script를 사용하여 컨트롤 genotype을 자동으로 선택합니다.

"datname"은 데이터 파일의 이름을 나타내며 기본 파일 선택 대신이 인수에 지정할 수 있습니다.

"헤더"는 데이터 파일에 열 머리글이 포함되어 있는지 여부를 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 기본값은 "TRUE"이지만이 인수가 "FALSE"로 변경되면 헤더가없는 파일을 사용할 수 있습니다.

"seed"는 난수 생성기를 초기화합니다.이 값은 기본적으로 "NA"로 설정되며 스크립트를 사용할 때마다 임의의 숫자가 지정됩니다. 의도적으로 부트 스트랩 분석은 동일한 데이터 파일을 사용하는 경우에도 실행될 때마다 약간 다른 결과를 제공합니다. 시드가 0보다 큰 정수로 지정되면 동일한 일련의 임의의 부트 스트랩 샘플이 얻어집니다.

"써 put "은 출력 파일의 생성 여부를 결정하기 위해"TRUE "또는"FALSE "로 설정할 수 있습니다. 기본값은 "TRUE"입니다.

표 5 : Bootstrapping 매개 변수를 조정하는 함수의 기본 설정을 변경할 수있는 Analearn 함수에 사용 된 인수

보충 파일 S1 : 구혼실 건물 계획. 이 파일은 .stp 확장자 (CAD 파일)를 허용하는 모든 응용 프로그램에서 열 수 있습니다 . 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 파일 S2 : Analearn 스크립트의 입력 파일 예제 .S2.zip "target ="_ blank ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental File S3 : The Analearn.R Acript. 이 파일은 R-studio ^18에서 열 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

구애 조건 분석은 Drosophila의 학습 및 기억 분석을위한 고전적인 패러다임입니다. 여기 제시된 프로토콜은 이전의 ^{6 , 7 , 8 , 9} 에서 설명한 일반적인 방법론을 따르지만 무작위 테스트를위한 실제 지침, 특수 장비 및 데이터 분석 스크립트 ^{9 , 12} 와 같은 고유 한 측면을 포함합니다. 이 프로토콜을 사용하면 96- 웰 평면 블록 ( 그림 2A )을 사용하여 남성을 수집하고 양성하기 위해 다수의 파리를 병렬로 분석 할 수 있습니다. 블록은 PCR 접착 필름으로 밀봉되어있어 필요시 파리에 쉽게 접근 할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 독특한 구애 실은 거의 2 차원 공간에서 18 쌍의 남성 - 여성 쌍을 동시에 쌍으로 만들 수 있습니다.비디오 분석에 최적입니다. 맞춤 설계된 구혼실은 사용하기 쉽고 건물 계획이 제공됩니다 ( 파일 S1 , 그림 2D ). 이 프로토콜은 비디오 데이터 수집에 대한 테스트 주체를 수집하는 데 사용 된 문화를 구축하는 데 약 20 일이 소요됩니다 ( 표 1 ). 비디오 데이터 분석에 추가 시간이 필요합니다. 우리의 경험에서 STM 분석은 매우 강력합니다. LTM 분석법 또한 매우 견고하지만 혼란스러운 환경 변수에보다 민감하므로 숙달하기가 더 어려울 수 있습니다.

동물의 행동은 아주 다양 할 수 있습니다. 따라서이 차이를 줄이려면 프로토콜의 중요한 단계를 신중하게 수행해야합니다. 첫째로, 흡인기 ( 그림 2B )를 부드럽게 사용하면 거칠게 다루거나 너무 강하게 부 풀릴 때 발생할 수있는 스트레스를 줄일 수 있습니다. 개인을 옮길 수있는 방법 제시부정적인 geotaxis를 사용하여 aspirator 밖으로 파리. 파리는 걷기 쉽기 때문에 흡인기의 끝을 위로 향하게 할 수 있습니다. 플라이가 팁에 도달하기 직전에, 플라이를 날려 버리기에는 부드러운 타격으로 충분합니다. 또한 테스트 전에 남성을 구혼 실에 들여 보내기 위해 종종 불어 일으킬 필요가 없습니다.

또 다른 중요한 단계는 남성 테스트 대상의 수집 및 생성입니다. 모든 수컷은 매우 젊고 사회적으로 순진한 상태에서 수집되어야합니다. 이것은 침식의 피크 기간 동안 빈번한 수집에 의해 달성 될 수있다 (단계 5.2). 수컷이 이처럼 긴밀한 기간 내에 수집되지 않으면 조기 사회적 상호 작용이 생길 수 있으며, 이로 인해 학습 수준이 낮거나 CI의 변동성이 커질 수 있습니다. 평가되어야하는 남성 시험 대상의 또 다른 요소는 유전 적 배경입니다. 다른 유전 적 배경은 다른 수준의 순전 한 구혼을 나타내며 일반적 활동이나 운동 능력면에서 다를 수 있습니다. 컴파 때여러 개의 유전자형을 가지고있는 경우 LI 점수에 영향을 줄 수있는 혼란스러운 요소를 피하기 위해 유전 적 배경과 관련하여주의를 기울여야합니다. 또한 CI 데이터의 배포는 신중하게 평가해야합니다. CI 데이터는 유전자형 또는 기타 환경 요인에 따라 파라 메트릭 및 비 파라 메트릭이 될 수 있습니다. 어떤 경우 CI의 분포가 정규 분포에서 크게 벗어난 경우 LI 계산에 평균값이 아닌 평균값 CI를 사용하는 것이 더 나을 수 있습니다. 그러나 우리의 경험에서 평균 또는 평균 CI 사용은 데이터의 통계적 해석에 차이를 만들지 않으며 평균 CI의 사용은 문헌에서 일반적인 관행입니다.

성공적인 구혼 컨디셔닝을 위해서는 훈련 기간 동안 전제 암컷에 의한 남성 구애 시도의 적극적인 거부가 중요합니다. 이 분석에 사용 된 전제 암놈이 효율적으로 교배되고 있는지 확인하는 것이 중요합니다.따라서 교미를 허용하지 않는다. 이 전제 조건은 4 단계에서 준비된 짝짓기 바이알에 수컷과 암컷의 파리가 4 일 동안 함께 수용되도록 설정됩니다 ( 표 1 ). 그 후, 짝짓기는 정기적으로 비디오를 검사하고 훈련 중 남성 - 여성 쌍을 관찰하여 모니터링 할 수 있습니다. 교미가 발생하면 전제 암컷을 준비하는 동안 취할 수있는 몇 가지 조치가 있습니다. 첫째, 전제 암컷은 최적의 번식 조건 하에서 양육되어야한다. 약병은 누룩 표면을 증가시키기 위해 효모 페이스트와 접힌 여과지로 보충 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조건에서 파리의 배양은 과거에 강력한 전제 암컷을 만들었지 만, 이것은 다른 실험실과 다른 유전 변종의 사용과 다를 수 있습니다. 그러므로, 배양 시간과 조건을 변화시켜 전임 암컷의 생성을 최적화 할 필요가있을 수있다.

구애 행동의 정량화이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계. 특수 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수동 또는 자동으로 수행 할 수 있습니다 ⁹ . 자동화 된 정량화는 빠르고 원칙적으로 편견이 없습니다. 몇 가지 프로그램이 ^{21 , 22 , 23에} 게시되었습니다. 그러나 사용하기가 쉽지 않고 전문 비디오 형식 및 고급 계산 기술이 필요한 경우가 종종 있습니다. 수동 부량 측정은 쉽고 정확하지만 노동 집약적이며 개별적인 변동성 및 편견에 영향을받습니다. 이 프로토콜이 CI의 자동 부량에 잠재적으로 필요한 비디오 포맷 요구 사항을 다루지는 않는다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 수동으로 정량화하려면 구애 행위를 정확하게 관찰 할 수있는 충분한 품질의 비디오를 만들 수있는 간단한 비디오 녹화 장치를 사용하십시오. 자동화 된 계량화의 경우,요구 사항은 소프트웨어 사용에 따라 달라 지므로 사용자는 자동화 된 정량화가 필요한 경우 철저히 조사해야합니다.

파리의 유전자 조작에 사용할 수있는 광범위한 도구와 함께, 구애 조건 분석은 학습과 기억에 관련된 분자 메커니즘과 연결 네트워크를 해부하는 데 사용할 수있는 강력한 판독을 제공합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-