ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

요약

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

초록

게놈 전체에 걸친 단백질 -DNA 상호 작용의 매핑은 유전자 조절, 염색질 재구성 및 기타 염색질 상주 과정을 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (X-ChIP-seq)에 따른 포름 알데히이드 가교는 게놈 생물학에 대한 많은 가치있는 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 그러나 X-ChIP-seq는 가교 결합 및 초음파 처리와 관련하여 주목할만한 한계가 있습니다. 네이티브 칩은 가교 결합을 생략함으로써 이러한 결점을 피하지만 종종 크로 마틴 결합 단백질의 빈약 한 회복을 초래합니다. 또한 모든 ChIP 기반 방법은 항체 품질 고려 사항의 적용을받습니다. 단백질을 DNA 변형 효소에 융합시키는 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 효소 적 방법도 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 데 사용되어왔다. 우리는 최근 ChEC-seq와 같은 high-throughput sequencing을 가진 chromatin endogenous cleavage (ChEC)와 같은 방법을 조합했다. ChEC-seq은 염색체 결합체 (chromatin-assoc)의 융합에 의존한다생균 내 칼슘의 존재하에 표적화 된 DNA 절단을 생성하기 위해 미세 구균 핵산 분해 효소 (MNase)에 관심있는 대상 단백질. ChEC-seq은 면역 침전을 기반으로하지 않으며 가교 결합, 초음파 처리, 염색질 가용화 및 항체 품질에 대한 잠재적 인 우려를 회피하면서 최소한의 배경 신호로 고해상도 매핑을 제공합니다. 우리는 ChEC-seq가 ChIP에 대한 강력한 대응 물이 될 것이며, ChIP-seq 발견을 검증하고 게놈 규제에 대한 새로운 통찰력을 발견 할 수있는 독립적 인 수단을 제공 할 것이라고 기대한다.

서문

전사 인자 (TF), 염색질 리모델러 및 기타 염색질 관련 규제 요소의 결합 부위를 매핑하는 것이 모든 염색소 기반 프로세스를 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq) 접근법은 게놈 생물학에 대한 많은 중요한 통찰력을 얻기 위해 사용되었지만 주목할만한 한계가 있습니다. 우리는 최근 이러한 단점을 피하기 위해 염색질 내인성 절단 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq) ¹ 라고하는 대체 방법을 도입했습니다.

ChIP-seq는 단백질 -DNA 상호 작용을 보존하기 위해 초기 포름 알데히드 가교 결합 단계 (X-ChIP-seq)로 수행되는 것이 가장 일반적입니다. 그러나 최근의 여러 연구에 따르면 X-ChIP-seq는 일시적 또는 비특이적 단백질 -DNA 상호 작용을 ^{2 , 3 , 4 , 5} <거짓 양성 결합 부위를 유발하는 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 또한 X-ChIP-seq 실험에서 염색질을 단편화하는 데 일반적으로 사용되는 초음파 처리는 열린 염색질의 영역을 우선적으로 절단하여이 영역에서 단편의 편향된 회수를 유도합니다 ^{9 , 10} . Sonication 또한 exonuclease 소화 단계의 추가가 크게 해상도 ^{11 , 12} 을 향상시킬 수 있지만, 단편 길이의 이질적인 혼합물을 궁극적으로 바인딩 사이트 해상도를 제한한다. 친화도가 높고 자연적으로 분리 된 염색질 (ORGANIC) ¹³ 에서 게놈의 점령 된 영역과 같은 기본 ChIP 방법은 포름 알데히이드 가교 결합 및 초음파 처리와 관련된 잠재적 인 편향을 경감시켜 미세 크로스 캡슐 핵산 분해 효소 (MNase)와 교차 결합 및 크로 마틴 조각을 사용하지 않습니다. 하나,네이티브 염색질 추출에 필요한 비교적 온화한 조건에서 많은 염색질 결합 단백질의 용해도가 낮아 잠재적으로 동적 범위 및 / 또는 거짓 네거티브 ¹⁴ 가 감소합니다.

ChIP-seq의 다양한 반복이 단백질 -DNA 상호 작용의 게놈 - 전체 매핑에 가장 일반적으로 사용되는 반면, 관심있는 단백질과 다양한 DNA- 변형 효소의 융합을 기반으로하는 여러 매핑 기술이 구현되었다. 이러한 접근법 중 하나는 목적하는 염색질 결합 단백질이 댐에 유 전적으로 융합되고이 융합이 세포 또는 동물에서 발현되어 단백질 결합 부위에 인접한 GATC 서열의 메틸화를 초래하는 DNA 아데닌 메틸 전이 효소 동정 (DamID) ¹⁵ 이다. DamID는 면역 침강에 의존하지 않으며 가교 결합, 항체 또는 염색질 가용화를 피할 수 있다는 점에서 유리하다. 그것은 또한 생체 내에서 수행 됩니다. 하나, DamID의 분해능은 킬로베이스 스케일로 제한되며, 댐 융합 단백질의 메틸화 활성은 구성 성이다. 효소 결합에 기초한 두 번째 방법은 트랜스포존에 대한 관심있는 인자의 융합을 이용하여 트랜스포존의 부위 특이 적 통합을 지시하는 Calling Card-seq ¹⁶ 이다. DamID와 마찬가지로, Calling Card-seq은 면역 침강을 기반으로하지 않으므로 증가 된 해상도의 이점이있는 유사한 장점이 있습니다. 그러나, Calling Card-seq은 트랜스포존의 서열 편향에 의해 제한 될 수 있으며 또한 트랜스포존 삽입 부위에 가까운 제한 효소의 존재에 의존한다.

Laemmli 연구실에서 개발 된 세 번째 효소 융합 방법은 염색질 내인성 절단 (ChEC) ¹⁷ 입니다. ChEC에서는 염색질 관련 단백질과 MNase 사이의 융합이 세포에서 발현되며, MNase를 활성화시키기 위해 칼슘을 첨가하면 DNA가 태그가 붙은 결합 부위 근방에서 절단됩니다요인 ( 그림 1 ). Southern blotting과 함께, ChEC는 yeast ^{17 , 18} 에서 다수의 개별 유전자좌에서 염색질 구조와 단백질 결합을 특성화하는데 사용되어 왔으며 ^, 저해상도 마이크로 어레이 분석과 결합하여 핵 세공 성분과 효모의 상호 작용을 조사했다 게놈 ¹⁹ . ChEC는 DamID 및 Calling Card-seq와 유사한 이점을 제공하며, primer extension ^19로 분석 할 때 그 해상도는 거의 단일 염기 쌍이다. ChEC는 또한 조절할 수 있습니다 : MNase에 의한 견고한 DNA 절단은 밀리몰 칼슘의 첨가에 달려있어 MNase는 살아있는 효모 세포에서 관찰되는 낮은 유리 칼슘 농도에서 불활성입니다 ²⁰ .

이전에 우리는 ChEC와 고효율 시퀀싱 (ChEC-seq)을 결합하면 TF 바인딩 사이트의 고해상도 맵을 제공 할 것이라고 가정했습니다. 사실, ChEC-seq는 게놈 ^1을 가로 지르는 신진 효모 일반 조절 인자 (Abf1, Rap1, Reb1)의 고해상도지도를 생성했습니다. 우리는 또한 ChEC-seq를 DNA와 직접 접촉하지 않고 ChIP-seq로지도 화하기 어려울 수있는 메가 달톤 크기의 복합체로 ChEC-seq의 적용 가능성을 확대하는 보존 된 필수 전사 전사 보조 활성제 인 모듈 형 Mediator 복합체에 성공적으로 적용했습니다. 기반 방법. ChEC-seq는 ChIP-seq 결과를 독립적으로 검증하고 염색질 상주 프로세스의 규제에 대한 새로운 통찰력을 창출하는 강력한 방법입니다. 여기, 출연 효모에서이 방법을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

1. 효모 균주의 생성

1. MNase로 태그가 붙은 관심있는 인자를 가진 효모 균주를 생성하십시오.
   1. PCR은 특정 반응 혼합물 ( 표 2 )과 사이클링 조건 ( 표 3 )을 사용하여 원하는 벡터 ( 표 1 )에서 MNase 태깅 카세트를 증폭. 5 μL의 PCR 반응과 1 μL의 6X DNA loading dye를 섞는다. 40 분 동안 120 V에서 0.8 % 아가로 오스 겔에서 각 PCR 분액을 실행합니다. 예상되는 제품 크기는 ~ 2.3kb입니다.
   2. 증폭 된 태깅 카세트를 표준 리튬 아세테이트 변형 ²² 를 사용하여 원하는 스트레인으로 변형시키고 선택을 수행하십시오.
   3. 식민지 PCR과 태그 카세트의 올바른 통합을 확인합니다.
      1. 스크리닝 할 콜로니 수에 대해 지정된 반응 혼합물 ( 표 4 )을 준비합니다. 필요할 때까지 얼음을 계속하십시오.
      2. 각 식민지의 일부를 선택하여 테멸균 된 이쑤시게 또는 pipet 팁을 사용하여 PCR 튜브의 바닥에 ted.
      3. 1 분 동안 고출력으로 집게를 집어 넣습니다.
      4. 혼합하기 위해 각 microwaved 식민지와 pipet에 PCR 믹스 ( 표 4 ) 50 μL를 추가합니다. 지정된 순환 조건을 사용하여 PCR을 수행하십시오 ( 표 5 ).
      5. PCR 반응 50 μL와 각 PCR 튜브에 6X DNA 로딩 염료 10 μL를 직접 섞으십시오. 40 분 동안 120V에서 1 % 아가로 오스 겔에서 각 샘플의 10 μL를 실행합니다. 예상되는 제품 크기는 ~ 700bp입니다.
         참고 : 원하는 경우 Western blotting을 통한 MNase 융합 단백질의 적절한 발현을 확인하십시오. 태그 단백질의 분자량에서 ~ 20.6 킬로 달톤의 변화가 예상된다.
2. pGZ136 (표 1) 및 1.1.2 단계에서와 같은 변형 및 선택에 목적 유전자의 프로모터의 상 동성 기반 클로닝에 의해 무료 MNase 균주를 생성한다.
   1. Alternati다시 말하자면 관심있는 유전자의 프로모터와 3xFLAG-MNase-SV40 NLS를 플라스미드 벡터에 모으고, 1.1.2 단계에서와 같이 형질 전환하고 선택하고, 플라스미드의 유지를위한 적절한 선택 조건으로 변형시킨다.

2. ChEC

1. ChEC 실험 전날 오후 / 저녁에 MNase-tagged factor를 갖는 균주의 단일 콜로니와 함께 3 mL의 효모 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 (YPD) 또는 적절한 선택 배지를 접종한다. 이 배양 물을 밤새 품어주십시오 (180 RPM 흔들림, 30 ° C).
2. ChEC 실험 당일 아침 밤새 배양 물을 50 mL의 배지로 희석하여 600 nm에서의 광학 밀도 (OD ₆₀₀ )가 0.2 - 0.3이되도록하십시오. 0.5 ~ 0.7의 OD ₆₀₀ 에 도달 할 때까지이 배양 물 (180 RPM 흔들어, 30 ° C)을 품어 둔다. 배양 물이 적절한 OD _600에 접근 할 때, 30 ℃로 heat block 또는 water bath를 설정하고 Buffer A 첨가제 ( Ta6).
3. 배양액 당 5 mL의 완충액 A 첨가물 ( 표 6 )을 준비하십시오. 절차 중에 버퍼 A를 실온에 유지하십시오.
4. 수집 할 시점마다 정지 용액 ( 표 7 ) 90 μL 및 10 % SDS 10 μL를 포함하는 microfuge 튜브를 준비합니다. 분석 된 각각의 새로운 요소에 대해 0 초, 30 초, 1 분, 2.5 분, 5 분 및 10 분에 시료를 채취합니다.
5. 배양액을 50 mL 원추형 튜브에 넣고 1,500 xg 및 실온 (RT)에서 1 분간 원심 분리한다.
6. 버퍼 A의 1 ML에 철저하게 세포를 resuspend하고 microfuge 튜브에 resuspended 세포를 전송하십시오. 펠렛은 microfuge에서 세포를 1,500 xg 및 RT에서 30 초 동안 resuspended.
7. 상청액을 흡인하고 철저히 pipetting하여 버퍼 A 1 ML에 세포를 resuspend. 펠렛은 microfuge에서 세포를 1,500 xg 및 RT에서 30 초 동안 resuspended. 이 단계를 한 번 반복하십시오.
8. 철저히 버퍼 A의 570 μL에 세포를 resuspend. 2 % digitonin의 30 μL를 추가(0.1 % 최종 농도) 세포의 permeabilization을 촉진하고, 혼합 반전.
9. 30 ° C에서 5 분간 열 블록 또는 수 욕조에서 세포를 투과시킨다.
10. 세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 반응을 위 아래로 피펫 팅합니다. 중지 솔루션과 SDS (단계 2.4) 및 혼합 소용돌이가 포함 된 microfuge 튜브에 부정적인 컨트롤로 permeabilized 세포의 100 μL 나누어지는을 제거합니다.
11. permeabilized 세포에 1 M CaCl ₂ (최종 농도 2 μM) 1.1 μL를 첨가하여 MNase를 활성화시키고 신속하게 여러 번 반전 시키거나 혼합 시키십시오. 즉시 30 ℃에서 혼합 반응을시키고 타이머를 시작하십시오.
12. 수집 할 각 시점에서 세포를 균등하게 분배하기 위해 반응을 위아래로 pipetting 한 다음 정지 용액과 SDS가 들어있는 미세 다공성 튜브에 permeabilized 세포를 100 μL 나누어 넣고 가볍게 섞습니다. 분석 된 각각의 새로운 요소에 대해 0 초 (CaCl ₂ 첨가 없음), 30 초, 1 분, 2.5 분, 5 분, 및 10 분의 시간 포인트.
    참고 : 30 ° C에서 DNA를 빠르게 절단하는 요인을 사용한 ChEC 실험은 MNase 절단 동역학을 늦추기 위해 저온에서 수행 할 수 있습니다.
13. 모든 시간 점이 수집되면 각 시료에 20 μg / mL proteinase K 4 μL를 넣고 가볍게 섞어 혼합하고 55 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
14. 각 샘플에 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 200 μL를 넣고 격렬히 섞어서 최대 속도와 RT에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
15. 각각의 수성 상 (~ 150 μL)을 새 튜브에 옮깁니다. 글리코겐 30 μg과 100 % 에탄올 500 μL를 넣으십시오. 10 분 동안 또는 용액이 점성을 나타낼 때까지 드라이 아이스에 섞어서 침전 시키도록 격렬하게 가해줍니다.
16. 펠렛은 DNA를 10 분 동안 최대 속도와 4 ℃에서 마이크로 퓨즈로 침전시켰다.
17. 상층 액을 따라 내고 RT 70 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻는다.
18. 에탄올을 가만히 따르고,종이 타월에 튜브를 부드럽게 두드려서. 간단히 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 시료를 회전시키고 잔류 에탄올을 제거하기 위해 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 5 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛.
19. 펠릿이 건조하는 동안, 각각 10mg / mL RNase A의 pH 8.0 + 1 μL의 Tris 29 μL로 건조 펠렛을 resuspend하는 마스터 믹스를 만드십시오. RNA를 37 ° C에서 20 분 동안 분해하십시오.
20. 각 샘플 5 μL와 6X DNA 로딩 염료 1 μL를 섞고 40 분 120 V에서 1.5 % 아가로 오스 겔에 실행합니다.

3. 사이즈 선택

참고 : 크기 선택의 목표는 시퀀싱 할 샘플에서 게놈 DNA의 다중 킬로베이스 단편을 제거하고 ~ 150 bp (뉴 클레오 솜 DNA의 대략 크기) 이하의 단편을 풍부하게하는 것입니다. 시퀀싱 데이터에서, <400 bp의 단편이 풍부 해져서 뉴 클레오 솜 DNA 크기 (~ 150 bp) 주변의 주목할만한 피크와 서브 뉴 클레오 솜 단편의 피크 또는 넓은 분포가 풍부합니다.

1. 각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 ^23에 고상 가역 고정 (SPRI) 비즈 75 μL를 넣고 pipet up과 down 10 회 혼합합니다. 구슬을 품어 : RT에서 5 분 동안 DNA 혼합물.
2. SPRI 비드 인큐베이터 동안, 각 샘플에 대해 10 MM 트리스, pH 8.0 96 μL 및 5 M NaCl 4 μL를 포함하는 microfuge 튜브를 준비합니다.
3. 튜브의 측면에 구슬을 수집하는 자기 랙에 튜브를 놓으십시오. 비드가 튜브의 측면에 2 분 동안 모으도록하십시오.
4. 각 상청액을 Tris와 NaCl이 들어있는 새 튜브에 옮긴다 (3.2 단계).
5. 각 샘플에 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 200 μL를 넣고 혼합하고 최대 속도와 5 분 동안 원심 분리하여 5 분간 원심 분리하십시오.
6. 각 수성 상을 새 튜브에 옮깁니다. 글리코겐 30 μg과 100 % 에탄올 500 μL를 넣으십시오. 10 분 동안 또는 용액이 점성을 나타낼 때까지 드라이 아이스에서 DNA를 침전시킵니다.
7. 펠렛 preci마이크로 스피어에서 최대 속도와 4 ° C에서 10 분간 DNA를 투척했다.
8. 상층 액을 버리고 70 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻는다.
9. 에탄올을 가만히 따르고 종이 타월에 튜브를 뒤집어 부드럽게 두드려 나머지 부분을 제거합니다. 간단히 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 시료를 회전시키고 잔류 에탄올을 제거하기 위해 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 5 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛.
10. Tris, pH 8.0 25 μL로 Resuspend 건조 펠렛. 고감도 분석을 사용하여 시료 농도를 결정하십시오. TF ChEC 실험에서 크기 선택 후 10-100 ng의 DNA가 일상적으로 회수됩니다.
11. 시퀀싱 라이브러리를 준비하십시오. 이전에 설명한 ²⁴ 와 같이 크기 선택에 의존하지 않는 라이브러리 준비 프로토콜은 광범위한 단편 크기 (25-500bp)의 시퀀싱을 허용하는 것이 바람직합니다.
12. 쌍 엔드 모드의 시퀀스 라이브러리. 고품질의 판독을 위해서는 각 말단에 최소 25 염기 서열이 필요합니다.매핑. 1 ~ 2 백만 판독 값은 ChEC 샘플에 대해 충분한 범위를 제공합니다.
    참고 : ChEC-seq 데이터 분석은 복잡한 절차이며이 기사의 범위를 벗어납니다. 데이터 분석에 대한 자세한 정보는 이전 발행물 ^{1 , 21} 에서 찾을 수 있으며 분석에 사용되는 사용자 정의 스크립트는 GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq)에서 사용할 수 있습니다. HOMER ²⁵ (http://homer.salk.edu)는 ChEC-seq 데이터의 명령 행 분석에도 사용할 수 있습니다.

결과

성공적인 ChEC 실험의 경우, 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 DNA 분석은 게놈 DNA의 번짐 및 최종 완전한 소화에 의해 지시 된 바와 같이, DNA 단편화에 따른 칼슘 의존성 증가를 나타낼 것이다. 어떤 경우에는 전통적인 MNase 소화와 비슷한 밴드 사다리가 확장 소화 후에 관찰됩니다. 이것은 nucleosome-depleted regions (NDRs)에 결합하는 일반적인 조절 인자 인 Reb1의 ChEC 분석의 경우?...

토론

우리는 ChEC가 다양한 종류의 효모 단백질을 염색질에 매핑 할 수 있으며, 효모의 다른 계열의 TF 및 기타 염색질 결합 인자에 널리 적용될 것으로 예상합니다. ChEC-seq은 가교 결합, 크로 마틴 가용화 또는 항체가 필요 없다는 점에서 유리하다. 따라서 ChEC는 불완전한 단백질 가용화로 인한 거짓 네거티브와 같은 hyper-ChIPable 아티팩트 ^{3 , 4} 및 기본 칩과 같?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
dNTPs	NEB	N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491L	Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polymerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001	It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, High Purity	EMD Millipore	300410-250MG	Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack	Promega	Z5342