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요약

Glycan microarray를 개발 하 고 광범위 하 게 항 체를 중화 하는 HIV의 프로 파일링에 대 한 사용 설명 되는 산화 알루미늄 코팅 유리에 첨부 파일에 대 한 N-glycans의 합성에 모듈 접근 (ACG 슬라이드) 슬라이드.

초록

우리 N의 광범위의 빠른 준비를 위한 매우 효율적인 방법 제시-oligosaccharides (초과 20000 구조 추정) 인간 glycoproteins에 일반적으로 발견 되는 연결. 원하는 구조 다양성을 달성 하기 위해 전략 뒤에 3-O 및 6-O 에 그들의 stepwise α 선택적 glycosylations oligosaccharyl 불 소 단위의 세 종류의 화학 효소 합성 시작의 위치는 중요 한 β-mannoside 결합 하는 데 일반적인 코어 trisaccharide의만 노 오 스 잔류물. 우리는 더 HIV 항 체와 이종 ligand 상호 작용의 분석에 대 한 공유 혼합된 배열을 만드는 알루미늄 산화물 코팅 유리 (ACG) 슬라이드의 표면에 N-glycans를 첨부. 특히, 남자 (5)는 새로 고립 된 HIV-1 광범위 중화 항 체 (bNAb), PG9, 밀접 하 게 간격 둔된 남자5GlcNAc2 의 혼합물에의 바인딩 동작 및 2, 6-디-sialylated bi antennary 복잡 한 입력 N-glycan (SCT ) ACG 배열, 에이즈 백신 개발을 위한 효과적인 immunogen 디자인 가이드에 새로운 길을 엽니다. 또한, 우리의 ACG 배열 hetero ligand 바인딩 동작에 대 한 다른 HIV 항 체를 연구 하는 강력한 도구를 구현 합니다.

서문

N-glycans glycoproteins에 covalently에 연결 되는 아스파라긴 (Asn) 잔류물 합의 Asn-Xxx-Ser/Thr sequon의 단백질 구조, antigenicity, 가용성, 및 lectin 인식 등 여러 생물 학적 과정에 영향을 1 , 2. 화학 합성 N-연결 된 oligosaccharides 그들의 거 대 한 구조 마이크로 고 높은 분기 건축 때문에 중요 한 합성 챌린지를 나타냅니다. 보호의 신중한 선택 그룹 빌딩 블록, anomeric 센터, 및 발기인의 적절 한 사용에서 선택 달성의 반응성을 조정/activator(s) 복잡 한 oligosaccharides의 합성에서 핵심 요소입니다. 복잡 한이 문제를 해결 하려면 사전 N-glycan 합성 작품의 좋은 금액으로 알려졌다 최근3,4. 이러한 강력한 접근에도 불구 하 고 찾는 다양 한 N-glycans의 준비에 대 한 효과적인 방법 주요 도전 (~ 20000) 남아 있다.

에이즈-1 광범위 한 유전적 다양성 및 중화 항 체 응답에서 탈출 하는 능력의 급속 한 돌연변이 율 에이즈-15,6 에 대 한 안전 하 고 예방 백신을 개발 하는 가장 큰 과제 중 하나입니다. , 7. 에이즈를 사용 하 여 호스트 면역 반응을 피하기 위해 하나의 효과적인 전술 이다 봉투 당단백질 gp120 다양 한 N의 닢 glycosylation-호스트 glycosylation 기계8에서 파생 된 glycans 연결 9. 인간 미 발달 신장 (HEK) 293T 세포에서 재조합 단위체 HIV-1 gp120 glycosylation의 정확한 분석에 대 한 최근 보고서 제안 특성 셀 전용 패턴10 구조 microheterogeneity의 발생 , 11 , 12. 따라서 이해의 HIV-1 bNAbs glycan 특이성 필요 잘 특징이 gp120 N-glycan 구조 분석에 대 한 충분 한 수량에 관련.

Glycan microarray 기술 발견 제공 다양 한 탄수화물 묶는 단백질, 바이러스/박테리아 adhesins, 독 소, 항 체, 및 lectines13,14의 특이성의 높은 처리량 기반 탐사 . 기준점과 칩 기반 형태로 체계적인 glycans 배열 문제가 낮은 선호도 단백질 glycan 상호 작용 multivalent 프레 젠 테이 션15,16,,1718을 통해 결정 합니다. 이 칩 기반 glycan 배열 셀 인터페이스를 효과적으로 모방을 편리 하 게 나타납니다. 기술을 풍부 관련 된 기존의 배열 형식 고르지 못한 문제를 극복 하 고, 우리의 그룹 최근 개발 phosphonic 산-엔드 glycans를 사용 하 여 신호 강도 향상 하는 알루미늄 산화물 코팅 유리 (ACG) 슬라이드에 glycan 배열 동질성, 그리고 감도19,20.

Glycan epitopes 광범위 중화 항 체 (bNAbs) 새로 격리 된 에이즈-1의에 대 한 현재 이해를 개선 하기 위해, 우리는 N의 광범위의 준비에 대 한 매우 효율적인 모듈형 전략 개발-glycans21 연결 22 는 ACG에 인쇄할 슬라이드 ( 그림 1참조). 매우 강력한 bNAb PG9 HIV 분리 되었던의 이종 glycan 바인딩 동작의 특이 한 검출 감염 개인23,,2425를 제공 하는 프로 파일링 연구 에이즈-1 bNAbs ACG 배열에의 한 특이성

프로토콜

1. 준비의 D1/D2 팔 모듈22

  1. 중간 2의 준비
    1. ( 그림 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100mg, 0.204 mmol)에 표시 된) 15 mL 튜브에 재료 1 을 시작 무게와 트리 스 포함 하는 버퍼 (25 m m, pH 7.5)에 용 해 (MnCl2, 10 m m) 5mm의 최종 glycan 농도 달성 하기에 dichloride를 망간
    2. Uridine diphosphate 갈 락 토스 (UDP-Gal)의 2에 해당 추가 합니다.
    3. 효소 β-1, 4 galactosyl transferases 소 우유에서 150 단위를 추가 하 고 37 oC에 대해 15 h에서 혼합물을 품 어.
    4. N15 h, 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) TLC 판에 반응 혼합물을 안보 여 시작 물자의 총 소비를 나타내는 수행, 개발-butanol/아세트산 산/물 (H2O) 1:1에서: 1의 비율 및에 의해 얼룩이 지는 가 열 뒤는 0.25 M 세 륨 암모늄 몰 리브 덴의 솔루션입니다. 다음에 90 oC 5 분 동안가 열 하 여 반응을 끄다.
    5. 3 분, 2,737 x g의 속도에서 반응 혼합물을 원심과 polyacrylamide 젤 열 상단에 상쾌한 로드 ( 재료의 표참조). 드 이온된 증류수를 사용 하 여 열을 elute 고 1-2 mL의 분수와 함께 제품을 수집 합니다.
    6. TLC26, n개발에 의해 수집 된 분수를 모니터링-butanol: H2소개할 초 산 1:1에서: 1 비율, 그리고 세 륨 암모늄 몰 리브 덴은 난방에 의해 다음의 솔루션에 의해 얼룩. 백색 분말으로27 중간 2 (115 mg, 86%)를 분수를 포함 하는 제품을 lyophilize. NMR28 및 질량 분광학29 (보조 데이터 파일을 참조)에 의해 제품 특징.
  2. 중간 3의 준비
    1. 재료 2 ( 그림 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)과 같이) 15 mL 튜브에 시작 무게와 트리 스에서 해산 버퍼 (25 m m, pH 7.5) 포함 MnCl2 (10mm) 5 m m의 최종 glycan 농도 준비 하.
    2. 2 해당 guanosine 5'-diphospho-β-L-fucose disodium 소금 (GDP-Fuc)를 추가 합니다.
    3. 효소 α-1, 헬리코박터 파일로리 (Hp1-3FTΔ26695)에서 3 fucosyl transferases의 150 단위를 추가 하 고 37 oC에 대해 15 h에서 혼합물을 품 어.
    4. 1.1.4 단계를 따릅니다.
    5. 1.1.5 단계를 따릅니다.
    6. 백색 분말으로 단계 1.1.6 중간 3 (82 밀리 그램, 84%)를 따릅니다. NMR 및 질량 분광학 (보조 데이터 파일 참조) 제품 특징.
  3. 모듈 4 및 5의 준비
    1. 복합 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g, 0.360 mmol) 또는 복합 3 p-무게 methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.100 g, 0.125 mmol) 25 mL 단일-목에 둥근 바닥 플라스 크 하 고 30 분 동안 진공에서 건조.
    2. 진공 플라스 크를 제거, 질소 가스와 함께 작성, 추가 자석 저 어 바, 고무 격 막으로 모자 하 고 질소 풍선 첨부.
    3. 0 oC. 볶음 600-700 rpm은 자력을 사용 하 여 실 온에서 12 h에 대 한 결과 반응에서 얼음 목욕에 플라스 크에 건조 pyridine의 7 mL 및 아세트산 무수 (Ac2O) 물 3 mL를 주사. 로타리를 사용 하 여 용 매를 증발 0-진공 압력에서 증발 50 oc.에서 10 mbar
    4. Dichloromethane (DCM) 30 mL를 사용 하 여 원유 혼합물을 희석 하 고 포화 수성 나트륨 수소 탄산염 (NaHCO3)와 추출 (2 x 20 mL) 50 mL separatory 깔때기로.
    5. 다시 DCM (3 x 15 mL)와 수성 층을 추출 하 고 황산에 결합 된 유기 레이어를 건조. 여과 의해 나트륨 황산 염을 제거 하 고 DCM (5 mL)로 씻어. 40 oc.에서 400 mbar 진공 압력에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    6. 실리 카 침대 위에 DCM의 2 개 mL를 원유 혼합물의 솔루션을 로드 합니다.
    7. 톨루엔과 아세톤 톨루엔에 0-20% 아세톤에서를 포함 하는 혼합 열을 elute 고 5-10 mL의 분수를 수집 합니다.
    8. TLC (단계 1.1.4 1.1.6)에 의해 수집 된 분수 톨루엔/아세톤과 개발 모니터링 (7/3), 그리고 세 륨 암모늄 몰 리브 덴의 솔루션 얼룩 난방 뜨거운 접시에.
    9. 분수 회전 증발 기를 사용 하 여 각각 72%와 85% 수율에 하얀 거품으로 원하는 제품을 얻을 수 있는 제품을 증발.
    10. 이기의 7 mL으로 제품을 분해: 톨루엔: H2O는 4에서: 2:1 비율 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에.
    11. 0 o얼음 목욕을 사용 하 여 C에 냉각 하는 동안 세 륨 암모늄 질산염 (2 항목)를 추가 합니다. ~ 500-800 rpm에서 3 h에 대 한 실 온에서 반응을 저 어.
    12. TLC 나타냅니다 시작 물자의 총 소비 후 (TLC 톨루엔/아세톤과 개발 (7/3) 254에서 UV 흡 광도 의해 시각화 하는 nm 또는 세 륨 암모늄 몰 리브 덴은 난방에 의해 다음의 솔루션 얼룩), 반응 혼합물을 희석 에틸 아세테이트 (30 mL) 및 H2O 추출 (15 x 2 mL)
    13. 포화 염화 나트륨 (NaCl) 솔루션의 5 mL와 결합 된 유기 레이어를 추출 합니다.
    14. 40 oc.에서 240 mbar 진공 압력에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    15. 실리 카 침대 위에 DCM의 2 개 mL를 원유 제품의 솔루션을 로드 합니다. 톨루엔과 아세톤 (0-톨루엔 아세톤 20%)를 포함 하는 혼합 열을 elute 고 5-10 mL의 분수를 수집 합니다. TLC, 톨루엔/아세톤과 개발에 의해 수집 된 분수를 모니터링 (7/3).
    16. 화이트 폼으로 원하는 제품 77 mbar 진공 40 oC에서 회전 증발 기를 사용 하 여 제품 포함 된 분수를 증발.
    17. 25 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스 크에 멋진-30 oc. DCM의 10 mL에 각각 알콜 분해
    18. Diethylaminosulfur trifluoride (DAST, 2에 해당)를 추가 합니다. -30 oC 2 h에서 반응 혼합물을 저 어.
    19. TLC 나타냅니다 시작 물자의 소비 후 (TLC 톨루엔/아세톤과 개발 (4/1) 254에서 UV 흡 광도 의해 시각화 하는 nm 또는 세 륨 암모늄 몰 리브 덴은 난방에 의해 다음의 솔루션 얼룩), DCM (30 mL)와 반응 혼합물을 희석 세척 포화 NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. 포화 NaCl 솔루션의 5 mL와 결합 된 유기 레이어를 추출, 추가 무수 황산 마그네슘으로 건조, DCM (5 mL)와 함께 세척을 다음 혼합물 및 필터링 100 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스 크에 수집 합니다.
    21. 40 oc.에서 400 mbar 진공 압력에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    22. 실리 카 침대 위에 DCM의 2 mL에 원유 제품의 솔루션을 로드 합니다. 톨루엔과 아세톤 (톨루엔에 0-20% 아세톤)의 혼합물 및 5-10 mL의 수집 분수 열 elute
    23. TLC, 톨루엔/아세톤과 개발에 의해 수집 된 분수를 모니터링 (7/3).
    24. 분수 회전 증발 기를 사용 하 여 원하는 제품 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-를 포함 하는 제품을 증발 O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 불 소 2 단계 (54%)와 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 화이트 솔리드로 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 불 소 2 단계 (67%).
    25. NMR 및 질량 분광학 (보조 데이터 파일 참조) 제품 특징.

2입니다. Glycan 10의 준비

  1. Intermidiate 7의 준비
    1. 25 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스 크에 실버 triflate (AgOTf) (0.039 g, 0.155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride (Cp2HfCl2) (0.041 g, 0.108 mmol)를 무게, 30 분을 위한 schlenk 선 진공에서 건조에서 그것을 제거 합니다 진공, 하 고 질소 가스와 함께 그것을 채우십시오.
    2. 포함 된 AgOTf 및 Cp2HfCl2플라스 크에는 갓 말린된 4 Å 분자 체 (0.2 g)를 옮기십시오, 자석 저 어 바, 즉시, 심장 모자 더하고 a 질소 풍선 추가.
    3. 마른 유리 주사기는 플라스 크에 3 mL 건조 톨루엔을 전송. 실 온에서 1 h 반응 혼합물을 저 어 하 고 0 oc.에 냉각
    4. 4 (그림 2, g 0.043 0.046 mmol) 기증자 및 수락자 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)의 솔루션을 주입 0에서 10 mL 주사기를 사용 하 여 심장 통해 플라스 크에 3 mL 톨루엔에 carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (그림 3, 0.045 g, 0.031 mmol) o C. 3 h에 대 한 실 온에서 반응 혼합물을 저 어.
    5. TLC 나타냅니다 시작 물자의 소비 후 (TLC, DCM/아세톤 (8.5/1.5)으로 개발 하 고 254에서 UV 흡 광도 의해 시각화 nm 또는 세 륨 암모늄 몰 리브 덴은 난방에 의해 다음의 솔루션 얼룩), 주입 10는 반응이 끄다 triethyl 아민 등가물
    6. 50 mL 둥근 바닥 플라스 크에 celite 침대를 통해 분자 체를 필터링 하 고 추가의 에틸 아세테이트 10 mL로 씻어. 수성 NaHCO3 (2 x 20 mL) 50 mL separatory 깔때기에 포화 솔루션과 결합 된 유기 레이어를 추출 합니다. 에틸 아세테이트 (3 x 15 mL)와 수성 층을 추출 합니다.
    7. 포화 NaCl 솔루션 (5 mL)와 결합 된 유기 레이어를 추출, 무수 황산 마그네슘을 사용 하 여 그것을 건조, 마그네슘 황산 염 제거, 에틸 아세테이트 (3 x 15 mL), 세척 및 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 여과 액을 수집 하는 혼합물을 필터링.
    8. 40 oc.에서 240 mbar 진공 압력에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    9. 실리 카 침대 열 위에 DCM에서 원유 제품의 솔루션을 로드 합니다. DCM 및 아세톤 (DCM에 0-10% 아세톤)를 포함 하는 혼합 열을 elute 고 5-10 mL의 분수를 수집 합니다.
    10. TLC, DCM/아세톤 (8.5/1.5)과 개발에 의해 수집 된 분수를 모니터링 합니다. 증발 얻을 intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[회전 증발 기를 사용 하 여 제품을 포함 하는 분수 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0.052 g, 70%), 하얀 거품으로.
    11. NMR 및 질량 분광학 (보조 데이터 파일 참조) 제품 특징.
  2. Intermidiate 8의 준비
    1. 25 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스 크에 hexasaccharide 7 (그림 3, 0.040 g, 0.016 mmol) 무게를 다 십시오, 1 시간에 대 한 진공에서 건조, 진공에서 그것을 제거, 질소 가스와 함께 작성, 추가 자석 저 어 바 하 고 고무 격 막으로 모자.
    2. Acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 비율)의 3 mL 플라스 크에 전송 합니다.
    3. 추가 p-톨루엔 술 폰 산 토스 (0.001 g, 0.008 mmol) 반응 플라스 크와 볶음 5 h 800 rpm에 반응으로.
    4. TLC 나타냅니다 시작 물자의 소비 후 (TLC, DCM/아세톤 (8.5/1.5)으로 개발 하 고 254에서 UV 흡 광도 의해 시각화 nm 또는 세 륨 암모늄 몰 리브 덴은 난방에 의해 다음의 솔루션 얼룩), 주입 10는 반응이 끄다 triethyl 아민 등가물
    5. 337 40 oc.에 진공 압력 mbar에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    6. DCM의 약 2 mL와 함께 원유 혼합물을 녹이 고 실리 카 침대 위에 그것을 로드.
    7. DCM (DCM에 0-10% 아세톤) 아세톤의 혼합물 및 5-10 mL의 수집 분수 열 elute TLC, DCM/아세톤 (8.5/1.5)과 개발에 의해 수집 된 분수를 모니터링 합니다. 400 mbar 진공 및 40 oc.에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    8. 중간 8, 5에 게 감소 된 압력 하에서 잔류물을 건조-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-아 세 틸-4, 6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3, 6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (그림 3, 0.022 g, 57%)으로 백색 고체. NMR 및 질량 분광학 (보조 데이터 파일 참조) 제품 특징.
  3. Intermidiate 9의 준비
    1. Intermidiate 9 (그림 3)의 준비 5 (0.015 g, 13.2 µmol) 기증자 및 수락자 8 (그림 3, 0.020 g, 8.80 µmol)를 사용 하 여 달성 되었다.
    2. AgOTf (0.011 g, 44.1 µmol) 및 Cp2HfCl2 (0.012 g, 30.8 µmol)는 promotors로 사용 되었다.
    3. 2.1.1 하 2.1.10 중간 9, 5를 단계-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-차원-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-차원-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-차원-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as 흰 거품입니다.
  4. 글로벌 deprotection intermidiate의
    1. 화합물 9 (0.010 g, 2.9 µmol) 25 mL 단일 목 둥근 바닥 플라스 크에 달아 자석 저 어 바, 고무 격 막으로 모자를 추가 하 고 질소 풍선 첨부.
    2. 전송 2 mL의 1, 4 dioxane: H2O (4:1) 플라스 크에. 플라스 크에 수산화 리튬 (LiOH) (0.005 g, wt. 50%)를 추가 합니다. 90-100 oC 12 h에서 반응 혼합물을 저 어 하 고 실시간에 냉각
    3. 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발 건조 한 진공 1 시간에 대 한 아래 플라스 크, 질소 그것을 채울, 진공 매니폴드에서 제거 그리고 고무 격 막으로 모자.
    4. 실시간에 12 h 0 oC. 볶음 반응 혼합물에서 10 mL 주사기를 사용 하 여 심장 통해 플라스 크에 건조 pyridine와 아세트산 무수 물 2 mL 4 mL를 주입
    5. 0-10 mbar 진공 압력 50 oc.에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
    6. DCM의 30 mL를 사용 하 여 원유 혼합물을 녹이 고 포화 수성 NaHCO3 (2 x 20 mL) 50 mL separatory 깔때기에 솔루션을 추출.
    7. 다시 DCM (3 x 15 mL)와 수성 층을 추출 합니다. 로터리 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발.
    8. DCM의 C18 실리 카 침대 위에 약 2 mL에 제품의 솔루션을 로드 합니다. 물과 메탄올의 혼합물으로 열 elute (0-100% 물에 메탄올의) 5-10 mL의 수집.
    9. 제품 분수를 수집 하 고 흰 거품으로 원하는 제품을 감압에서 증발.
    10. 제품 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에에서 건조 메탄올의 5 mL에 녹이 고 고무 격 막으로 모자.
    11. 나트륨 methoxide 메탄올에 쿨 (NaOMe)의 0.1 mL 0 oC 얼음 목욕을 사용 하 여 전송 하 고 12 h에 대 한 혼합물을 저 어.
    12. 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 제거 하 고 건조 한 높은 진공 아래 제품.
    13. 메탄올의 5 mL에 원유 제품 분해: H2소개할 초 산 (6:3:1).
    14. 팔라듐 수산화 (Pd(OH)2) 추가 (50 wt %) 15 h 수소 풍선을 사용 하 여 수소 분위기에서 반응 저 어.
    15. 필터 celite 침대를 통해 반응 및 dd 물 2 mL 뒤 2ml 메탄올으로 세척.
    16. 로터리 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발.
    17. 물 약 1 mL로 원유 혼합물을 녹이 고 polyacrylamide 젤 침대 위에 로드 ( 재료의 표참조). 물으로 제품을 elute 고 1-2 mL의 분수를 수집 합니다.
    18. TLC에 의해 수집 된 분수를 모니터링, n개발-butanol: H2소개할 초 산 (1:1:1).
    19. 제품 분수를 수집 하 고 얻을 원하는 제품 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-(lyophilize α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a 백색 분말입니다.
    20. NMR 및 질량 분광학 (보조 데이터 파일 참조) 제품 특징.

3. Phosphonic 산 꼬리19,22 와 Glycans의 준비

  1. 5 mL 둥근 바닥 플라스 크에 각각 glycan (2-5 µmol) 무게를 다 십시오, 자기 저 어 바, 추가 하 고 고무 격 막으로 모자.
  2. 갓 말린된 dimethylformamide의 400 µ L를 전송 합니다.
  3. 추가 [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) 에틸 (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) 탄산] (10 월 25 일 µmol, 집에서 준비) glycan 솔루션. 5 h 800 rpm에 혼합물을 저 어.
  4. 로터리 증발 기를 사용 하 여 40 oc.에 5-10 mbar 진공 압력에서 용 매를 증발
  5. 물 0.5 mL에 반응 혼합물을 녹이 고 polyacrylamide 젤 침대의 상단에 로드 ( 재료의 표참조). 물을 사용 하 여 제품을 elute 고 1-2 mL의 분수를 수집 합니다.
  6. TLC26에 의해 수집 된 분수를 모니터링 합니다. 반응 혼합물 TLC 판에 고 0.25 M 세 륨 암모늄 몰 리브 덴;의 얼룩 솔루션 추가 뜨거운 접시를 사용 하 여 난방에 의해 따라. 분수를 포함 하는 제품을 수집 하 고 백색 분말으로 원하는 제품을 lyophilize.
  7. 물 2 mL에 제품을 분해 하 고 Pd (OH)2 (체중 50%)를 추가 합니다. 15 h 수소 풍선을 사용 하 여 수소 분위기에서 800 rpm에 반응을 저 어.
  8. 플럭스 소 침대를 통해 반응 필터 및 다음 드 이온화 증류수 2 mL 2ml 메탄올으로 세척. 40 oc.에서 300 mbar 진공 압력에서 회전 증발 기를 사용 하 여 용 매를 증발
  9. 물 약 1 mL로 원유 혼합물을 녹이 고 polyacrylamide 젤 침대 위에 로드 ( 재료의 표참조).
  10. 물으로 제품을 elute 고 1-2 mL의 분수를 수집 합니다. TLC26에 의해 수집 된 분수를 모니터링 합니다. Lyophilize 분수 (액체 질소를 사용 하 여 제품을 동결 후 진공 상태에서 lyophilizer에) 백색 분말으로 원하는 제품을 얻을. NMR 및 질량 분광학 (보조 데이터 파일 참조) D2O를 용 매로 사용 하 여 제품 특징.

4. Glycan 배열

  1. 알루미늄의 준비 코팅 유리 슬라이드 (ACG 슬라이드) 19 , 20 , 22
    참고: 알루미늄 코팅 유리 슬라이드의 제작 얇은 필름 기술, 계측 기술 연구 센터와 국가 적용 연구 실험실, Hsinchu 과학 공원, 대만에서 이루어졌다.
    1. 코팅된 슬라이드 팩, 진공 물개 NAO의 형성을 방지 하 고 유지 하도록 표면 양극에 대 한 전기 화학 반응까지 봉인.
  2. 알루미늄의 표면 양극 코팅 유리 슬라이드 19 , 20 , 22
    1. 4 ° c.에 온도 제어 인큐베이터를 설정 0.3 M 옥살산 용액을 준비 하 고 얼음 목욕에서 그것을 유지. 500 mL 비 커, 자력 바 추가.
    2. 500 mL 비 커에 0.3 M 옥살산을 전송 하 고 솔루션으로 음극 10 cm 오랫동안 백 금 막대 배치. 계속 양극 과정 전반에 걸쳐 옥살산 (300 rpm)에 감동.
    3. 실험실 추적 소프트웨어 설정, 클릭 "설정" 버튼 다음 "선택 청소 전압 기능." 시작 설정 및 전압 25.8 V, 100, 1, 준수 점의 수를 중지 및 지연 1200 ms를 청소 클릭 하십시오 "확인."
    4. 음극으로는 알루미늄 코팅 유리 면을 클램프. "테스트 실행된" 버튼을 클릭 합니다. 전류 측정 (8 ~ 10 mA)를 관찰 합니다.
    5. 표면 양극, 후 슬라이드 더블 증류수로 깨끗이 세척 하 고 질소 가스로 건조 제거 한 다음 추가 사용까지 30% 상대 습도 챔버에 저장.
  3. 제조의 ACG glycan microarray 22
    1. 10 m m 농도에서 에틸렌 글리콜에서 모든 여러차례 glycans (나 사이)의 100 µ L를 개별적으로 준비 합니다.
    2. 100 μ M 농도 만들기 위해 인쇄 버퍼 (80% 에틸렌 글리콜 및 20% 드 이온된 수) 위의 glycan 희석.
    3. Hetero-리간드 연구를 위해 개별 나-사이 glycans의 5 µ L를 준비 하 고 각각 5 µ L 남자5GlcNAc2 (1:1 비율)의 추가.
    4. 로봇에 의해 인쇄 microarrays 핀 ( 재료의 표참조) 0.6의 증 착에 의해 ACG에 이전 준비 glycans의 nL 슬라이드31.
    5. 바인딩 분석 결과 전에 습도 제어 건조 상자에 인쇄 된 슬라이드를 저장 합니다.
  4. 에이즈-1 광범위 중화 항 체 PG9의 glycan epitopes를 매핑 22
    1. 1 mL BSA 포함 준비 PBST 버퍼, 3 %w / v.
    2. 70 µ L PG9의 준비 (50 µ g/mL) PBST 버퍼에서 (BSA 포함 PBST 버퍼, 3 %w / v).
    3. 당나귀 안티 인간 IgG (알 렉 사 Fluor 647 활용) 2 차 형광 태그 항 체의 120 µ L를 준비 PBST 버퍼에 50 µ g/mL (BSA 포함 PBST 버퍼, 3 %w / v) 어둠 속에서.
    4. 1 차적인 항 체 (PG9)와 1:1 비율 (60 µ L 각) 항 체 2 차 형광 태그 믹스. 4 ° c.에 30 분 동안 premixed 항 체를 품 어
    5. 16 웰 스도 나누어져 있는 슬라이드 인큐베이션 챔버에 ACG 슬라이드를 로드 합니다. Glycan 배열에 premixed 항 체의 100 µ L를 전송 하 고 16 h 4 ° C에서 품 어.
    6. 피펫으로 premixed 항 체 밖 으로입니다. 슬라이드 배양 챔버를 제거 합니다.
    7. PBST 버퍼에 슬라이드를 먼저 씻어 (PBS와 0.05% 트윈-20), 뒤에 드 이온된 수와 스핀 2000 x g에서 건조.
    8. Microarray 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다 ( 재료의 표참조). 기준점과 기능 아래로 슬라이드를 삽입 합니다.
    9. "설정" 메뉴에서 클릭, 이미지 해상도, 픽셀 당 5 µ m와 파장 635에를 설정 PMT450와 100% 전원 nm.
    10. 슬라이드 이미징 시작 하려면 "검색" 버튼을 클릭 합니다.
    11. Tif 형식에 스캔 이미지를 저장 하려면 "파일" 아이콘을 클릭 합니다.
    12. 소프트웨어 사용자 가이드32에 따라 이미지 분석을 수행 합니다.
    13. 형광의 전체 강도 계산 하 고 이미지 처리 소프트웨어33 를 사용 하 여 설명 ( 재료의 표참조).
      참고: 여기, 모든 데이터 요소에 대 한 평균 백분율 오차 오차 막대에 의해 제공 됩니다.

결과

다양 한 N-glycans의 합성에 대 한 모듈형 화학 효소 전략은 그림 1에 표시 됩니다. 전략은 다양성 α-특정 mannosylation는 3-O 및 6-O 에 다음 세 가지 중요 한 모듈의 화학 효소 합성 하 여 처음에 만들 수 있습니다는 사실에 근거한 일반적인만 노 오 스 잔류물의 위치 trisaccharide Nglycans의 핵심. Bi-트라이-, tetra antennary 복합 형식 N<...

토론

에이즈-1 bNAbs PG9, PG16, 및 PGTs 128, 141-145를 포함 한 클래스 중화 HIV-1 분리 순환의 70-80%에서 매우 강력한 보고 했다. 이러한 bNAbs epitopes는 높은 전체 HIV-1 그룹 M의 변종 중 보존, 그러므로 그들은 유도 중화 항 체23,24,25 에이즈 백신에 대 한 효과적인 immunogen 디자인을 안내할 수 있습니다. . 에이즈-1 광범위 하 게 항 체를 중화의 glyca...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 얇은 영화 기술, 계측 기술 연구 센터 (ITRC)와 국가 적용 연구 실험실, Hsinchu 과학 공원, 대만 감사합니다. 이 작품은 국가 과학 위원회에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. 대부분 105-0210-01-13-01) 및 학계 Sinica.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma Aldrich64197
AcetonitrileSigma Aldrich75058
Acetic anhydrideSigma Aldrich108247
Anhydrous magnesium sulfateSigma Aldrich7487889
Boron trifluoride ethyl etherateSigma Aldrich109637
Bovine serum albuminSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamideBio-Rad1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichlorideSigma Aldrich12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milkSigma Aldrich48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Cerium ammonium molybdateTCIC1794
Cerium ammonium nitrateSigma Aldrich16774213
Clean glass slide Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acidSigma Aldrich3063716
Deuterated chloroformSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugatedJackson Immuno Research, USA709605098
DichloromethaneSigma Aldrich75092
Diethylaminosulfur trifluorideSigma Aldrich38078090
DimethylformamideSigma Aldrich68122
Ethyl acetateSigma Aldrich141786
Ethylene glycolAcros Organic107211
FAST frame slide incubation chambersSigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 software Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis)moleculardeviceswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing )GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxideSigma Aldrich1310652
Manganese chlorideSigma Aldrich7773015
MethanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Oxalic acidAcros Organic144627
Palladium hydroxideSigma Aldrich12135227
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific 10010023
PyridineSigma Aldrich110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrateSigma Aldrich773476
Silver triflateSigma Aldrich2923286
Sodium bicarbonateSigma Aldrich144558
Sodium chlorideSigma Aldrich7647145
Sodium hydrogen carbonateSigma Aldrich144558
Sodium methoxide Sigma Aldrich124414
Sodium sulfateSigma Aldrich7757826
Toluene Sigma Aldrich108883
Tris buffer AmrescoN/AUltra-pure grade
Tween-20Amresco9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose)Sigma Aldrich137868521

참고문헌

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