ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

요약

우리는 개별 효모 세포의 증식 표현형을 정량화하기위한 방법을 제시한다.이 효소 세포는 누룩의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling 평가라고 불리는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라 난다. 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포의 인구 이질성을 직접 관찰하고 정량화 할 수 있습니다.

초록

미생물의 성장 phenotypes은 근본적인 유전 적 적합성의 강력한 지표이며, 3 가지 성장 체제 : 래그 - 위상, 로그 - 위상 및 정지 - 위상으로 분리 될 수있다. 각 성장 단계는 다양한 환경 적 및 유전 적 조건과 관련된 적합성의 다른 측면을 나타낼 수 있습니다. 3 가지 성장 단계의 고해상도 및 정량 측정은 일반적으로 어렵습니다. 여기에서는 효모의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling Evaluation이라는 분석법을 사용하여 고체 배지에서 3 가지 성장 단계를 모두 특성화하는 상세한 방법을 제시합니다. ODELAY는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라는 개별 세포의 성장 표현형을 정량화합니다. 이 방법은 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포에서 각 성장 매개 변수로 개체 이질성을 직접 관찰 할 수 있습니다. 이 집단의 이질성은 유전 적 및 후 성적 규제를 이해하는 독특한 관점을 제공하며유전 및 환경 섭동. ODELAY 방법은 효모를 사용하여 시연되지만 밝은 영역 현미경으로 보이는 모든 콜로니 형성 미생물에 활용할 수 있습니다.

서문

미생물의 성장 phenotypes은 주어진 환경 조건에 대한 근본적인 유전 적 적합성의 강력한 지표입니다. 성장은 고전적으로 3 개의 다른 성장 체제로 구분됩니다 : 지연 기, 로그 기 및 정지상 성장 ¹ . 각 성장 단계는 다양한 환경 적 및 유전 적 조건에 따라 달라지는 적합성의 다른 측면을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 유기체가 기하 급수적 인 성장을 시작하기 전에 지연 단계에 머무르는 시간 또는 지연 시간은 변화된 환경 조건에 반응하는 유기체의 능력을 나타낼 수 있습니다 ² . 생체 적합도의 가장 보편적 인 측정 기준 인 로그 - 위상 성장 동안 배가되는 시간은 복제를 위해 환경 물질을 대사 및 이용함으로써 생물체가 분열하는 능력의 전반적인 효율성을 보여줍니다. 로그 위상 이후의 성장이 급격히 감소하는 고정 위상 (stationary phase)은 피트니스의 또 다른 지표로, 규칙적인spot-based 효모 성장 분석에서 성장 종점으로 사용됩니다.

몇몇 효모 성장 분석은 현재 이용 가능하며 효모 ^{3 , 4 , 5} 에서 성장 표현형을 평가하기위한 표준 방법으로 고려됩니다. 이 분석법은 주로 고체 또는 액체 배지에서 효모를 성장시키는 방법을 기본으로합니다. 고체 배지에서, 콜로니 피닝 분석은 핀으로 고체 한천에 소수의 세포를 옮기고 효모 세포는 정의 된 기간 동안 성장하도록 허용됩니다. 식민지가 그 다음에 이미지화되고 종단점에서 크기가 비교된다. 이러한 콜로니 고정 분석법은 유전체 와이드 스크린을 생성하기 위해 견고하고 확장 성이 입증되었습니다. 최근에는 flat-bed 스캐너와 SLR (Single Lens Reflex) 카메라를 사용하는 주기적 이미징이 이러한 분석에 통합되어 시간 경과에 따른 콜로니 증가를 기록합니다 ^{7 , 8, 9} . 그러나, 이들 장치의 해상도는 단일 세포를 검출하는 것을 방해하므로, 이러한 콜로니 피닝 검정법은 래그 시간을 직접 관찰하지 않고 콜로니로 성장하는 개별 세포들 사이의 변이를 관찰 할 수 없다.

액체 기반 성장 분석은 또한 게놈 전체 화면을 수행하기 위해 사용되었습니다 ³ . 시간 경과 현미경으로 액체 성장 분석을 결합하면 유전 적으로 동일한 개별 세포의 배가 시간에 인구 이질성이 나타 났으며 이는 유전 조절과 환경 적응을 이해하는 데 중요한 관점을 제공합니다. 그러나이 분석은 지연 시간 및 운반 용량과 같은 다른 성장 측면을 측정하지 않습니다. 여기에 우리는 ODELAY ¹¹ 이라는 분석법을 사용하여 고체 배지에서 미생물을 형성하는 세 가지 성장 단계를 특성화하는 방법을 제시합니다. ODELAY는 utili로 구성되어 있습니다.높은 처리량의 시간 경과 현미경으로 고체 세포에서 단일 세포가 식민지로 자라는 이미지를 기록합니다. 식민지로 자라는이 개별 세포 집단은 종말 종점 점수와 같은 덜 민감한 측정치에 의해 검출되지 않는 근본적인 개체 이질성을 나타낸다. 우리는 효모에 대한 방법을 시연하지만, ODELAY는 명 시야 현미경에서 대조를 보이는 모든 유기체에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 아가로 오스 겔의 제조

1. 고순도 아가 로스 2 g을 칭량한다.
2. 500 ML 병에 아가로 오스를 추가하고 그들의 결합 질량을 기록합니다.
3. 2g 아가로 오스와 150g의 초순수를 넣은 병의 목표 질량을 계산 한 다음이 목표 질량의 0.1g 이내의 초순수 150g을 더하십시오.
4. 병의 질량과 아가로 오스와 물을 적어 둡니다.
5. 전자 레인지에 병을 놓고 아가로 오스를 가열하면서 물의 증발을 최소화하기 위해 위에 병이 느슨한 캡을 병에 넣었는지 확인하십시오.
6. 15-20 초 동안 병을 전자 렌지 한 다음 병을 소용돌이 치면서 아가로 오스와 물을 혼합합니다. 용액이 끓고 혼합물이 균일해질 때까지이 과정을 반복하십시오.
   주의 : 병에서 나오는 증기가 피부에 닿지 않도록주의하십시오. 또한, 병이 만지면 뜨거워지고 부상을 피하기 위해 오토 클레이브 장갑과 같은 적절한 보호 장치가 필요합니다.
7. 용융 된 아가로 오스가 균일 한 후에, 병을 다시 계량하고 원래의 질량 0.1g 이내의 초순수를 첨가한다. 이것은 증발로 인해 손실 된 물을 대체 할 것입니다.
8. 용융 된 아가로 오스가 고형화되기 전에 동질성을 보장하기 위해 추가 된 물에서 혼합되도록 소용돌이 친다.
9. 9 - 50 mL 플라스틱 튜브에 아가로 오스 15.2 g을 분주합니다.
10. 필요할 때까지 튜브를 냉장 보관하십시오.

2. ODELAY Agarose Media의 준비

1. 마그네틱 스터 바를 사용하여 온화하게 저어 주면서 핫 플레이트 위에 덮은 비이커에서 끓여야 할 탈 이온수 400 mL를 가열한다.
2. 단계 1.10의 50 mL 원추형 튜브에서 15.2 g 아가로 오스 분취 량에 10X 배지 ( 예 : 효모 추출 펩톤 (YEP) 또는 완전 보충 혼합물 (CSM)) 2 mL를 첨가하십시오.
   참고 : CSM 매체는 유리 슬라이드에 붙어있는 경향이 있습니다. CSM 배지를 사용하는 경우 배지에 멸균 수에 50 % wt 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 5 μL를 넣으십시오. PEG는gar가 곰팡이가 풀리는 동안 유리 슬라이드에 달라 붙지 않으며 효모의 성장을 억제하지 않습니다.
3. 필요한 경우 100X 영양 보충제를 추가하고 물을 사용하여이 단계에서 총 부피를 1 mL로 만듭니다.
4. 단계 2.1에서 끓는 물에 50 ML 원추형 튜브를 배치하기 전에 추가 미디어와 보충제와 아가로 오스 나누어지는 무게.
5. 16 분 후, 50 ML 튜브를 꺼내고 와동을 사용하여 혼합물을 균질. 캡을 50 mL 원추형 튜브에 단단히 조입니다.
   참고 : 비이커의 뚜껑은 튜브 전체를 고르게 가열하는 데 도움이됩니다. 그렇지 않으면 고체 아가로 오스 필름이 형성되고 용해되지 않을 수 있습니다. 또한이 시간 동안 아가로 오스 몰드를 조립하는 것이 편리합니다 ( 그림 1 ).
6. 소용돌이를 사용하여 혼합물을 균질화하십시오.
7. 모든 한천이 섞이고 녹을 수 있도록 추가로 2 분간 끓으십시오.
8. 튜브를 계량하고 잃어버린 질량을 초 순수한 멸균 수로 대체하십시오.
9. 10X carbon-sour 2 mL를 넣는다.( 예 , 20 % w / v 글루코오스)에 넣고 와동시켜 아가로 오스 배지를 얻으십시오.
   참고 : 유리 슬라이드 분리 : 금형을 조립할 때 긴 스페이서가 올바른 방향으로 금형에 배치되도록주의해야합니다. 이것은 레이저가 아크릴을 자르므로 정확히 90 °면 대신 약간 각진면이있는 부분을 남기는 원뿔 모양으로 절단하는 경향이 있기 때문입니다. 그런 다음 곰팡이가 한천에서 유리를 릴리스 benchtop에 배치되면, 스페이서의 가장자리는 한천과 예각에 있어야합니다. 예리한 각도는 몰드 스페이서의 바깥 쪽 모서리가 아래쪽 모서리를 중심으로 선회하면서 ( 그림 1 참조) 한천의 가장자리를 위쪽 유리 조각에서 멀리 떨어지게합니다. 그 결과 유리 한천과 한천이 더 일관되게 분리됩니다.
   참고 : 기름, 실리콘 스프레이 또는 상업용 창문 처리와 같이 유리에 적용되는 곰팡이 제거제는 오염을 일으킬 수 있으므로 사용하지 않아야합니다. 우연한 한천의 양상으로 성장을 억제 할 수 있습니다. 이 방법은 일관성있게 실행됩니다.
10. 70 % 에탄올로 2 in x 3 in x 1 mm 두께의 유리 슬라이드 4 개를 청소하고 강제 공기를 사용하여 말립니다.
11. 70 % 에탄올로 깨끗한 아크릴 몰드를 건조시키고 그림 1 과 같이 조립합니다. 그림과 같이 세 개의 밑 부분을 가져 와서 두 개의 동일한 부분이 세 번째 부분을 끼 웁니다 ( 그림 1B ). 두 개의 작은 바인더 클립 ( 그림 1C )을 사용하여 각면의 기본 부품을 고정하십시오. 몰드에 직립기를 놓고 레이저 절단이 올바르게 배치되었는지 확인하십시오 ( 그림 1E ).
12. 청소하고 말린 유리 슬라이드를 금형에 놓고 다른쪽에 두 번째 유리 슬라이드를 놓고 제자리에 고정합니다. 큰 바인더 클립으로 어셈블리를 고정하십시오 ( 그림 1D ). 큰 바인더 클립으로 두 슬라이드를 모두 내립니다 (lass = "xfig"> 그림 1D). 상단 바인더 클립이 아크릴과 겹치는 유리 슬라이드에 닿아 있는지 확인하십시오.
13. 나머지 바인더 클립을 추가하십시오. 다시 말하지만, 클램프가 아크릴과 겹치는 슬라이드와 접촉해야합니다 ( 그림 1D ).
    참고 : 조립 된 금형을 용융 한천으로 채우기 전에 금형의 내부면을 따라 녹은 한천 배지 약 70 μL를 피펫 팅하여 모서리를 밀봉하십시오. 이 한천은 신속하게 고형화하여 누출을 예방합니다.
14. 용융 한천으로 곰팡이를 채우고 곰팡이에 공기 방울이 쌓이지 않도록하십시오.
    참고 : 이것은 금형의 가장자리를 따라 녹은 한천을 천천히 pipetting하여 수행 할 수 있습니다. 채워진 후 주변 온도가 약 23 ° 일 때 40 분에서 1 시간 동안 금형을 식히십시오. 너무 오래 냉각 시키면 한천이 곰팡이로 부서 질 수 있습니다.
    참고 : 몰드 분리 : 캐스트 한천에서 몰드를 적절하게 제거하는 것은 균일 한 솔리드를 확보하는 데 필수적입니다효모 성장을위한 한천 패드. 이 단계에서 금형을 효율적으로 분리하지 못하면 고체 한천 패드의 불완전성에 기인 한 성장 차이가 발생합니다. 이 단계를 몇 번 연습하는 것이 좋습니다.
15. 아래쪽 바인더 클립을 제거하여 시작하십시오. 3 개의 샌드위치 피스로 구성된 몰드의 바닥 부분을 제거하십시오. 압축하여 슬라이드를 누른 다음 바인더 클립을 제거하십시오. 바인더 클립을 제거하는 동안 몰드면을 부딪 히지 않도록하십시오. 그러면 미디어가 변형됩니다.
16. 금형을 벤치 탑의 가장자리에 놓고 금형의 파란색 점이있는면이 위를 향하게하고 왼쪽 아래 모서리에 놓습니다 ( 그림 1E ). 아크릴 아래의 엄지와 상단의 첫 번째 손가락을 금형의 안쪽 가장자리쪽으로 놓습니다.
17. 몰드 스페이서를 아래쪽 모서리 주위로 회전시키는 것처럼 천천히 조심스럽게 엄지 손가락으로 밀어냅니다 ( 그림 1F ). 상수 적용그러나 천천히 증가 압력. 사용자는 틈이 보이고 상단 유리가 금형 스페이서를 덮고있는 선을 따라 공기 방울이 나타납니다.
18. 초기 브레이크 라인을보고 나서 엄지 손가락으로 계속 누르고 일정한 압력을가하십시오. 한천은이 시점에서 유리에서 떨어져 나가기 시작해야합니다 ( 그림 1F ). 금형을 위쪽으로 계속 돌리십시오. 이렇게하면 유리가 미끄러지지 않고 들어 올려집니다. 한천이 유리에서 벗겨지는 라인은 초기 브레이크 라인에서 계속 이동해야합니다.
    참고 :이 시점에서 한천은 유리의 아래쪽과 위쪽 모두에 달라 붙습니다. 이것은 종종 가장 왼쪽 가장자리에서 발생합니다. 변형 된 지역이 효모가 발견되는 지역에 있지 않은 한, 이것은 괜찮을 것입니다.
19. 유리가 완전히 자유 로워지면 유리를 잡고 금형에서 완전히 제거하십시오. 그런 다음 비슷한 운동을 사용하여 다른 몰드 피스를 제거하여 한천을 움직이지 않고 조각을 들어 올리십시오. 슬라이드를살균 된 고순도의 물이 담긴 멸균 팁 상자. 상자를 닫고 4 ° CO / N에 보관하여 다음날 사용하십시오. 더 오래 보관하면 성장률이 일정하지 않게됩니다.

3. 오델레이 문화 준비

1. O / N 성장을위한 96- 웰 플레이트에 균주를 배치한다.
2. 다음날, 새로운 플레이트 220 μL 총 볼륨 200 μL 미디어에 야간 문화 20 μL를 희석.
3. 플레이트 판독기에서 각 문화 600 nm (OD600)에서 광학 밀도를 측정합니다. 플레이트 판독기와 액체 취급 로봇을 사용하여 3.3.1 - 3.3.6 단계의 자동화 된 희석 프로토콜을 따르십시오. 플레이트에서 배양 물을 약 0.1 OD600 (옵션)까지 수동으로 희석하십시오.
   1. 플레이트 리더에서 '새로 만들기'아래의 '실험'을 누릅니다. ODELAYDilution.exp를 선택하고 실험을 실행하십시오. 실험 이름을 ODELAY "날짜" "시간" "실험 이름"반복으로 입력하십시오.
   2. s를 클릭하십시오.통계 탭을 클릭 한 다음 Excel 아이콘을 클릭하십시오. 데이터를 엄지 드라이브에 저장하고 액체 취급 로봇 컴퓨터로 전송하십시오.
   3. 로봇의 레이아웃 및 메소드 편집기를 엽니 다. 메서드 파일 "ODELAYDilution_v1.med"를 엽니 다. 실행 파일 "Convert_SynergyFiles.exe"를 실행하십시오. 목표 OD600에 대해 0.09를 입력하십시오.
   4. "Glu Correction"과 "Gal Correction"을 0.05로 클릭하십시오. 동일한 판에서 공 매체를 측정하십시오. "파일 생성"을 클릭하십시오. 메소드 편집기에서 파일을 선택하십시오. stoplight 아이콘을 클릭하여 런타임 희석 프로그램을 여는 방법을 시작하십시오.
   5. 튜브가 뚜껑이 닫히고 플레이트에 뚜껑이 제거되었는지, 먼지 커버가 팁에서 제거되었는지 확인하십시오. 덱 레이아웃에 표시된대로 플레이트, 튜브 및 팁을 액체 취급 로봇의 덱에 적재합니다.
   6. 희석 프로그램을 실행하려면 "재생"버튼을 클릭하십시오. 올바른 50μL 팁 수를 선택하십시오. 300 μL 팁의 정확한 수를 선택하십시오. 잠깐.프로세스가 실행될 12 분.
4. 로봇에서 희석 플레이트를 가져 와서 팁을 덮고 15 mL 배지 튜브를 다시 채 웁니다. 30 ° C에서 5 ~ 6 시간 동안 배양하십시오.
5. 두 번째 희석을 시작하기 약 1-2 시간 전에 현미경 용 인큐베이션 챔버를 켜십시오. 실험에 필요한 온도 또는 온도에서 평형을 이루도록하십시오.
6. 희석 단계 3.3 - 3.4를 반복하지만, 아가로 오스 슬라이드에서 문화를 발견에 대한 0.01 - 0.02의 OD600에 문화를 희석.
7. 희석 판을 금속제 냉동 실로 덮으십시오.
8. 플레이트 ( 그림 2A )를 잡고 원심 분리기 금속 버킷 - 피팅을 사용하여 얼음 물에 떠있는 플레이트와 함께 30 초 동안 희석 판을 얼음 욕조에서 초음파 처리하십시오. 희석 판에서 초음파 처리 한 배양 물을 평평한 바닥 판에 옮긴다. 4 x 96- 웰 평평한 바닥 판 1, 2, 3 및 4에 라벨을 붙이십시오 ( 그림 2B ).
   1. 전송 150 &웰 A01 - D06의 희석 플레이트 중 # 181 L을 플레이트 1의 웰 C04 - F09에 넣습니다. 그런 다음 희석 플레이트 150 μL를 웰 A07 - D12에서 플레이트 2의 웰 C04 - F09로 옮기고 150 μL 희석 플레이트의 웰 E01-H06으로부터 웰 C04-F09로 라벨링 된 플레이트 3. 최종적으로 150㎕의 희석 플레이트를 웰 E07-H12로부터 4로 표시된 플레이트의 웰 C04-F09로 옮긴다.
9. 한천에 스폿 팅 (Spotting on Agar) 4 단계로 이동하십시오.

4. 자동화 된 액체 검출 로봇을 이용한 한천에 스팟 팅

1. 가습 멸균 피펫 상자에서 4 ° CO / N (단계 2.19에서)에 저장된 아가로 오스 슬라이드를 제거합니다.
2. 필요한 경우 슬라이드 챔버에 잘 맞는지 확인하기 위해 깨끗한 면도날을 사용하여 아가로 오스 배지 모서리를 잘라냅니다.
3. 마운트에서 슬라이드 클램프를 분리합니다. 조심스럽게 한천 플레이트를 무대 챔버 마운트의 오목한 곳에 놓습니다.
   참고 : 또는슬라이드의 ientation은 실험에서 실험까지 일관됩니다.
4. 클램프가 챔버의 바닥과 평평한 지 확인하십시오. 구부러진 경우 슬라이드가 움푹 들어간 부분에 완전히 장착되지 않았을 수 있습니다. 스폿 팅 로봇의 중앙 플레이트 위치에 수평 조절기 스페이서를 놓습니다. 이 스페이서는 슬라이드 챔버가 팁으로 수평을 유지할 수 있도록 수평 조절 나사에 대한 접촉을 제공합니다.
5. 접시를 사분면 순으로 놓습니다. 플레이트 1, 2, 3 및 4는 왼쪽에서 오른쪽으로 정렬됩니다 ( 그림 2B ).
6. 내부 24 개의 우물 C04 - F09가 4 개의 빈 팁 상자에 팁으로 가득 찰 수 있도록 팁을 배치하십시오. 다섯 번째 상자는 C10 위치에 팁 하나와 A01, A12, H01 및 H12 위치에서 끝이 잘린 4 개의 팁이 필요합니다. 이러한 4 개의 절단 팁은 팁 플레이트 클램프 ( 그림 2C 및 2D )의 안정성을 제공합니다.
7. sl에서 윗면 덮개를 제거하십시오ide 챔버 장착.
8. 첫 번째 팁 펀치를 로봇 컨트롤 스포팅 프로그램의 시작 사이트에 놓습니다. 이것은 아가로 오스에 구멍을 내고 원점 좌표를 맞추기 위해 나중에 사용됩니다. 액체 처리 로봇에 플레이트 1을 놓고 첫 번째 사분면을 찾습니다. 뚜껑이 제거되었는지 확인하고 얼룩 프로그램을 계속하십시오.
9. 모든 스팟이 있는지 확인하십시오. 또한 마를 때까지 30 초 정도 기다려야합니다. 반점이 직경 약 1 mm 일 때, 프로그램은 계속 될 수 있습니다. 바이오 팁 용기에 사용 된 팁을 비우고 로봇에 신선한 팁을 둡니다. 두 ^번째 사분면 플레이트에 대해 플레이트 1을 교체하십시오.
10. 세 번째 사분면에 대해 반복하십시오. 그리고 4 사분면에 대해 다시 반복하십시오.
11. 얼룩이 마르면 슬라이드 챔버 덮개를 다시 끼 우고 뒤집으십시오.
12. 에어 필터가 달린 튜빙 연결부를 설치하십시오.
13. 챔버의 윗면에 유리 슬라이드를 놓습니다.
    참고 :이 슬라이드는 줄이기 위해 중요합니다.한천에 열유속을 가하고 챔버의 객관적 인 커버 슬립면에 응축이 형성되는 것을 최소화합니다. 이 커버 슬립을 잊지 마라. 현미경 구성에 따라,이 커버 슬립은 조명 측면으로부터의 열이 대물 측에 결로를 일으키는 것을 방지합니다.
14. 챔버의 객관적인 측면에 뜨거운 공기를 불어 넣는 팬을 배치하십시오. 이 팬은 커버 슬립에 결로가 생기는 것을 방지합니다. 버블 러를 통과하는 공기 유량을 10 mL / min으로 설정하십시오.

5. 현미경으로 ODELAY 실행하기

1. "ODELAY_Microscope_Control.m"스크립트를 실행하십시오.
2. "셔터"를 클릭하여 전송 된 광 셔터를 연 다음 "초점"버튼을 클릭하여 높은 카메라 속도를 시작하십시오 ( 그림 3A , 빨간색 화살표).
3. "원점 이동"을 클릭하고 무대를 움직여 한천에서 천공 된 원점을 찾으십시오.
4. 그런 다음 오른쪽으로 약간 움직여지역 E07에서 발견 된 효모 세포에 초점을 맞 춥니 다.
5. 원점 펀치로 다시 이동하여 시야에 놓습니다.
6. "set"버튼 ( 그림 3A , 파란색 화살표)을 눌러 원점을이 값으로 설정하십시오. 이제 H18 위치로 이동하고 그 위치에 가장 가까운 육각형 나사를 사용하여 초점을 맞 춥니 다. 그런 다음 위치 L07로 이동하고 그 위치에 가장 가까운 육각형 나사를 사용하여 초점을 맞 춥니 다. 그런 다음 위치 E07로 이동하고 그 위치에 가장 가까운 육각형 나사를 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
7. 해당 위치에 초점이 맞춰질 때까지 필요에 따라 5.5 - 5.7 단계를 반복하십시오.
8. 지점 E12, H12, L12의 중앙과 가장자리의 초점을 확인하십시오. Z- 값으로 표시된 초점 Z- 값이 ± 자동 초점 범위보다 큰 경우 자동 초점 범위를 조정하십시오 ( 예 : 자동 초점 범위를 60 μm로 설정하십시오. 중심점의 Z- 값은 ± 40 ㎛).
9. 리셋 버튼을 누르면 버튼 속성이 활성화되고 버튼을 누릅니다.ODELAY ( 그림 3A , 녹색 화살표). 데이터를 저장할 디렉토리를 선택하십시오. 충분한 드라이브 공간이 있는지 확인하십시오.
   참고 : 현미경은 48 시간 동안 또는 프로그램이 종료 될 때까지 데이터를 수집합니다.

6. ODELAY 데이터 처리

1. ODELAY_IPT.exe를 열거 나 스크립트 ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m ( 그림 3C )을 사용하십시오.
2. * ODELAYExpDisc.xlsx 스프레드 시트를 준비하십시오.
3. B1 셀에 실험의 이름을 지정합니다.
4. 이미지 파일 E07 - H18이 저장된 이미지 디렉토리를 선택하십시오.
5. 데이터를 쓸 데이터 디렉토리를 선택하십시오.
6. 실험이 셀 B04에 시작된 날짜를 적습니다. MM / DD / YYYY 형식을 사용하십시오.
7. 희석 시간을 셀 C04에 씁니다. 이 시간은 첫 번째 이미지를 수집하기 약 5 분 전입니다. HH : MMpm 형식을 사용하십시오. 여기서 HH는 h이고 MM은 분입니다.
8. t에 따라 스트레인 이름을 추가하십시오.소스 플레이트 (단계 3.1). 균주가 발견되는 방식으로 인해 ODELAY 아가로 오스 슬라이드에서 재 배열됩니다. 스프레드 시트 B31-B126의 셀은 소스 플레이트이고 셀 C31-C126은 ODELAY 한천 플레이트의 스폿 위치입니다.
9. 그런 다음 "Process Data"버튼을 누르고 방금 준비한 * ODELAYExpDisc.xlsx를 선택하십시오.
10. 데이터 처리에 사용 된 컴퓨터 시스템에 따라 16-24 시간을 기다리십시오.
11. 이미지가 처리되면 "ODELAY Well Data"라는 디렉토리와 "* _Index_ODELAYData.mat"파일이 나타납니다. "Load Data"버튼을 누르고 방금 생성 된 "* _Index_ODELAYData.mat"파일을 선택하십시오. 방금 처리 된 데이터 세트가로드됩니다. 파일 이름의 "*"는 Excel 스프레드 시트에 입력 된 실험 이름에 따라 나열됩니다.
12. 데이터를로드 한 후 아래쪽에있는 시간 막대를 사용하여 검사하고 이미지 사각형을 클릭하여 성장 곡선을 봅니다 f또는 그 자리, 또는 왼쪽에있는 목록에서 관심의 우물을 찾은 다음 그 목록에 대한 이미지를로드 할 수 있습니다.
13. "Violin Plot"버튼을 눌러 인구 증가 매개 변수의 히스토그램을 생성하십시오. 그러면 그림 4 또는 그림 6 과 같은 플롯이 생성됩니다.

결과

시간 경과 현미경으로 성장하는 효모의 예제 이미지는 그림 3B에 표시됩니다. 시간 경과 영상을 처리 한 후 효모 균주 BY4741 및 BY4742를 비교하는 대표적인 데이터 세트가 그림 4에 나와 있습니다. 이 예제 데이터 세트에서는 플레이트의 서로 다른 위치 사이에서 배가 시간이 거의 변하지 않았습니다. 아가로 오스 매체가 제대로 준비되지 않은 경우, 아가로 오스 겔의 변형 된 영역과 일치하는 스폿 위치에서 두 배가되는 시간과 지연 시간에 명백한 편차가있을 것입니다. 두 배의 시간은 상대적으로 균일 한 것처럼 보이지만,이 예는 지연 시간 측정의 변화를 보여줍니다. 보다 일관된 데이터 세트가 그림 6에 나와 있습니다. 이 데이터 세트에서 지연 시간과 배가 시간은 일정합니다.

files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
그림 1 : Agar Mold Assembly.
한천 몰드의 성분은 ( A )에 표시되어있다. ( B )와 같이베이스를 조립 한 다음 작은 바인더 클립으로베이스를 고정하십시오. 더 긴 수직 조각을베이스의 공동 ( C )에 놓은 다음 ( D )와 같이 슬라이드를 몰드에 넣습니다. 유리 슬라이드 ( E )에서 한천을 일관되게 분리하는 데 필요한 금형 절단 각도 및 금형 각도를 보여주는 측면도. 엄지 손가락과 집게 손가락의 위치와 한천의 직선을 슬라이드 ( F )에서 분리하고 수평 화살표를 확인하십시오. 분리 선은 수직 화살표 방향으로 균등하게 떨어져야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

= "jove_content"fo : keep-together.within-page = "1">
그림 2 : Sonication 및 스포팅 방법.
플레이트를 얼음물로 초음파 처리하고 원심 분리기 버킷 홀더를 사용하여 플레이트 ( A )를 받쳐줍니다. 아가로 오스 판 ( B )에 점을 찍기 위해 3.8.1 단계의 판을 놓으십시오. 또한 가장 왼쪽의 팁 상자에 C10 위치에 팁 하나가 있고 그 다음 4 개의 다른 끝이 잘려있어 플레이트 홀더 ( C )가 부러지지 않도록 팁을 정렬하십시오. 나머지 24 개의 팁을 4 개의 상자에 놓고 내부 24 개의 팁 위치가 채워지도록하십시오 ( D ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

55879fig3.jpg "/>
그림 3 : ODELAY 그래픽 사용자 인터페이스.
"ODELAY_Microscopecontrol.m"( A )에 대한 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린 샷. 이 인터페이스는 카메라를 모니터링하고 epifluorescent 및 bright-field 모드의 현미경 조명 설정을 조정합니다. 빨간색 화살표는 Focus 및 Transmitted 버튼을 가리키고 카메라를 활성화하여 이미지를 빠르게 획득하고 전송 된 광 셔터를 각각 엽니 다. 파란색 화살표는 원점에 대한 스테이지 이동 및 "원점 이동"버튼과 "설정"버튼으로 원점을 설정하는 데 사용됩니다. 녹색 화살표가 "재설정"및 "ODELAY !!!"를 가리 킵니다. 버튼을 사용하여 ODELAY 이미지 모드를 현재 상태로 재설정하고 ODELAY 이미지 수집을 시작합니다. 얼룩이 진 후 0, 3, 6, 9 시간에 고체 배지에서 성장하는 효모의 저속 영상 ( B ). "ODELAY_IPT.m"또는 th에 대한 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린 샷 e ODELAY 이미지 처리 도구 ( C ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : ODELAY 출력의 예.
이 데이터 세트는 YPD 미디어의 BY4741 및 BY4742 변형을 비교합니다. 이 그림은 잘 준비된 아가로 오스 슬라이드의 예입니다. 그러나 자동 초점 설정이 최적이 아닙니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 각 열에 표시되는 데이터는 다음과 같습니다. 식민지 영역의 Log ₂ 에 수용 할 수있는 용량. 분당 시간, 분 단위로 주어진다. 지체 시간 (min). 이 예제에서 한천 슬라이드의 모든 스팟의 배가 시간은 칼럼을 향한 두 배의 증가 된 시간으로 잘 정렬됩니다. 그러나 지연 시간은이 데이터 세트에서 상당히 다릅니다._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : 성장 곡선의 예.
이 예는 불량한 초기 초점으로 인해 예상 지연 시간 (t _지연 )이 증가 할 수있는 ( A ) 반면 인접 위치는 지연 시간이 더 짧다는 것을 보여줍니다 ( B ). t _d 는 분 단위의 배가 시간이고 t _lag 는 분 단위의 지연 시간입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 : 잘 실행 된 테스트 실험의 예
전자텅스텐 할로겐 전구를 다이오드 조명 장치로 교체하고 자동 초점이 올바르게 설정되었는지 확인한 후 BY4742 스트레인의 한 예. 모든 배증 시간은 잘 겹치고 지연 시간은 일정한 것처럼 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

ODELAY 분석법은 재현 가능하고 신뢰할 수있는 표현형 측정을 보장하기위한 몇 가지 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 첫 번째 중요한 점은 효모 배양 물의 일관된 준비입니다. 로그 성장에서 효모 세포를 수확하기 위해주의를 기울여야합니다. 양식이 포화 된 경우, 개체군의 이질성이 증가하여 유전 적 또는 환경 적 요인 ( 예 : 탄소원)으로 인한 이질성을 혼란스럽게 할 수 있습니다 ¹¹ . 두 번째 중요한 점은 일관된 미디어 준비입니다. 일반적으로 대량의 10X 스톡 미디어 솔루션을 생성 한 다음 배치 효과를 최소화하기 위해 시간 경과에 따라 사용해야합니다. 가능하면 체중으로 배지를 배합하는 것은 한천의 밀도와 아가로 오스의 전체 수분 함량을 면밀히 관찰함으로써 시간이 지남에 따라 배지의 일관성을 향상시키는 데 도움이됩니다. 세 번째 중요한 포인트는 아가로 오스의 기계적 변형을 최소화하거나 제거하는 것입니다.dia. 매체의 기계적 변형은 유리 슬라이드에서 아가로 오스를 분리하는 동안 가장 일반적으로 발생합니다. 많은 실험 기술과 마찬가지로이 단계를 익히려면 실습이 필요합니다.

도 4 에 도시 된 바와 같은 지연 시간의 변화는 종종 아가로 오스 배지의 기계적 변형, 성형 된 한천 두께의 변화 또는 불안정한 광원과 같은 3 가지 요인 중 하나와 관련된다. 아가로 오스 매체가 얼룩이 지어진 어레이에서 Z 높이가 변하면 높이 변화가 자동 초점 루틴의 범위를 압도하여 초기 이미지의 초점이 약간 벗어날 수 있습니다. 이러한 이유 때문에 중앙의 여러 지점에서 스포트라이트 된 어레이의 가장자리를 따라 초점 높이를 확인하여 자동 초점 루틴이 초점을 찾을 수있는 충분한 Z 범위를 갖도록하십시오. 필요한 경우 자동 초점 패널을 사용하여 초점 범위를 늘리고 초점 단계 수를 늘립니다.

세 번째 가능한 조건이온은 불안정하거나 깜박 거리는 광원으로 특정 Z 높이에 대해 계산 된 초점 점수를 방해 할 수 있습니다. 텅스텐 할로겐 전구는 전구가 다 타기 전에 잘 깜박입니다. 열악한 초점의 효과는 성장 곡선이 제 1 및 제 2 시점 ( 도 5a ) 사이에서 감소하고, 인접한 지점이 동일한 딥 ( 도 5b )을 갖지 않는 일례에서 관찰된다. 이 경우, 빈약 한 초점 상태는 텅스텐 할로겐 광원을 대체함으로써 완화되었다.

실제로 저자들은 100W 텅스텐 할로겐 전구의 깜박 거림을 줄이기 위해 현미경을 많이 사용할 때 500 시간마다 또는 대략 2 개월마다 전구를 교체해야한다는 사실을 발견했습니다. 깜박 거리는 전구로 인한 초점 문제를 피하려면 텅스텐 할로겐 광원을 자주 교체하거나 할로겐 전구를 다이오드 광원으로 교체하십시오. 안그림 6 은 배가 시간의 변화가 적고 균일 한 지연 시간을 보이는 데이터 세트의 예입니다. 이 데이터 세트는 오토 포커스를 수행하는 동안 시간이 지남에 따라 더 안정적인 조명을 제공하는 다이오드 조명 장치로 촬영되었습니다.

문헌에서 미디어 준비를 최적화하기 위해 여기에 언급 된 많은 점들이 명백하게 보일 수 있지만, 대부분의 대규모 스크린은 서로 잘 복제되지 않습니다 ^{8 , 11} . 따라서, 우리는 재현 가능한 표현형 스크린이 생성 될 수 있도록 배양 물 및 아가 로스 배지의 준비를주의 깊게 기술 하였다.

ODELAY 분석법은 합성 유전자 배열이나 Scan-O-Matic 분석법과 같은 피닝 기반 분석법과 비교할 때 현재 처리량이 제한적입니다. 이 방법은 측정되는 균주의 수를 증가 시키지만, 개별 세포를 분해하는 능력은 부족합니다.그러므로 우리는 clonal 효모 균주 내에서 관찰 된 개체 이질성을 측정 할 수 없다. 이 개체의 이질성의 기원은 현재 이해되지 않지만 여기에 설명 된대로 기술과 계산의 병합은 기본 세포 메커니즘을 객관적으로 다루기위한 기회를 제공합니다 ¹² .

저자는 ODELAY가 현재 특정 현미경 브랜드 및 신체 유형에 대해서만 최적화되어 있음을 참고하고자합니다. 다른 현미경 시스템 용으로 ODELAY를 수정하는 것은 간단하지만 오픈 소스 API ^13에 대한 지식이 필요합니다. 그러나 API와 ODELAY 스크립트는 서로 다른 시스템과 실험 분석에 쉽게 적용 할 수 있도록 작성되었습니다.

ODELAY는 원래 효모를 위해 개발되었지만 변형없이 Mycobacterium smegmatis의 성장을 관찰 할 수있었습니다. 미생물을 형성하는 다른 콜로니의 관찰은제공된 소스 코드에 대한 변경으로 가능 ¹¹ . 일반적으로, ODELAY는 다양한 환경 조건과 유전 섭동 하에서 성장한 미생물을 비교하기위한 강력하고 유연한 도구입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
Yeast Strain BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Yeast Strain BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 mL Falcon tubes	Corning	430291	1 case
15 mL Falcon tubes	Corning	352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross	VWR	48382-179
96-well plate flat bottom	Corning	353072
Hydra liquid handleing robot	Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot	Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Plate Reader	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope	Leica
Leica 10X/0.3NA objective	Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds			www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings