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요약

전통적인 슬랩 젤 전기 영동 (SGE) 실험은 복잡한 장치와 높은 화학 물질 소비가 필요합니다. 이 연구는 단시간 내에 DNA 단편을 분리하는 저비용 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

슬래브 겔 전기 영동 (SGE)은 DNA 단편을 분리하는 가장 일반적인 방법입니다. 따라서 그것은 생물학 및 다른 분야에 광범위하게 적용됩니다. 그러나 전통적인 SGE 프로토콜은 매우 지루하고 실험에 많은 시간이 걸립니다. 또한, SGE 실험에서 화학 물질 소비가 매우 높습니다. 이 연구는 SGE 칩을 기반으로 DNA 조각을 분리하는 간단한 방법을 제안한다. 이 칩은 조각 기계로 만든다. 두 개의 플라스틱 시트가 광 신호의 여기 및 방출 파장에 사용됩니다. DNA 밴드의 형광 신호는 스마트 폰으로 수집됩니다. 이 방법을 확인하기 위해 50, 100 및 1,000 bp DNA 사다리를 분리했습니다. 결과는 5,000 bp보다 작은 DNA 사다리가이 방법을 사용할 때 12 분 이내에 고해상도로 분석 할 수 있음을 보여 주며 전통적인 SGE 방법에 대한 이상적인 대체품임을 나타냅니다.

서문

슬랩 겔 전기 영동 (SGE)은 DNA 단편 분리 1 , 2 , 3 , 4 , 5 에 가장 효과적인 방법이며 따라서 생화학 및 생물학적 분석에서 다용도 도구로 간주됩니다 6 , 7 , 8 . 그러나 많은 실험에서 SGE가 다음 네 가지 문제에 의해 제한된다는 것을 나타냅니다. (1) 분리에는 수 시간이 걸리고 심지어 며칠이 걸립니다. (2) 화학 물질 소비가 매우 높다. (3) 복잡한 장치 ( 예 : 2D 전기 영동 세포, 전기 영동 전원 및 겔 이미징 시스템)가 필요합니다. (4) 겔 영상 시스템은 실험이 끝났을 때 분리 된 DNA 조각만을 관찰 할 수있다. 또한, SGE 9 에서 일반적으로 사용되는 ethidium bromide (EtBr)10 = 돌연변이 유발 및 암 유발 11,12 . 따라서 EtBr이 들어있는 젤을 나눠 줄 때는 항상 장갑을 착용해야합니다.

모세관 전기 영동 (CE)은 자동 작동, 짧은 분리 시간, 낮은 소비 등과 같은 SGE에 비해 13 , 14 , 15 , 16 , 17의 다양한 장점을 가지고 있습니다. 그러나 CE 장비는 꽤 비쌉니다. 따라서 이러한 한계를 극복하기 위해 DNA 분리를위한 시스템이 개발되었습니다 ( 그림 1 ). 이러한 시스템은 화학 물질 소비를 크게 줄이고 SGE 실험 시간 (8 분 미만)을 절약 할 수있을뿐만 아니라 스마트 폰을 통해 아가로 오스 겔에서 DNA 분리 과정을 실시간으로 추적 할 수도 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 절차를 따르면, 학생들은SGE 칩을 설계 및 제작하고, 칩에서 아가 로스 겔을 준비하고, 스마트 폰으로 간단한 SGE 시스템을 설치하고 아가로 오스 겔에서 DNA 이동 과정을 기록 할 수 있어야한다.

프로토콜

1. SGE 칩의 기본 설계

  1. 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 또는 폴리 카보네이트와 같은 투명 플라스틱을 사용하십시오.
    참고 : SGE 칩은 그림 1B 에 나와 있습니다. SGE 칩은 TBE 버퍼 용 원통형 구멍, DNA 분리 용 채널 및 전극 용 구멍을 따라 삽입 된 2 개의 차선으로 구성됩니다.
  2. 레이저 조각기를 사용하여 PMMA 블록에서 SGE 채널 어레이를 제작하십시오.
    참고 : 칩의 기하학적 매개 변수는 분리 할 DNA의 크기에 따라 다릅니다. 예를 들어, DNA 조각이 1,000bp보다 작 으면 SGE 칩의 최적 채널 매개 변수는 2.5mm x 4.0mm x 90mm (폭 x 깊이 x 길이)입니다.
  3. SGE 디자인을 기반으로 DNA 샘플을로드하기 위해 칩에 우물을 만들기 위해 빗을 제작하십시오.

2. 아가로 오스 겔의 제조

  1. 10 × TBE (1 × TBE =89 mM 트리스, 89 mM 붕산 및 2 mM EDTA; pH 8.4) 및 증류수를 1:19 비율로 혼합 하였다.
  2. 100-bp DNA 사다리를 분리하기위한 1.0 % 아가 로즈 겔을 준비한다.
    참고 : 0.5x TBE 버퍼에서 아가로 오스의 농도는 분리 할 DNA 단편의 크기에 따라 다릅니다.
  3. 플라스크에 0.1 g의 아가로 오스를 넣고 0.5 x TBE 완충액 10 mL를 넣는다.
    참고 : 준비된 용액의 부피는 플라스크 용량의 1/3보다 적어야합니다.
  4. 플라스크를 방부제 필름으로 밀봉 한 다음 전자 레인지 (중간, 1.0 분)에서 아가로 오스 / 버퍼 혼합물을 가열하십시오. 플라스크를 전자 렌지에 넣기 전에 방폭이 될 경우 방수 필름에 구멍을 뚫습니다.
  5. SGE 칩의 4 채널에 녹인 아가로 오스 솔루션 2.7 ML을 부어. 우물을 만들기 위해 빗을 아가로 오스 용액에 넣으십시오.
    참고 : 녹은 아가로 오스 솔루션은 실온에서 3 분 후 겔 상태로 냉각됩니다.
  6. g에서 빗을 꺼냅니다.겔을 덮고 0.5x TBE 완충액 0.9 mL를 넣어 젤을 덮는다.

3. SGE 칩에서 전기 영동 실행하기

  1. LED 광원을 켜고 광원 위에 425 ~ 505 nm 밴드 패스 필터를 놓습니다.
  2. 100 bp DNA 사다리 14.4 μL와 SYBR Green 1.6 μL를 볼텍스를 사용하여 섞는다.
  3. SGE 칩 ( 그림 2 )에서 아가로 오스 겔의 각 우물에 혼합물 4 μL를 적재하십시오.
  4. SGE 칩의 두 차선에 전극을 놓습니다.
  5. SGE 칩 위에 550 ~ 700 nm 밴드 패스 필터를 배치하십시오.
  6. 전원을 켜십시오. 전기 전압을 180V (20V / cm)로 설정하십시오. 스마트 폰을 켜서 DNA 단편 분리 과정을 기록하십시오 ( 그림 3 ).
  7. 10 분 후에 전기 영동이 끝나면 전원과 LED 표시등을 끕니다.
  8. SGE 칩을 청소하십시오.

결과

그림 4 , 그림 5 및 그림 6 은 50, 100 및 1,000 bp DNA 사다리의 겔 전기 영동 후 일반적인 결과를 나타냅니다. 실험 후, DNA 조각은 잘 분리되었다. 또한 동일한 샘플을 SGE 칩의 4 개 채널에서 분리하여 동일한 크기의 DNA 조각이 각 실험에서 동일한 거리로 이동 함을 보여줍니다.

DNA 사다리의 분리 성능은 이동 거...

토론

아가 로스 겔 전기 영동은 DNA, RNA 및 단백질 분리에 널리 사용됩니다. 이 연구는 전통적인 겔 전기 영동 프로토콜을 대체 할 새로운 방법을 제안합니다. 결과는 50, 100 및 1,000 bp DNA 사다리가 작은 조립 장치에서 잘 분리 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 거의 화학 물질을 소비하지 않고 핵산을 분리 할 수있을뿐만 아니라 분리 과정을 기록 할 수 있다는 것입니다. ...

공개

이해 충돌이 선언되지 않습니다.

감사의 말

우리는 중국 국립 자연 과학 재단 (No 21205078)과 중국 고등 교육 박사 과정 프로그램 (No.20123120110002)의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFB1102303), 중국의 국가 기본 연구 프로그램 (973 프로그램 2015CB352001) 및 중국 자연 과학 재단 (61378060)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10×TBEBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.T1051
50 bp DNA ladderTakara Bio Inc.3421A
100 bp DNA ladderTakara Bio Inc.3422A
1 kbp DNA ladderTakara Bio Inc.3426A
SYBR GREENTakara Bio Inc.5760A
AgaroseSigma-Aldrich CorporateV900510

참고문헌

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
  3. Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  5. Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
  6. Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
  7. Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
  8. Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
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  11. Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
  12. Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
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  14. Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
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  17. Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
  18. Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).

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