혀의 기계적 및 점탄성 특성에 대한 생체 내 평가

요약

우리는 혀의 근육의 음색과 점탄성을 결정하기위한 마취 된 쥐 모델에서 수술 과정을 설명합니다. 절차는 hypoglossal 신경의 특정 자극과 수동 Lissajous 힘 / 변형 곡선의 근육에 적용이 포함됩니다.

초록

혀는 대부분 척추 동물의 입 바닥에 매우 신경이 분산되고 혈관이 형성된 근육 수압 장치입니다. 그것의 1 차적인 기능은 저작 감각 및 혀의 지원뿐만 아니라 맛 감지 및 음성학을 지원합니다. 따라서 혀의 강도와 부피는 척추 동물이 먹이, 의사 소통 및 호흡과 같은 기본적인 활동을 수행하는 능력에 영향을 줄 수 있습니다. 수면 무호흡증을 앓고있는 환자는 근육 긴장이 감소되고 근육 내 지방이 증가하여 자기 공명 영상 (MRI)으로 시각화되고 정량화 될 수있는 방언이 확대됩니다. 혀의 힘 생성 및 점탄성 특성을 측정하는 능력은 이미징 데이터와 관련이있는 기능적 정보를 얻기위한 중요한 도구를 구성합니다. 여기, 우리는 hypoglossal 신경의 전기 자극을 통해 마취 주커 쥐에서 혀의 힘 생산을 측정하고 점탄성 속성을 결정하기위한 기술을 제시합니다f 수동 Lissajous 힘 / 변형 곡선을 적용하여 혀.

서문

혀는 저작, 씹기, 맛 감지 및 말하기에 필수적인 지원을 제공합니다. 명료 한 신경 분포 및 해부학 / 기능을 가진 외인성 및 내인성 근육 조직의 존재는이 근육질 수 구좌의 독창성을 설명합니다. 이미징 기술의 최근 발전으로 복잡한 해부학 ^1에 대해보다 자세히 살펴볼 수있었습니다 ¹ . 혀 기능 저하, 혀 위축, 연하 장애 및 언어 장애는 또한 파킨슨 병 ² , 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) ³ , 근전 이영양증 (MD) ⁴ 및 기타 근병증과 같은 근육 병적 상태의 흔한 징후입니다.

일반적인 질병 상태와 관련된 근육 구성의 변화는 혀의 기계적 및 점탄성 특성에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 혀의 기능 분석은 노화와 관련된 수축 특성의 변화를 밝혀 냈습니다ss = "xref"> 5 ^{, 6} , 저산소증 ^{7 , 8} 및 비만 ^{9 , 10} . 근이영양증의 경우 섬유화가 증가하면 근육 경직도가 높아져서 Lissajous 변형 프로토콜을 적용 할 때 변형에 대한 순응도가 낮아집니다. 반대로, 비만 환자에서 기록 된 것과 같은 근육 지방 함량의 변화는 골격근 ^{13 , 14} 의 신진 대사와 기계적 특성을 변화 시키며 변형에 대한 근육 순응도를 증가시킬 것으로 예측됩니다. 혀의 지방 증가는 부분적 상부기도 폐쇄 (무호흡) 시점까지 혀의 체적을 증가시킴으로써 인간 ¹⁷ 의 폐쇄성 수면 무호흡증 (OSA)의 발달과 관련이 있습니다 ^{15 , 16} . 심인간과 마찬가지로 혀 지방의 침윤은 뚱뚱한 Zucker rats ¹⁰ 에 기록되어있어이 모델은 혀의 생리학에 지방 침투의 효과를 연구하는 데 유용한 도구임을 시사합니다.

혀의 힘을 측정하는 것은 hypoglossal 신경을 고립시키고 양측으로 자극하기 위해 섬세한 수술 기술을 요구합니다 ^{17 , 18} . 이러한 기술은 이전에 래트 ^{5 , 17 , 19 , 20} , 토끼 ²¹ 및 인간 ^{22 , 23} 에서 기술되었지만 조사자에게는 시각 보조 도구가 제한적이었다. 기술 수준이 높기 때문에 자세한 프로토콜의 가용성으로이 기술의 접근성과 재현성이 크게 향상됩니다. 실험 패러다임의 목표는 아픈 것입니다.쥐 모델에서 혀의 강도와 점탄성을 측정하기위한 정확하고 신뢰할 수있는 기법을 권장합니다. 이것을 달성하기 위해, 쥐를 마취하고, hypoglossal 신경이 노출되고 동물의 혀에 자유롭게 접근 할 수 있도록 기관에 캐 뉼러를 설치합니다. 봉합 고리는 혀의 끝 부분을 힘과 길이를 조절할 수있는 힘 변환기에 연결하는 반면, 두 개의 양극 훅 전극은 혀의 수축을 유도하는 하울그 신경 신경을 자극합니다. 힘 측정이 완료된 후 힘 변환기의 길이 제어 기능을 사용하여 고정 된 진폭 (Lissajous curves), 지속 시간 및 주파수를 갖는 사인파 프로토콜에 따라 혀의 길이를 빠르게 변경합니다. 그것의 점탄성 특성 ^{11 , 24} . 프로토콜은 해부 단계, 실험 platfo에서 동물의 위치를 ​​통해 조사자를 안내합니다rm, 전극 배치, 마지막으로 힘 및 점탄성 데이터의 수집 및 분석에 이르기까지 다양합니다.

프로토콜

동물 대상을 포함하는 모든 절차는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (의정서 번호 805822)에 의해 승인되었습니다. 설명 된 절차는 터미널이며 무균 상태 또는 의약품 제품의 사용을 필요로하지 않습니다.

1. 수술 절차

그림 1 : 수술 절차.
(A) 외과 계획 경계. 빨간색 파선은 절개 부위를 나타냅니다. 두 개의 검정색 선은 턱의 위치를 ​​나타내며, 아래쪽 검은 선은 흉부의 위치를 ​​표시합니다. 파란색 선은 치골골을 나타냅니다. (B) 지방 조직, 혀밑 및 복강 내 조직의 둔각 절제술 후 위 근육 (화살표)의 후부 배꼽의 노출 ary 땀샘. (C) 위턱 내 신경을 드러내는 위 근육 (파선 녹색 선)의 후 복부를 절제합니다 (흰색 화살표). (D) 주위의 근막에서 하강근 (백색 화살표)이 제거됩니다. (E) 주위의 평활근을 부드럽게 당겨서 기관을 노출시키고 (녹색 화살표는 적용되는 힘의 방향을 나타냄), 삽관 준비를 위해 들어 올립니다 (F) . 별표는 혀가 턱뼈에 삽입되었음을 나타냅니다. 녹색 점선은 삽관을위한 절개 지점을 표시합니다. 흰색 화살표는 삽입 된 캐 뉼러를 제자리에 고정 할 준비가 된 느슨한 매듭을 나타냅니다. (G) 캐뉼라 삽입을위한 기관 절개. (H) 기관 캐뉼라는 정사각형 매듭으로 제 위치에 삽입되고 고정된다. (I) 봉합사를 혀에 적용.target = "_ blank">이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 수술 마취 및 준비
   1. 4 % isoflurane 마취와 유도 챔버에 쥐를 놓습니다.
   2. 동물을 열원 위에 놓고 noseecone에서 1 - 3 % isoflurane으로 마취를 유지하여 분당 최소 70 회 호흡 속도를 보장합니다.
   3. 에어 클리퍼 (air-clipper)와 제모 크림으로 목 부분을 면도하십시오. 제모 크림을 사용할 때는 모피가 제거 될 때까지 면봉으로 도포 한 크림을 사용하십시오. 장모 제거 크림에 장시간 노출되면 피부에 자극을 줄 수 있습니다.
   4. 수술 필드를 70 % 알코올로 세척하십시오 ( 그림 1A ).
   5. 초기 절개를 진행하기 전에 동물의 호흡 패턴과 반사 (발가락 핀치 반사가 없음)를 확인하십시오. 마취 깊이를 지속적으로 모니터링하고 평가하는 것은 필수적입니다 (다시코드 호흡 수 및 10 분마다 반사 신경의 결핍); 동물은 전체 절차 중에 마취의 깊고 외과적인 평면 아래에 있어야합니다.
2. Hypoglossal 신경 식별
   1. 그림 1A 의 빨간색 점선으로 표시된 것처럼 피부를 절제하고 제거하여 수술 가위 쌍으로 수술 필드를 엽니 다.
   2. 뚱뚱한 조직, 설하 및 하악 샘 및 기관을 둘러싸고있는 근육층을 통해 무딘 해부.
      참고 : 해부 중 보수적으로하십시오. 가능한 경우 무딘 절개를 사용하고 목의 혈관에 손상을주지 않도록주의하십시오.
   3. ( 그림 1B - 흰색 화살표) 기관에 측면 digastric 근육 (PD)의 후부 배를 식별합니다. hypoglossal 신경이 근육 ( 그림 1C - 흰색 화살표) 아래 실행됩니다. 전기 소작과 함께 PD 프록시를( 그림 1C - 점선).
      참고 : 주위의 신경이나 조직이 마르지 않도록하십시오. 그것을 보호하기 위해 신경에 미네랄 오일 한 방울을 추가하십시오. 전극에서 자극의 장 전파로 인한 근육 수축을 피하기 위해 신경 주변의 가능한 접촉 부위에서 근육 조직을주의 깊게 소작합니다.
   4. 미세 포셉 한 켤레를 사용하여 주변 근막에서 hypoglossal 신경을 해부. 후크의 도움으로 적어도 3mm의 신경이 바이폴라 전극 ( 그림 1D ) 연결에 사용 가능한지 확인하십시오.
   5. 미세 지혈 집게를 사용하여 자극의 역행 전파를 피하기 위해 가능한 한 hypothlossal 신경을 hyoid 뼈 ( 그림 1D - 흰색 화살표)에서 부순다. 마이크로 지혈 집게로 5 초간 압력을 가하여 신경을 분쇄하십시오. 지혈기가 신경을 쥐고있을 때, 간단한 t혀 밑에있는 마녀가 보일 것입니다.
   6. 다른 쪽의 절차를 반복하십시오.
3. 기관 삽관
   1. 무딘 절개로 주변의 평활근을 부드럽게 분리하여기도를 드러냅니다 ( 그림 1E - 녹색 화살표로 표시).
      참고 : 보수적이어야하며 우선적으로 무딘 절개를 사용하십시오. 캐뉼라의 직경과 기관의 직경을 비교하십시오. 캐 뉼러는 기관에 정확하게 들어 있어야하고 1.3.2 ~ 1.3.5 단계에서 설명한대로 봉합 후 안정적으로 삽입되어야합니다.
   2. 부드럽게 한 쌍의 봉합 - 연결 집게를 사용하여 기관을 들어 올려서 흉부에 가까운 4-0 봉합사를 통과시킵니다. 첫 번째 느슨한 매듭을 후두에서 6 번째와 7 번째 링 사이에 묶습니다 ( 그림 1F - 흰색 화살표). 이 매듭은 정맥을 삽입하기 위해 삽입되면 닫힙니다.
   3. 줄기를 밀어서기관을 옮기고 캐뉼라 (IV 14 gx 3.25 "캐 뉼러)의 삽입을 용이하게하기 위해 피펫을 옮기십시오 (삽입을 촉진하기 위해 광유로 피펫을 윤활하십시오).
   4. 후두에서 4 번째와 5 번째 링 사이에 작은 절개를 자릅니다 ( 그림 1G - 흰색 화살표). 첫 절개 후 개구가 퍼지는 경향이 있으므로 기관 절제를 완전히 피하기 위해 초기 절단을 할 때 보수적입니다.
      참고 : 기관 절개를 수행하기 전에 캐 뉼러가 준비되고 마취 전달이 켜져 있는지 확인하십시오.
   5. 캐뉼라를 통해 마취 관리를 시작하고 약 5 링의 길이를 기관 내부를 부드럽게 전진하면서 절개로 부드럽게 삽입합니다. 밀폐 봉인을 만들기 위해 봉합사로 정맥을 고정하십시오 ( 그림 1H ).
      참고 : 찰과상을 예방하기 위해 흠이있는 기관에 액체가 들어 가지 않도록하십시오.. 기관이 절개되면 동물은 실내 공기를 마실 것입니다. 그러므로 마취의 전달이 유지되도록 캐뉼라를 신속하게 삽입하는 것이 중요합니다. 동물을 움직일 때, 기관에서 캐 뉼러의 정확한 위치를 관찰하십시오.
   6. 부드럽게 nosecone에서 동물을 제거합니다.
      참고 : isoflurane 대신 주사 마취제를 사용하면 기관 삽관의 필요성을 제거하고 과도한 튜빙에서 실험 작업 공간을 정리함으로써 절차를 단순화 할 수 있습니다.
4. 혀 봉합술
   1. 20cm 길이의 5/0 봉합사를 담그십시오 (우리는 실크, 검은 편조를 PBS에서 제안합니다).
   2. 쥐의 입을 열어 놓은 채로 부드럽게 봉합 동맥을 이용하여 혀의 끝 부분을 잡으십시오.
   3. 잠재적 인 조직을 피하기 위해 식염수로 혀를 촉촉하게 유지하기 위해주의를 기울여 혀의 끝 부분을 통해 봉합사를 통과시킵니다 ( 그림 1I - 흰색 화살표).손해.
   4. 약 4cm 너비의 루프를 묶으십시오 (지름은 동물과 힘 센서 사이의 거리에 따라 달라질 수 있음).
      참고 : 삽입을 용이하게하고 조직의 불필요한 병변을 피하기 위해 봉합사와 혀가 젖었는지 확인하십시오.

2. 실험 설정

그림 2 : 동물 배치 및 고정.
(A) 실험 플랫폼 위에 마우스를 놓습니다. 턱이 고정되고 입이 수직 장력 (녹색 화살표)이 가해져 열려 있습니다. 봉합 루프는 힘 변환기 (흰색 화살표)에 연결됩니다. (B) 전극이 연결되어있다. (C) micromanipulator에 장착 된 각 전극은 안정적으로 신경에 연결되어 있습니다. 속지는 t의 종료를 보여줍니다.그는 후크 전극. (D) 혀의 최적 길이는 치골골 높이에서 혀 끝까지의 버니어 캘리퍼스로 측정됩니다. 이 그림에서 전극은 명료성을 위해 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고 : 실험 중에 운동을 피하기 위해 다음과 같은 안전 조치를 사용하여 장치의 가열 트레이에 동물을 눕히십시오.

1. 가열 된 플랫폼 ( 그림 2A , 2B )에 직접 연결된 플라스틱 코팅 금속 꼬임 끈으로 쥐의 코를 트레이에 고정시킵니다.
2. 수직 장력을 적용하여 열린 쥐의 입을 유지하십시오 (9kg 테스트 모노 필라멘트 라인에 연결된 3 웨이 회전을 사용하고 카메라 스틱으로 제자리에 고정하십시오) ( 그림 2A - 녹색 화살표).
   참고 : 쥐를 안정시키기위한 또 다른 접근법은 설치류 구강 개그 (rodent mouth gag) 또는 그것을 개조하는 것입니다. 측정의 품질에 영향을 줄 수있는 목의 움직임을 피하기 위해 입을 열고 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다.
3. 봉합 루프를 힘 변환기에 연결하십시오 ( 그림 2A - 흰색 화살표).
4. 외과 용 테이프를 사용하여 자극 중에 운동을 제한하기 위해 쥐의 팔다리와 복부를 움직이지 않게하십시오.
5. 두 개의 자극 후크 바이폴라 전극을 분쇄 사이트 ( 그림 2C ) 근위 해부 hypoglossal 신경에 적용합니다.
   1. 플라스틱 지지대 (여기서는 2 개의 1 mL 혈청 pipettes를 함께 사용)를 사용하여 2 mm 간격으로 서로 붙어있는 수술 용 강철 29 게이지 바늘 전극 쌍으로 만든 자극성 양극 전극을 사용하십시오.
   2. 바늘 전극의 끝 부분을 후크 모양으로 구부리십시오.신경과의 안정된 접촉을 형성하기에 충분할 정도로 작습니다 (~ 1mm 직경) ( 그림 2C - 상감).
   3. 각 전극의 두 전선을 바나나 잭 x BNC 잭이있는 스택 가능한 이중 바인딩 포스트에 연결 한 다음 BNC 스플리터를 사용하여 현장 근육 테스트 시스템 (표 3)의 자극 모듈에 연결합니다.
      참고 : 동물이 안정적인지와 목과 혀가 힘 센서 레버에 정렬되어 있는지 확인하십시오. 호흡 수를 계속 모니터링하고 구속이 호흡을 방해하지 않는지 확인하십시오.

3. 최적 길이 (L ₀ ) 및 최대 등시성 힘 결정

1. 혀의 길이를 점차적으로 조절하고 최대한의 힘이 얻어 질 때까지 등각 기울기 자극을 적용하십시오.
   1. L0을 등각 트 위치 힘 ( 표 1 )이 최대가되는 길이로 정의하고, 다음 정규화를 기록한다.힘 측정은 모든 동물에 따라 바뀝니다. Vernier 캘리퍼스를 사용하여 설골 (턱뼈) 수준 ( 그림 2D )에서 혀끝까지의 혀 길이를 측정합니다.
      참고 : 전극의 올바른 위치는 신경과 최적의 접촉을 보장하기 위해 필수적입니다. 최적의 포지셔닝은 두 개의 신경 중 하나 또는 양쪽 모두를 자극 할 때 유사하고 부가적인 힘을 발휘해야합니다.
2. 실험을 시작하기 전에 두 전극을 자극기에 연결하고 테스트 파상풍 자극을 투여하십시오 ( 표 1 ). 이 수축 중에 동물이 위치가 안정적인지 모니터링하고 목 근육의 원치 않는 보이는 수축을 확인하십시오.
3. tetanic 자극에 의해 20 초 후 트 위치를 적용하여 등척 힘을 측정하십시오. 자극 사이클을 반복하면서 3 회 반복하여 자극 순환 사이에 4 분간의 회복을 허용하십시오 (주기에는 하나의 트 위치가 포함됨).e 파상풍 자극), 최대 트 위치 및 파상풍의 힘을 기록하십시오.
4. 수축 사이에 몇 방울의 PBS를 뿌려 혀를 항상 젖게 유지하십시오.
   참고 : 목 근육이 수축하면 조심스럽게 전극의 위치를 ​​변경하여 주변 근육 조직을 만지지 않도록하고 필요하면 전극과 접촉하는 조직을 소작하십시오.

4. 점탄성 물성치 결정 (Lissajous Curves)

1. 아이소 메트릭 힘 결정 후 3-5 분 동안 혀를 놓으십시오. L0에서 시작하는 리 사쥬 곡선을 수행하십시오. 따라서 동물과 포스 트랜스 듀서의 위치는 절대로 변경해서는 안됩니다.
2. hypoglossal 신경을 자극하지 않고 L _0의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 %의 증가 된 변위 (d)를 갖는 수동적 인 뻗기 ( 표 2 ) highe와 모드 컨트롤러r 소풍 값은 305C-LR보다 큼). 예를 들어, 40 % L0의 진폭은 혀의 변형을 + 20 % L0에서 -20 % L0으로 만듭니다.
   1. 매 사이클마다 10 초씩 반복되는 고정 된 2Hz 사인 주파수를 사용하십시오. 매주기마다 총 지속 시간은 5 초입니다. 사인 주파수의 변화는 과거에는 다이어프램 (diaphragm) ( ²⁴⁾ 과 같은 조직에서 사용되어 왔고 실험 프로토콜을 수정하기 위해 채택 될 수있었습니다.
   2. 각 사이클 사이에 30 초를두고 혀가 전체 절차 중에 젖었는지 확인하십시오.
      참고 : 몇 방울의 PBS를 첨가하는 과정에서 혀를 적셔 두십시오. 턱을 고정하는 구속이 펴는 동안, 특히 변위가 40 % 이상에 도달 할 때 안정적으로 제 자리에 유지되는지 확인하십시오.
3. 실험이 완료된 직후, 동물이 여전히 마취의 깊은 외과 수술 평면 아래에있는 동안, 승인 된 IACUC 동물 보호 단체에 따라 동물을 안락사시켰다ocol. 추가 가공을 위해 혀를 해부하십시오 ( 예 : 냉동 단면 또는 생화학 분석을위한 저장).

결과

그림 3 : 대표 결과.
(A) 성공적인 트 위치 및 파상 포스 트레이스의 예. 해당 자극은 빨간색 추적으로 표시됩니다. (B) 하악 수축 (파란 흔적)과 목 근육의 간접 자극으로 인한 혀의 파상풍 수축 실패의 예. 자극 전극을 재배치하거나 전극 종단과 주변 근육 조직 사?...

토론

혀 신진 대사 및 / 또는 구성의 변화, 예를 들어 비만의 결과로서 혀 지방 침윤은 우리의 프로토콜에 의해 평가 된 매개 변수의 정량화 가능한 변화를 야기 할 것으로 예측된다. 혀의 힘의 정량화는 대단히 흥미로운데, 돌출 된 활동과 후퇴하는 활동 사이의 불균형 또는 전반적인 혀의 약화로 인해 상부기도의 폐색이 발생할 수 있기 때문입니다. 혀의 힘을 증가시키는 것을 목표로하는 운동 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SurgiSuite (heated Surgical tray)	Kent Scientific	SurgiSuite-LG	Includes heated platform
LED Lighting and Magnification Kit	Kent Scientific	SURGI- 5003
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip	922100
Isoflurane	Butler Schein Animal Health Supply	29405
Alcohol Prep	Webcol	6818
Cotton-tipped applicators	MediChoice	WOD1002
Hair clipper	Conair
Hair remover lotion	Nair
Medical tape	Transpore	3M
D-PBS	Corning	21-030-CM
Operating Scissors	World Precision Instruments	503717-12
Hemostatic Forceps	Merit	97-458	Any tissue forceps can be used instead
Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS	World Precision Instruments	504479
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Blunt Micro Hook	Fine Science Tools	10062-12
Microhemostat	Fine Science Tools	12075-14
Thermal cautery	WPI	501292	Disposable cauteries are available at lower cost
IV 14g x 3.25" cannula	BD	B-D382268H	For tracheal cannulation
Braided silk non-absorbable suture size 4-0	Harvard Apparatus	SP104	For stabilization of the tracheal cannula
Braided non-absorbable silk 5/0 suture	Surgik LC, USA	ESILRC15387550	For suturing the tongue
Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire)			For securing the rat's nose to the platform
Camera stick
3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line	Berkley		For securing the jaw and maintaining the mouth open
Camera stick with adjustable angle			For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open.
in situ Muscle Test System	Aurora Scientific	809C	This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used.
Dual-Mode Muscle lever (force transducer)	Aurora Scientific	305C-LR	309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/
Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge)	AD Instruments	MLA1204	300C is recommended for use in mice.
Magnetic Stands	World Precision Instruments	M10	Used for making the bipolar stimulating hook electrodes
Kite Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R and KITE-L	Require a steel plate
Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack	McMaster Carr	6704K13
Carbon fiber composites digital caliper	VWR	36934-152