Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

요약

이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

초록

우리는 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법을 조합 하 고 스캐닝 전자 현미경 애벌레 zebrafish 망막에 단백질 subcellular 지 방화를 조사 하는 방법을 제시. 슈퍼 해상도 가벼운 현미경의 하위 회절 한계 해상도 기능 상관된 데이터의 정확도 향상 수 있습니다. 간단히, 110 나노미터 두꺼운 곳을 알아내는-섹션 실리콘 웨이퍼에 전송 되 고, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경에 의해 몇 군데는 면역 형광 염색 법, 후. 그 후, 섹션 스와 백 금 영상 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 이전 그림자에 보존 됩니다. 이러한 두 현미경 형식에서 이미지 쉽게 오픈 소스 소프트웨어 조직 랜드마크를 사용 하 여 병합 됩니다. 여기는 애벌레 zebrafish 망막에 대 한 적응된 방법에 설명합니다. 그러나,이 방법은 또한 조직 및 생물의 다른 종류에 적용 됩니다. 이 상관 관계에 의해 얻은 보완 정보는 세포 막과 관계 있는 미토 콘 드리 아 단백질의 표현과 cristae 미토 콘 드리 아 뿐만 아니라 셀의 다른 구획으로의 해결할 수 설명 합니다.

서문

단백질 및 세포의 다른 구획을 그들의 관계의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법 그들의 기능 및 가능한 상호 작용을 이해 하는 필수적인 도구는. 슈퍼 해상도 현미경 전자 현미경과 함께에서¹등 정보 제공합니다. 바닥 상태 고갈 현미경 개별 분자 반환 (GSDIM)에 의해 다음 다양 한 유기와 유전으로 인코딩된 fluorophores² 와 호환 하는 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 이며 20 최대 가로 해상도 달성 한다 nm ³. 표준 회절 제한 현미경 보다 높은 해상도로 방법의 상관 관계^4,,56의 정확도 향상 시킵니다. 단백질 표정 특정 subcellular 구획의 가장 좋은 상관 관계를 달성 하기 위하여 불확실성⁷ 빛과 전자 현미경 검사 법에 대 한 동일한 ultrathin 섹션의 사용의 볼륨을 줄일 것이 좋습니다. 다른 단면 방법 중에서 Tokuyasu 곳을 알아내는-섹션 프로토콜 탈수 또는 수 지 포함 필요 하지 않습니다 또한, 많은 epitopes의 antigenicity 보존 그리고, 좋은 조직 열 대권 외의⁸을 제공 합니다. 여러 가지 방법을 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)^4,5,,910에서이 섹션의 적용을 설명 했다.

Zebrafish 망막 시각적 개발 및 척추에 걸쳐 매우 보존된 구조와 기능을 부여 하는 인간 질병 메커니즘 연구에 귀중 한 모델입니다. 특히, 망막 대뇌 디스플레이 포유류 대뇌, 기저 냅, apico-basally 길쭉한 핵과와 동일한 아키텍처 멤브레인의 구성 더 꼭대기 내부 세그먼트 외부 세그먼트에서 미토 콘 드리 아의 클러스터링 가장 꼭대기 위치¹¹디스크. 다양 한 세포질 구획에 단백질 지역화는 제 브라 사이 보존 하 고 인간, 인간 질병 관련 단백질^12,13의 생물학 기능의 조사를 허용 합니다.

여기 선물이 애벌레 zebrafish 상호 슈퍼 해상도 빛과 전자 현미경에 의해 미토 콘 드리 아 외부 막 단백질 Tom20의 지역화를 해결 하기 위해 망막 샘플을 준비 하는 프로토콜. 방법은 실리콘 웨이퍼에 수집 하는 곳을 알아내는-섹션에 기반 하 고 금의 얇은 층의 적용 후 생산 대비 지형 정보 취득. 이 단계는 사용, 재현성, 및 실험을 완료 하는 시간의 용이성 측면에서 분명 기술 개선. 우리는 최근에 마우스 조직¹⁴핵 숨 구멍 및 미토 콘 드리 아 단백질을 검출 하기 위하여 방법의 적용을 보여 주었다.

프로토콜

모든 실험 ARVO 문을 따라 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 수행 했다 및 지방 기관에 의해 승인 했다.

1. 준비 Ultrathin 섹션의 실리콘 웨이퍼

1. 샘플 고정
   1. 0.1%도, 0.1 m M cacodylate 버퍼에 4% 포름알데히드를 포함 된 통 솔루션 준비.
      참고: 주의! 도, 포 름 알 데히드 및 cacodylate 버퍼에 작업할 때 주의 사용 하 여 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 증기 두건에서 일.
   2. 안락사 5 일 게시 수정 (5 dpf) zebrafish 애벌레 tricaine (에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate, PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7)에서 0.4 %w / v)와 앞에서 설명한 ¹⁵.
   3. 얼음에 미리 냉장된 통 솔루션에 집중 하 여 애벌레를 수정. 머리를 제거 하 고 부드러운 락 4 ° C에서 밤새 품 어.
   4. 트리밍 1 %agarose 베드 플레이트에 냉장된 통 솔루션의 미세 집게와 (쌍안경) 아래 서 메스를 사용 하 여 눈 주위 조직에 의해 눈을 해 부. 신선한 냉장된 사전 정착 액 튜브 눈 전송.
   5. 각 세척 실 온 (RT)에서 5 분 동안 PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7.4)에 두 번 세척.
2. 젤라틴 침투와 장착
   1. 워밍업-15 mL 지역 식품 브랜드 젤라틴 12 %w / v 샌드위치 (인산 염 버퍼, 0.1 m M pH 7.4)에 40 ° C. PBS를 제거 하 고 눈을 들어 있는 튜브에 젤라틴 해결책을 추가 하십시오. 부드럽게 젤라틴 침투 샘플 및 부드러운 떨고와 thermoblock 또는 물 욕조에 40 ° C에서 10-30 분 동안 품 어 튜브 누릅니다.
   2. 채우기 12 m m x 5 m m x 3 m m 실리콘 또는 폴 리 에틸렌 40 ° C 물 욕조에 따뜻한 젤라틴으로 금형을 포함 하는 평면. 추가 곰 팡이를 피 펫을 사용 하 여 당 두 눈, 제대로 해 부 바늘을 사용 하 여 눈 아래 그들을 정렬 시키고 젤라틴 1 분 동안 실내 온도에 아래로 냉각 하 고 20 분에 4 ° C에서 강화
   3. 다시 잘라 면도날을 사용 하 여 블록 당 한쪽 눈에 맞게 눈 아래 젤라틴 블록.
   4. 얼음에 샌드위치에 2.3 M 자당 포함 된 젤라틴 눈 전송. 4 ° C에서 밤새 품 어.
   5. Exchange 새로운 2.3 M 자당 솔루션 및 4 ° C 또는-20 ° C에 게가이 단계 후 샘플 단면에 대 한 준비가 또는 개월에 몇 주 동안-20 ° C에 저장 될 수 있습니다.
   6. 다시 cryo-핀에 전송 하기 전에 눈의 거의 크기에 젤라틴 블록을 잘라. 액체 질소 및 곳을 알아내는-ultramicrotome 이전에 동결.
3. Cryosectioning
   1. cryo ultramicrotome에 다이아몬드 칼으로-120 ° C에서 잘라 110 nm 두께-섹션.
   2. 유선 루프 (물)에 2% 스와 2.3 M 자당 솔루션 (1:1)의 작은 물방울을 포함 하는 섹션을 선택 합니다. 7 x 7 mm 실리콘 웨이퍼에 섹션을 전송. 추가 처리까지 4 ° C에서 섹션 저장.

2. Immunolabelling

1. 방울에 웨이퍼를 거꾸로 배치 하 여 4 개의 상품에 20 분에 대 한 0 ° C에서 PBS로 세척 웨이퍼. PBS는 실내 온도에 2 x 2 분에 세척.
2. 품 어 3 번, PBS에 0.15% 글리신에 1 분. 1 분 동안 3 배 세척/PBS로 세척. 5 분에 PBG (0.5% 소 혈 청 알 부 민 BSA와 0.2% 젤라틴 타입 B PBS)와 미리 incubate
3. 토끼 안티-Tom20와 품 (재료의 표 참조) PBG에 (4 µ g/mL) 실 온에서 30 분.
4. 는 PBG에 1 분/세척을 위한 6 x를 씻어. 반대로 토끼 알 렉 사 647 F(ab') ₂ 실시간 품에서 5 분 동안 PBG로 사전 incubate (재료의 표 참조) PBG에 (7.5 µ g/mL) 30 분에 대 한
5. 는 PBG에 1 분/세척을 위한 6 x를 씻어. PBS에서 3 x 2 분을 씻어. DAPI 함께 품 어 (4 µ g/mL) 10에 대 한 PBS에 PBS에 2 x 2 분 세척 s..

3. 슈퍼 해상도 현미경

1. 품 웨이퍼 짧게 (10 s) 글리세롤 (80%)의 1:1 솔루션의 물방울에 그것을 배치 하 고 이미징 버퍼 청소 시스템 (200 m m 인산 염 버퍼 10% 포도 당, 0.5 mg/mL를 포함 하는 산소를 포함 하 여 glucoseoxidase, 40 µ g/mL catalase 15 m m 베타 mercaptoethylamine 염 산 염 (MEA HCL), pH 8.0).
2. 글리세롤 (80%)의 1:1 혼합물의 신선한 방울에 유리 하단 (두께 170 ± 5 μ m) 페 트리 접시 (섹션 아래로 향하게) 웨이퍼 전송 및 이미징 (3.1 단계)에서 버퍼.
3. 피 펫와 모든 면에서 웨이퍼 아래 액체의 대부분을 제거합니다. 페 트리 접시의 바닥에 웨이퍼를 해결 하기 위해 사용 하는 실리콘 줄무늬.
   참고: 실리콘 줄무늬 2 구성 요소 실리콘 접착제 (3 m m x 12 m m) 밖으로 만들어집니다.
높은 수 가늠 구멍을 사용 하는 거꾸로 한 현미경에
4. 이미지 섹션 (예: 160 X / 나 1.43; 참조 테이블의 재료) 기름 침수 슈퍼 해상도 전용된 목표. 이미징, 이전 하자 최소화/측면 및 축 드리프트를 줄이기 위해 현미경 온도 equilibrate 샘플.
5. 관심 영역을 가운데로 하 고 첫 번째 widefield epifluorescence 참조 이미지. 슈퍼 해상도 동작 모드를 변경 합니다. 15 ms에 카메라의 노출 시간을 조정 하 고 설정 (EM) 이득 300 최대 멀티 전자.
6. 조명 샘플은 642 nm 연속파 레이저 epifluorescence 모드에서 최대 레이저 전력 (~2.8 kW/c m ²에 해당)에서. 최대한 빨리 단일 분자 깜박이 잘 분리 각 프레임에 그래서 확률은 낮은 개별 신호 오버랩, 레이저 파워 ~0.7 kW/c m ²로 설정. 30000 프레임의 최소 인수 epifluorescence 모드에서 raw 이미지를 기록.
   참고: 이러한 모든 매개이 변수 및 밀도 라벨 다른 표본에 따라 달라질 수 있습니다.
7. 원시 데이터 로부터 재구성 이벤트 목록 (raw 이미지에 각 단일 분자 깜박임의 지역화) 생성을 클릭 하 여 30 광자 (샘플에 따라 조정 될 필요가)의 검출 임계값을 사용 하 여 " 평가 "에 ' t-시리즈 분석 '에서 ' 도구 '.
8. 가우스 피팅 ¹⁶ 4의 렌더링 픽셀 크기를 적용 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 시각화를 클릭 하 여 nm " 이미지 만들기 "에 ' 이벤트 목록 처리 패널 '에서 ' 도구. '
   참고: 슈퍼 해결된 이미지 생성에 대 한이 연구에 사용 된 시스템의 통합된 소프트웨어 도구 채택 되었다. 그러나, 어떤 다른 단일 분자 기반 시스템에 설명된 슈퍼 해상도 이미지를 수행할 수 및 데이터는 오픈 소스 소프트웨어 도구와 뇌우 ¹⁷로 처리 될 수.

4. 플래티넘 Shadowing

1. 실리콘 줄무늬를 제거 하 고 배양 접시에서 그것을 해제 하는 웨이퍼의 가장자리 가까운 PBS의 한 방울을 추가. 웨이퍼에 PBS, 2 x 2 분 5 분 2 분 2 배 세척 / PBS에 씻어 게시물 PBS에 0.1%도 함께 그것을 해결 하는 다음 씻어.
2. 품 5에 대해 두 번 웨이퍼 분/얼음 물에 스 2%의 1 방울에 부 화 원심 분리기 튜브에 웨이퍼를 삽입 하 고 원심 14100 x g에서 90 미 탑재 그것에 실시 하는 탄소 시멘트와 sem의 알루미늄 스텁.
3. 2 ~ 10의 레이어를 추가 전자를 사용 하 여 8 ° 회전 섀도잉 의해 샘플에 백 금/탄소 nm 빔 증발 장치 설정: 1.55 k v, 55 0.3 nm/s, 및 8 °, 회전 레벨 4의 각도에서 mA.

5. 스캐닝 전자 현미경

1. 스캔 이미지 섹션 전자 microscope 1.5 k v, 2 mm 작업 거리와 렌즈 2 차 전자 검출기는 in.

6. 빛과 전자 현미경 이미지의 맞춤

1. 오픈 두 종류의 이미지를 클릭 하 여 피지 ¹⁸ " 파일 | 오픈 ". 클릭 하 여 캔버스 크기 조정 " 이미지 | 조정 | 캔버스 크기 "를 클릭 하 여 두 이미지 스택을를와 " 이미지 | 스택 | 이미지 스택 ". Tiff 파일 형식으로 스택에 저장.
2. 피지에서 클릭 하 여 새로운 TrackEM2 ¹⁹ 인터페이스를 열고 " 파일 | 새로 만들기 | TrackEM2 (새로운) ". 검은 창에 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 선택 하 여 두 이미지 스택 가져오기 " 가져오기 스택 ".
3. 맞춤 빛 현미경 이미지 랜드마크 이미지에 오른쪽 마우스 클릭을 사용 하 고 선택 하 여 수동으로 전자 현미경 이미지를 " 정렬 | 랜드마크와 수동으로 레이어를 정렬 ". 랜드마크를 추가할
   1. 선택 선택 도구 (검은색 화살표). 참고로 핵의 형태를 사용 하 여 두 이미지 (보충 그림 1)에서 동일한 가장자리를 선택. (최소 3 포인트 선택 해야) 하는 몇 가지 포인트를 추가 합니다. 오른쪽 마우스를 클릭 하 고 선택 하 여 정렬 된 유사 모델 적용 " 변환을 적용 | 관계 모델 ".
4. 레이어 투명도 변경 (보충 그림 1 참조)는 정렬의 품질을 평가 하기 위해.

결과

Tom20, translocase 미토 콘 드리 아 외 막 복잡 한²⁰, 소 단위 단백질의 표현, 애벌레 zebrafish 망막의 얇은 단면도에서 의해 결정 되었다 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 (그림 1) 하 고이 정보는 동일한 섹션의 플래티넘 숨기기 후 전자 현미경을 스캐닝 하 여 얻은 지형 신호를 구비. 이러한 상호 데이터 연관 특정 구획, 외부 미토 콘 드리 아 막에 있는 단백질의 지 방화를 확인 하 고, 또한 셀의 다른 세포와 단백질의 관계에 대 한 정보를 제공.

그림 1: 클레 멘 타인 zebrafish 망막에. A. 낮은 배율 widefield 이미지 부분의 5 dpf zebrafish 망막, 핵 DAPI (녹청)으로 물. B. 동일한 영역의 전자 현미경 스캐닝. C. B. 핵에 프레임의 높은 배율 widefield 이미지 DAPI (녹청)로 얼룩진 고 빨간색으로 나타납니다 Tom20 미토 콘 드 리아 얼룩. 높은 배율에서 같은 섹션의 D. Widefield 이미지. Tom20 식의 미토 콘 드리 아의 클러스터에서입니다. 중 식의 Tom20 (빨간 점) GSDIM 현미경 검사 법에 의해 감지. 핵은 DAPI (녹청)과 스테인드. F. 전자 상호 슈퍼 해상도 결합 하 고 스캐닝 전자 현미경 검사 법으로 동일한 섹션. Tom20 얼룩 (붉은 점) 미토 콘 드리 아의 바깥쪽 막에서 미토 콘 드리 아 클러스터 (M)에 나타납니다. SEM 이미지의 지형과 형광 DAPI 신호 핵 (N)에 해당합니다. G. f.에 프레임의 고배율 이미지 스캐닝 전자 현미경 이미지 GSDIM 이미지 (빨간 점)에 컨텍스트를 제공합니다. 미토 콘 드 리아 cristae 명확 하 게 볼 수 있으며 미토 콘 드리 아의 바깥쪽 막 지역화 Tom20 얼룩. 외부 세그먼트의 막을 대뇌 (OS) 명확 하 게 해결 됩니다. 이미지 픽셀 크기 5 nm 스케일 바: A, B, 및 c: 10 µ m; D: 2 µ m; E와 f: 1 µ m와 g: 0.2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 빛과 전자 현미경 이미지의 정렬. A. SEM 이미지와 번호가 랜드마크 다른 핵을 따라 (노란색)와 TrackEM2 인터페이스에서 화면. B. 형광 이미지와 다른 DAPI 따라 번호 랜드마크 (노란색)와 TrackEM2 인터페이스에서 스크린샷 스테인드 핵. 레이어 투명도 변경 하려면 메뉴의 왼쪽된 상단 부분에 슬라이더를 사용할 수 있습니다. 눈금 막대: 1 µ m입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 방법은 결합 슈퍼 해결된 단백질 지역화 컨텍스트 정보는 세포 기관이에 단백질의 정확한 위치를 결정 합니다. 여기 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 처럼 다른 세포에 그것의 관계의 외부 막 또는 애벌레 zebrafish 망막에 포토 리셉터의 외부 세그먼트에 Tom20의 표현을 시각화 하는 실험의 완료 보여 줍니다.

Tokuyasu 곳을 알아내는-단면 잘 보존 된 섹션을 얻으려면 몇 가지 훈련이 필요 합니다. 그러나,이 방법은 시연된 성공²¹많은 실험실에서 고용입니다. 실리콘 웨이퍼는 섹션의 이전은 매우 간단 하 고 아무 특별 한 고려가 필요 하다. 이미지 버퍼에 글리세롤 사용 섹션의 건조를 피하기 위해 매우 중요 한 단계입니다. 최고 해상도 영상에 대 한 최상의 결과 얻을 수 있습니다 때 웨이퍼 페 트리 접시의 유리 바닥 매우 가깝습니다. 실리콘 줄무늬가이 위치에 웨이퍼를 유지 하는 데 도움이. 특별 한 주의 섹션의 손상을 방지 하기 위해 줄무늬를 제거 하는 동안 촬영 했다.

곳을 알아내는-섹션, 약 100의 두께 nm, Z 차원에서 광학 해상도 보다 얇은 또한 용이 하 게 상호이 방법의 정확도 슈퍼 해상도 현미경 신호가 얇은 층에서 오고 있다 고는 스캐닝 전자 현미경 신호는 샘플의 지형을 표시 합니다. 이 메서드는 멀티 컬러 이미징 또한 결합 수 있습니다. 그러나, 특별 한 주의 기울여야 합니다 샘플 같은 조건 (예: 이미지 버퍼) 몇 군데 수 및 크로스 토크를 방지 한다.

방법의 한 가지 한계는 그것의 2 차원 접근, 이후 직렬 섹션 (약 3 ~ 7 웨이퍼 당)의 제한 된 수만 수집할 수 있습니다. 따라서, 프로젝트 분석을 다루는 이상 하지 않을 것 이다. 그러나, 그것은 샘플의 간단한 단면에 의해 단백질 표정 모든 종류의 조직에서 검출에 적용 될 수 있는 방법입니다. 우리 같은 uranyl 아세테이트 또는 리드 시트르산 고전 조 영제의 사용 하지 않고 메서드를 제공합니다. 플래티넘 섀도잉 의해 대비 매우 유익한 지형 대조를 제공 하지만 경우에 따라 막 해결 하기 어려운. 이, 예를 들어 작은 소포에 있는 단백질의 식을 결정 하려면 프로젝트에 대 한 문제를 포즈 수 있습니다.

Tokuyasu 곳을 알아내는-섹션에 따라 우리의 프로토콜 표준 장비를 사용 하 여 슈퍼 해상도 스캐닝 전자 현미경에서 상호 결과 얻을. 실리콘 웨이퍼에 대 한 섹션의 컬렉션 및 대비에 대 한 백 금을 사용 하 여 간단한 단계를 제공 하는 안정성과 재현성 샘플 준비에 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	#158127
Glutaraldehyde EM Grade	EMS, USA	#16220
Cacodylate	Merck	#8.20670
Tricaine	Sigma-Aldrich	#886-86-2
Agarose, peqGOLD Universal	VWR International GmbH	35-1020
Flat embedding molds	BEEM Flat
Local food brand gelatin	Dr.Oetker	Extra Gold
Sucrose	Merck	#1.07687
Methylcellulose	Sigma	#M-6385
Glycine	Sigma	#G-7126
Gelatin type B	Sigma	#G-6650
BSA	Applichem	#A6588.0050
Silicon wafer	Si-Mat Silicon Materials		Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm
Cryo-pin	Baltic Preparation	#16701950
Wired loop "Perfect loop"
Silicone stripes	Picodent	Twinsil 22
Glucose	Sigma-Aldrich	#G8270
glucoseoxidase	Sigma-Aldrich	#G7141
catalase	Sigma-Aldrich	#C40
beta-Mercaptoethylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	#M6500
anti-Tom20	Santa Cruz Biotechnology	#sc - 11415
AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG	Jackson Immuno-Research	#711-606-152
DAPI	ROCHE, Switzerland	#10236276001
Glycerol solution	Sigma-Aldrich	#49782
Glass bottom petri dish	Ibidi, Germany	u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158
SEM aluminium stub	Agar Scientific	#G301F
Conducting carbon cement Leit-C	Plano, Germany	AG3300
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Diamond Knife (Cryo Immuno)	Diatome	DCIMM3520
Cryo-ultramicrotome	Leica Microsystems	Leica EM FCS
Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D	Leica Microsystems
160x 1.43 TIRF objective	Leica Microsystems	11523048
SEM - Zeiss Supra 50 VP	Zeiss	Supra 50 VP
FIB-SEM - Zeiss Auriga 40	Zeiss	Auriga 40