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요약

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

초록

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. Cytometry에 의해 분석 하는 항 원 특정 T 세포의 MHC tetramer 얼룩의 개발은 우리의 능력을 공부 하 고 이해 하는 T 세포의 immunobiology 혁명 있다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 피의 기술 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지역화를 확인할 수 없습니다. T 추출 하 셀 필요 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직에 효과. 제자리에서 MHC tetramer 얼룩 (IST) T 세포는 특정 조직에 대 한 관심의 항 원에 대 한 시각화 하는 기술입니다. Immunohistochemistry (IHC)와 함께, 인도 표준시 풍부, 위치, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형을 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 얼룩 특정 조직 구획 내에 있는 특정 고기와 항 원 특정 CD8 T 세포를 열거 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 절차는 동일 우리 리 외., 권리에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 하는 "낭 CD8에 의해 부분적으로 억제에 유인원 면역 결핍 바이러스 생성 세포+ 세포 에 비보." 그들은 지역화, 표현 형, 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC tetramers 사용할 수 있습니다, 어떤 조직에서 계량 설명 하는 방법을 광범위 하 게 적용 됩니다.

서문

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. 펩 티 드/MHC의 개발 종류 I 항 원 특정의 얼룩 CD8 T 세포1 와 MHC 클래스 II tetramer 얼룩이 지기의 CD4 T 세포2 의 cytometry로 최근 개발에 우리의 능력을 연구 하 고 이해 혁명 tetramer는 T 세포의 immunobiology입니다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지 방화의 검출에 대 한 허용 하지 않습니다. T 세포를 추출 하는 피의 기술 필요한 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직3에 효과.

우리와 다른 펩 티 드 로드 MHC 클래스 I 및 클래스 II tetramer 또는 multimer 시 약 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포 얼룩 사용 방법이 개발 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13.이 IST 메서드 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형의 결정에 대 한 허용 및 다른 세포와 조직에 구조 세포를 감지 하는 수단을 제공. 우리의 그룹은 광범위 하 게 사용 하는 MHC-나 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 연구-유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)-얼룩 tetramer HIV와 SIV immunopathogenesis의 이해를 얻기 위해 림프, 생식 기, 그리고 직장 조직에서 특정 CD8 T 세포 그리고 성공적인 예방 접종 전략14,15,,1617의 상관 관계를 식별 합니다. 또한, 우리 또한 개발 현장에서 교 잡 (ISH) 지역화 및 바이러스 관련 CD8 T 세포와 바이러스에 감염 된 세포를 계량 IST를 결합 하는 기술 조직에서 그리고 vivo에서 이펙터 대상 수준을 결정 하 18 , 19.

여기, 우리는 MHC 펩 티 드 로드를 사용 하 여 프로토콜을 설명-난 tetramers 얼룩 신선한 조직 섹션에 항 원 특정 CD8 T 세포에 counterstain 조직 IHC를 사용 하 여 특정 조직 구획에서 특정 고기에 포함 된 셀을 계량 하 고. 이 절차는 리 외., 어떤 우리가 결정 위치, 풍부, 및 림프 조직에 SIV 전용 T 세포의 표현 형 원숭이20에서 만성 SIV 감염 시에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 된 것과 동일 합니다.

이 절차에 대 한 신선한 조직 구분 되며 MHC 펩 티 드 로드와 하룻밤 incubated-난 tetramers fluorescein 안산 분자 (FITC)에 활용. 그들은 다음 paraformaldehyde에 고정 됩니다. 조직, 고정 후 MHC tetramers에서 신호는 토끼 안티 FITC 항 체를 사용 하 고 붙일 태그-토끼 IgG 항 체, 바인딩된 tetramers에서 신호 증폭을 함께 알을 품을 증폭. IHC는 인도 표준시와 함께에서 항 원 특정 T 세포와 주변 셀을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 셀의 또는 세포 외 공간에서 표면에 epitopes를 인식 하는 항 체는 tetramers와 기본 인큐베이션에 포함 됩니다. 세포내 epitopes를 인식 하는 항 체 얼룩이 지기 전에 세포 벽의 침투가 필요 합니다. 얼룩진된 조직 단면도 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 고 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 레이블이 지정 된 셀은 공초점 현미경 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 정량. 설명된 프로토콜 있는 MHC에 대 한 기본적으로 모든 조직에 항 원 특정 CD8 T 셀 얼룩을 사용할 수 있습니다-난 tetramers 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 주 1: 신선한 조직 단면 및 기본 보육

  1. 메스를 사용 하 여 신선한 조직 (약 0.5 c m 폭 0.5 c m 키 큰) 작은 조각으로 잘라. 별도로 플런저를 각 조직 접착제 그리고 PBS에 4% 낮은 용융 agarose의 3-5 mL를 포함. 스티커를 사용 하 여 조직 정보와 플런저를 레이블을 지정 합니다. 공고히 하는 얼음 양동이에 냉장된 홀더에 넣어요.
  2. 톰 및 설정 섹션을 200 µ m. 설치 톰 삽입 플런저에 면도날의 두께 톰 목욕에 조직으로 탑재.
  3. 100 µ g/mL 또는 18.7 U/mL 헤 파 린 PBS RNA를 보존 하 고 하류 잠재적인 틱 응용 프로그램 허용에 추가 하 여 헤 파 린 (PBS-H)에 식 염 수 인산 염 버퍼를 준비 합니다. 덮고 냉장, 무 균 PBS.의 100-120 mL와 함께 포함 된 조직, 톰 목욕을 채우기 0-에 온도 유지 하기 위해 목욕을 PBS-H 아이스 큐브를 추가 2 ° C. 시작은 톰와 200 µ m 섹션으로 조직.
    참고: 그것은 조직에서 조직 내의 세포 활동을 최소화 하기 위해 얼음에 냉장을 유지 하는 것이 중요 때 냉장은 신선한 조직 섹션에 쉽게 때문에 고. 다운스트림 흉내만 대 한 계획이 없습니다 경우 혼자 PBS를 사용할 수 있습니다.
  4. 또는 조직 (예: 창 및 폐), 톰으로 잘 잘라 하지 않는 조직으로 얇은 스트립으로 잘라 메스 또는 면도칼을 사용 200 µ m에 최대한 가까이.
  5. 실험 샘플 정보 24-잘 조직 배양 접시의 뚜껑을 분류 하 고 해당 우물에서 조직 실 장소. 조직 약 실에는 섹션을 전송 하는 붓의 1 mL를 포함 하는 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 설정 사용 냉장 PBS.
    참고: 재사용 가능한 조직 챔버는 얼룩 시작 전에 여야 한다. 조직 실 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 와이어 메쉬. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브의 바닥을 잘라. 튜브의 아래쪽에 있는 구멍에 맞게 원형에서 철 망을 잘라. 열 새 빨갛게 될 때까지 분 젠 버너를 사용 하 여 와이어 메쉬 원. 매우 신속 하 게 와이어 메쉬 원 뜨 고 메쉬에 튜브를 밀어. 와이어 메쉬는 튜브의 하단에 단단히 부착 하 고 다음에 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 3 mL 마크 튜브의 상단을 신중 하 게 차단 확인 하십시오. 각 조직 챔버, 또는 잘 당 조직의 1 c m 2까지 3 조직 단면도 넣어. 교차 오염을 피하기 위해 서로 다른 항 체 조합 우물 사이의 하나 이상의 빈 잘 유지.
  6. 진행 기본 tetramer와 항 체 조직 챔버로 모든 컷된 섹션의 전송 완료 후 즉시 얼룩. 섹션 빠져들, PBS-H의 1 mL에 항상 냉장 보관.
  7. 0.5 µ g/mL FITC 활용, 펩 티 드 로드 MHC와 하룻밤 조직 단면도 품 어-난 tetramers 2% 정상 염소 혈 청 (NGS) PBS-H에 희석. 마우스 또는 다른 비 토끼 항 체가이 외피의 extracellular epitopes에 포함 (예: 쥐 안티 CD8 항 체 희석 2%와 PBS-h에서 1: 500 NGS). 각 잘에서 희석된 항 체의 1 mL를 배치.
    참고: 한다 주의 일부 향상 및 일부 MHC tetramers T 세포 수용 체 4 , 21을 억제할 수 있는으로 CD8 항 체를 선택할 때. 쥐 안티 인간 CD8 항 체 여기에 설명 된 불안정 하 고 때로는 다소 약한 얼룩에 결과. 여기에 트리플 라벨 때문에 유일한 비 토끼와 비 마우스 CD8 항 체 테스트 그 얼룩진된 붉은 털 원숭이 CD8 T 세포에 대 한 사용 됩니다.
  8. 잘 당 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 1 차적인 항 체 및 모든 후속 외피와 수행이 락 플랫폼에 접시와 4 ° C에서 모든 후속 외피.
    참고: 조직 해야 플 로트 자유롭게 챔버에.

2. 주 2: 고정 및 보조 보육

  1. 기본 부 화 후 씻어 냉장된 PBS-H 20 분의 1 mL로 두 번 섹션 각 세척. 조직 실 냉장된 PBS-H 해당 우물의 1 mL를 포함 하는 다른 24-잘 조직 문화 접시에 전송 하 여이 작업을 수행.
    참고: 수 조직 챔버 사이 이동할 때 다른 한 실험 샘플에서 내용을 똑 하지 않도록 주의 하십시오. 모든 후속 외피와 세척, 마찬가지로 적절 한 솔루션을 포함 하는 깨끗 한 접시에 조직 챔버를 전송 합니다. 조직 실에 섹션에서 섹션 조직 챔버의 측면에 붙어 얻을 할 다는 것을 확인 하는 절차 동안 모니터링 해야 합니다. 그들은 솔루션에 다시 그들을 밀어, 경우.
  2. 신선한 PBS 버퍼링 4 %paraformaldehyde 실 온에서 2 h의 1 mL와 섹션 수정 (않는 이상 해결 되지). 차가운 PBS-h 5 분에 두 번 세척
    주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
    참고: 항 원 복구 및 permeabilization 세포내 epitopes를 감지 해야, 항 검색할 수 있습니다 paraformaldehyde 고정 후 0.01 mol 요소에 섹션을 끓는.
  3. 0.01 mol 요소를 포함 하는 24-잘 배양 배지로 섹션을 전송 하 고 렌지에이 접시를 놓습니다. 3 번 약 10 대 한 섹션을 삶아 s 30의 총 각, s.
    참고: 매우 조심, 비등으로 솔루션 우물에서 섹션을 강제로 수 있습니다. 이 경우를 사용 하 여 그림 붓 섹션 조직 챔버의 측면에서 또는 접시의 뚜껑에서 다시 적절 한 조직 챔버의 바닥에.
  4. 이전 이차 항 체 외피를 permeabilize 및 PBS-H, 0.3% 세제 (PBS-H-T), 그리고 2% 차단 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 단면도 차단 1 h와 4 ° C. 수행 후속 항 체 외피에 대 한 로커에 NGS PBS-H-T/2% NGS.
  5. 보조 부 화에 대 한 전송 조직 실에서 섹션 PBS-H-T/2% NGS에 토끼 안티 FITC 항 체 희석 1:10,000를 포함 하는 우물. 밤새 품 어.
  6. 수행 counterstaining 사용 하 여 마우스 안티-CD20 항 체 희석 PBS-H-T/2% NGS에서 1: 200. 이 옵션에 대 한 검색에서 epitopes 필요한 경우, 셀, 침투 및 위에서 설명한 대로이 부 화 하기 전에 차단.

3. 제 3 일: 3 차 인큐베이션

  1. 두 번째 부 화 후 20 분 이상 4 ° C에서 PBS-H에 세 번 섹션을 씻어
  2. 붙일 표시 (예, 염소 안티 토끼 활용 된 염소 반대로 쥐 활용된까지 붉은 염료, 녹색 노란색과 염소 반대로 마우스 활용된 녹색 염료 항 체 희석된 1:5, 000, 항 체와 적절 한 최종 부 화 수행 1:5, 000, 그리고 1:2, 000, PBS-H-T/2% NGS에 각각,). 밤새 품 어.
    참고:이 시점에서,는 인큐베이션 확장할 수 있습니다 최대 3 일 동안 필요한 경우. 섹션을이 incu 동안 판 틴 호 일에 감싸서 빛 으로부터 보호 유지bation 단계 이후, 빛 냉각 fluorophores.

4. 제 4 일: 장착 섹션

  1. 세척 섹션 3 회 PBS-H에 20 분 이상
    참고: 다운스트림 분 19에 대 한 계획, tetramers 및 장소에서 항 체를 확보 하 고 다음 두 번으로 PBS-5 분에 대 한 섹션을 씻어 1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 섹션 수정.
    주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
  2. 는 현미경 슬라이드를 섹션을 전송 하는 붓을 사용 합니다. 조직을 너무 많이 찌 르 지 않기로 조심. 글리세롤/젤라틴 포함 4 mg/mL n 틸 gallate 또는 fluorophore 방부 제를 포함 하는 다른 설치 매체와 함께 각 섹션을 코트. 커버는 coverslip로.
  3. -20에서 슬라이드 빛 보호 컨테이너에 슬라이드를 저장 ° C. 조직 문화 접시를 헹 구 고 알코올을 사용 하 여 뚜껑에 레이블을 제거.
    참고: 접시를 다시 사용할 수 있습니다.

5. Confocal 현미경 이미지의 수집

  1. confocal 현미경, 각 fluorophore ( 그림 1A와 B)에 대 한 적절 한 레이저와 필터를 사용 하 여 고해상도 이미지를 캡처.
    참고:이 예제에서는 confocal 현미경 사용 되었다 (재료의 표 참조). 이미지는 녹색 노란색 표시 된 항 원 특정 T 세포, 녹색 표시 CD20 표현 B 셀, 10% 전력에서 488 nm 레이저와 CD8 T 세포까지 붉은 표시에 대 한 15% 전력에서 640 nm 레이저에 대 한 20% 전력에서 561 nm 레이저를 사용 하 여 수집 되었다. 목표와 0.8의 숫자 조리개 X 20을 사용 했다.
  2. 는 순차적으로 여러 800 x 800 픽셀 분야에서 3 개의 채널 간격으로 z-시리즈 3 µ m (또는 다른)를 수집합니다. 수집 된 필드의 몽타주 구성 ( 그림 1C -E). 해당 슬라이드의 정보에 따라 각 몽타주 이미지 이름을 지정 하 고 분석을 위해 저장.
  3. 양적 이미지 분석 각각 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행.

6. 양적 이미지 분석

참고: 양적 이미지 분석 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 여기, ImageJ 예제로 사용 되었습니다.

ImageJ 창 ( 그림 2A)에 그것을 드래그 하 여
    는 confocal
  1. 오픈 몽타주.
    참고: ImageJ 직접 많은 다른 confocal 현미경에 의해 수집 된 몽타주를 열 수 있습니다. 몽타주 ImageJ에서 직접 열 수 없습니다, 선택한 z-스캔 그것을 열려면 TIFF 파일로 내보냅니다
  2. 선택한 z-검색 분석에 대 한 복제 (" 이미지 "-> " 복제 ") ( 그림 2B).
  3. 다른 채널 분할 (" 이미지 "-> " 색상 "-> " 분할 채널 ") ( 그림 2C).
  4. 객관적 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익을 그릴 " T " 키보드에. 면적 측정.
    참고: ImageJ의 ROI 관리자에서는 지역 µ m 2 ( 그림 2D).
  5. 형광 밝기 및 대비의 분석 채널을 조정 (" 이미지 "-> " 조정 "-> " 밝기/대비 ") ( 그림 2E).
  6. 평평 이미지에 ROI (" ROI 관리자 "-> " 결합 ") ( 그림 2F).
  7. 계량 사용 하 여 이미지에 긍정적인 세포는 " 다 지점 " 도구 ( 그림 2G).

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결과

그림 1 에 confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 양적 이미지 분석을 ImageJ를 사용 하 여 보여 줍니다. 그림 3 과 4 대표 이미지는 SIV에서 림프절 조직의 감염 CD20 항 체와 MHC tetramers, CD8 항 체, 얼룩진 붉은 털 원숭이 쇼 그리고 MHC tetramer 얼룩의 특이성을 ?...

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토론

인도 표준시 IHC와 결합 감지, 특성화, 및 항 원 특정 CD8 T 세포 다른 셀 및 조직 구조는 컨텍스트 네이티브 환경에서 측정을 위한 필수적인 도구를 제공 합니다. 여기, 우리는 인도 표준시 IHC, 이어서 양적 이미지 분석, 위치, 풍요, 붉은 털 원숭이에서 림프절에 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 결정을 함께 결합에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다. 적용된 인간, 마우스, 또는 어떤 MHC에 대 한 다른 ?...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스는 건강의 국가 학회 (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617)에서 부여.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MHC-I monomerNIH tetramer core facilityMaterials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serumJackson Immunoresearch005-000-121
Low melt agarosePromegaV3121
HeparinSigma-AldrichSLBL6391V
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
UreaJ.T.Baker4204-05
Glycerol gelatinSigma-AldrichSLBH2672V
n-propyl gallateSigma-AldrichP3130
rat-a-h-CD8 (1:500)Acris0714Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)Vector6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000)Jackson Immunoresearch124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)Jackson Immunoresearch106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)Jackson Immunoresearch118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome: VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments, LLC1079
Quick Set Instant AdhesiveLoctite46551
24-well flat bottomed tissue culture platesFalcon353226
Microscope slideGlobe scienfitic Inc.#1321
Razor  bladeTed Pella, Inc121-6
Feather Disposable ScalpelFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.No. 21
Round paintbrush #2PRINCETON ART & BRUSH CO.4350RCan trim as needed with razor
Confocal MicroscopeOlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus

참고문헌

  1. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
  3. Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  4. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  5. Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
  6. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  7. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
  8. Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
  9. Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
  10. Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519(2014).
  11. Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679(2014).
  12. Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).
  13. Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
  14. Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
  15. Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).
  16. Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).
  17. Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
  18. Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
  19. Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561(2009).
  20. Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
  21. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  22. Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
  23. Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
  24. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).

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