높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

요약

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

초록

셀 다른 형태학 및 복잡 한 해 부 관계를 표시합니다. 그들의 이웃과 셀 어떻게 상호 작용 합니까? 상호 작용 세포 유형 사이 또는 지정 된 형식 내에서 심지어 다릅니까? 그들은 어떤 종류의 공간 규칙을 따라 합니까? 이러한 근본적인 질문에 비보에 대 한 답변 고해상도 단일 셀 라벨에 대 한 도구의 부족으로 지금까지 방해 되어 있다. 여기, 상세한 프로토콜 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 기법으로 단일 세포를 대상으로 제공 됩니다. 이 방법은 3 다르게 태그 기자 (HA, 플래그 및 V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관을 사용 합니다. 열 충격 펄스 유도 열 충격 유도 Flp recombinase, 개별 셀에 FRT-정지-FRT 카세트를 임의로 제거 하 식: 식 또한 GAL4 드라이버를 표현 하는 셀에만 발생 합니다. 이것은 높은 해상도에서 개별 셀 형태학의 시각화 수 있는 특정된 셀 종류의 서로 다른 색된 셀의 배열. 예를 들어, MCFO 기술 초파리 두뇌의 다른 폐해의 형태학을 시각화 하기 위해 특정 glial GAL4 드라이버와 결합할 수 있습니다.

서문

명과, 신경 계통 (NS), 비 신경 세포 인구 했다 긴 신경 세포에 대 한 정적 프레임 워크를 제공 하 고 따라서 자세히 공부 하지 했다. 그러나, 인간, 명과 셀 NS (~ 90%)의 대다수를 구성 하 고 이다, oligodendrocytes, microglia 및 Schwann 세포를 포함 하 여 일부의 범주에 빠지다. 초파리에서 명과 NS에 있는 세포의 약 10%를 구성 합니다. 글에, 그들의 형태학과 기능 척추 동물^1,2에서 발견 된 현저 하 게 유사 하다. 그들의 형태학 혈액-뇌 장벽 (BBB) 형성 epithelia, ensheathing, 사이토와 같은 셀을 포함 합니다.

다음 주 구조 이루어져 초파리 중앙 신경 시스템 (CNS): 신경 셀 시체;를 포함 하는 피 질 영역 neuropils 시 냅 스 연결 항구 다른 neuropiles; 연결 하는 크고 작은 축 삭 책자 CNS는 (그림 1)과 감각 기관과 근육을 연결 하는 주변 신경 명과 이러한 모든 해 부 구조와 관련 된 찾을 수 있습니다: 피 질 명과 (CG) 대뇌 피 질의 영역, 사이토 처럼 명과 (ALG) 및 neuropile 지역, ensheathing 명과 ensheathing 명과 (EG)에 또한 중앙 축 삭 책자와 주변 기기 연결 신경 (EGN), 그리고 마지막으로, 두 개의 시트 같은 명과, perineurial 명과 (PG) subperineurial (SPG)는 함께 전체 NS (그림 2)를 포함 하는 연속 층을 형성 하 고.

이전 연구는 명과 NS;의 개발에 중요 한 역할을 그들은 체계적으로 순환 인슐린 같은 펩 티 드에 반응 하 여 신경 세포 수를 모니터링 하 고 사이토 신경 젖 셔틀 같은 신경에 영양 지원을 제공, 먹어서^3,4 여 죽어가는 신경 세포를 제거 ^{, 5 , 6}. 성숙한 NS에서 명과 BBB 유지, 신경 전달 물질을 차지 하 고 이온 항상성 유지, NS, 주요 면역 세포 대 식 세포 수 없기 때문에 BBB, 위반 시 냅 스 활동으로 동물 행동⁶ 조절 역할 ^{, 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

다른 폐해 하위 전문된 기능을 수행 하는 여부는 중요 한 미결 문제에 남아 있다. 그러나, 명과, 성인, 특히에 대 한 체계적인 게놈 넓은 분석 그들의 조작에 대 한 적절 한 유전 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 셀 셰이프 셀을 복잡 한 상호 작용을 공부를 효율적이 고 쉬운 특성을 허용 하는 메서드가 제공 됩니다. 이 기술은 성인 초파리 뇌의 다른 폐해의 형태학 특성을 적용 하지만, 특정 GAL4 드라이버 사용에 따라 그것은 신경^{12,13 공부에 적응 수 있습니다.} , intermingling 셀의 원리에 어떤 종류 어떤 발달 단계에 있는 조직.

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프로토콜

1. 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 실험에 대 한 준비 파리

참고: The MCFO 기술 소위 Flp 중재 중지 카세트 절단 (FlpOut)의 수정된 된 버전을 말합니다. 유전자 변형 MCFO 파리 열 충격 발기인 (hsp) 수행-Flp recombinase UAS 아래 다른 기자 제어. 각 기자 myristoylated (myr) 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP), 피토 프 태그의는 10 년에서의 일반적인 백본 구성 됩니다 (예., 하, 플래그 또는 V5) 삽입 되었습니다. 결과 비 형광 단백질의 이름은 " 스파게티 괴물 GFPs " (smGFPs) ¹⁴ 다른 epitope 태그에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 감지할 수 있습니다.

1. 크로스 파리 MCFO 카세트와 hsp-Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)는 적절 한 폐해 GAL4 드라이버 라인에 (재료의 표 참조) .
   1. 는 hsp 이미 25 ° C에 활성화 하 고 몇 셀 재결합 한 불특정 라벨을 선도 받을 수 시스템의 시키는 피하기 위하여 18 ° C에서 십자가를 설정 합니다. F1 세대를 18 ° C에서 약 20 일을 기다립니다. 열 후 (2 단계 참조) 충격, 25 ° C ( 그림 3)에서 날아 유지.

2. 열 충격

참고: 삽입 사이트 따라 hsp Flp의 효율은 달라질 수 있습니다; 그리고 따라서, 최적의 열 충격 시간 최적화가. 이 프로토콜에 대 한 hsp Flp X 염색체에 삽입 된 MCFO 비행 재고 사용 되었습니다 (재료의 표 참조).

1. 전송 자손 단계 1.1에서에서 십자가의 (F1 세대 파리, 3-4 일) 음식과 열을 포함 하는 새로운 유리병에 물 욕조에 37 ° C에서 그들을 충격.
   참고: 젊은 파리 (1-2 일)는 열 충격에 매우 민감합니다. 치료로 인 한 사망률을 줄이기 위해 열 충격을 수행 하기 전에 더 많은 일 1 또는 2를 기다립니다. 사용 F1 세대의 일부 컨트롤, 열 충격 없이 파리.
2. 열 충격 동안 스트레스 유발 사망률의 속도 감소 음식으로 일반 튜브에서 파리를 유지. 여성 및 남성 별도 튜브에 넣어.
3. 전체 유리병 균질 열 충격을 보장 하기 위해 물에 젖어 있는지 확인 합니다. 5-8 분 충격 적당 한 시작 지점으로 사용 하 여 스파스 많은 GAL4 드라이버 라인; 명과 셀의 라벨에 대 한 각 드라이버 및 실험 (짧은 또는 긴 열 충격 시간이 필요할 수 있습니다)에 대 한 충격 기간을 최적화 해야 합니다.
4. 열 충격 후 열 충격에서 회복 하기 위해 파리를 수 있도록 하기 위해 몇 분 동안 벤치에 가로로 튜브 하다.
   참고: 그것은 튜브를 변경할 필요가 없습니다.
5. 25 ° C에서 파리를 유지 하 고 해 부 (3, 4 단계 참조) 그들 2 일 이상 열 충격 후 최적의 기자 식.

3. 해 부 준비 및 솔루션

1. 해 부, 주 20 %paraformaldehyde (PFA)를 2 %PFA 솔루션의 20 µ L와 S2 세포 배양 매체의 180 µ L를 혼합 하 여 200 µ L PCR 튜브에 신선한 통 솔루션을 준비. 전과 해 부 동안에 얼음 통 솔루션 유지.
   주의: PFA 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다.
   참고: 혼합 S2 세포 배양 매체의 160 µ L 2% 솔루션 대신 4 %PFA 솔루션을 준비 하는 200 µ L PCR 튜브에 20 %paraformaldehyde (PFA)의 40 µ L.
2. 튜브 당 8-10 두뇌의 최대 유전자 당 1 개의 PCR 관을 사용 하 여 최적의 얼룩 결과.
3. 두뇌 세척 솔루션의 준비: 0.5% 소 혈 청 알 부 민, 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100.
   참고: 얼룩, 1%를 포함 하는 솔루션에 따라 트라이 톤 X-100 필요할 수 있습니다. Triton X-100의 높은 농도 조직에 항 체의 침투를 증가 하 고 그것은 깊은 조직 (예: 성인 초파리 뇌의 시 냅 스 지역) 안에 얼룩 지역 필요.
4. 차단 솔루션 준비: 3% 정상 염소 혈 청, 3% 정상 당나귀 혈 청, 그리고 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100.
5. 두뇌 세척 솔루션 및 차단 솔루션의 몇 주 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다.
6. 얼음에 깊은 우울증 웰 스 유리 접시를 넣고 각 채우기 다음 솔루션과 잘:와 70% 에탄올, 하나 PBS, S2 세포 배양 매체와 하나 하나.

4. 성인 뇌 해 부

1. 3cm는 stereomicroscope의 무대에서 요리를 해 부하 고 차가운 S2 세포 배양 매체와 그것을 채우기. 조직 해 부 절차 동안 건강 한 유지에이 매체의 모든 해 실시.
   참고: (이미지)에서 좋은 배경 대조를 제공 하는 블랙 실리콘의 몇 밀리미터 늘어서 해 접시를 사용 하 고 해 부 동안에 집게를 보존.
2. CO ₂ 원하는 유전자의 파리 anesthetize.
3. 집게, 날개에 의해 파리를 잡아와 30에 대 한 차가운 70% 에탄올에 그것을 씻어 다음 추가 30에 대 한 차가운 PBS 가진 s s.
4. 깊은 우울증 잘 S2 세포 배양으로 가득으로 즉시 전송.
5. 동일한 유전자 형의 모든 파리에 대 한 동일한 절차를 반복 하 고 해 부, 조직 유지 됩니다 때까지 차가운 S2 세포 배양 매체에서 그들을 유지.
   참고: Anesthetize 수 수 해 부 약 30 분의 기간에 S2 세포 배양 매체에서 긴 보육 시간 파리의 수는 조직 손상 될 수 있습니다만.
6. 집게와 함께 파리를 잡아와, stereomicroscope에서 잠수함 S2 세포 배양 매체에서 비행.
7. 머리는 시체의 나머지 부분에서 분리합니다. 본문을 삭제 하 고 S2 세포 배양 매체에 빠져들 머리를 유지. 그것은 매우 중요 한 해 부의 전체 기간에 대 한 집게로 머리를 잡아입니다. 머리를 시작 하는 경우는 조직 손상 없이 검색 하기 어려울 것입니다.
8. 항상 적어도 하나의 집게로 머리를 잡고 한쪽 눈을 꺼내 여 해 부를 시작 합니다. 그는 집게의 끝은 바로 피하려고 망막 아래는 조직 손상 아래 다는 것을 확인 하십시오. 다른 눈에 밖으로 끌어와 두뇌가 나타날 때까지 표 피를 제거 시작.
9. 제거 모든 tracheal 조직과 뇌 주변의 표 피 조직 깨끗 한 때까지 합니다. 최적의 얼룩 결과; 뇌 주변의 모든 tracheal 조직을 제거 확인 조직 고정 하 고 얼룩이 될 준비가 됩니다.
10. 차가운 S2에 모든 해 부 머리 고정 단계 시간 위하여 PFA 솔루션으로 그들을 전송 하기 전에 배양 세포 유지.

5. 성인 두뇌 얼룩

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전송 P10 피 펫과 격리 된 뇌 실 온 (RT)에서 PFA 솔루션으로. 조직 손상을 방지 하려면 해 부 후 두뇌를 전송 집게를 사용 하지 마십시오. 200 µ L PCR 튜브는 nutator에 있는 모든 단계를 수행 하십시오.

튜브의 하단에 정착을 두뇌 허용 P200 피 펫과 오래 된 솔루션을 삭제 하기 전에 모든 단계. 발음은 조직 없이 상쾌한을 제거 하려고 합니다. 가벼운 노출에서 조직 보호.

수정 2%의 200 µ L에서 두뇌 PFA S2 세포 배양 매체 1 h 또는 4% PFA 30 분. 재현성을 증가 하기 위하여 샘플 사이 동일한 고정 시간을 유지.

세척 솔루션, 성인 뇌의 200 µ L에 각각 15 분의 3 (또는 이상) 세척 후 30 분에 대 한 솔루션을 차단의 200 µ L로 조직 차단. 솔루션을 차단에 더 이상 부 화 시간이 가능 하다.

두뇌 두뇌 세척 솔루션 200 µ L의 총 볼륨 희석 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 품.
참고: 보육 시간 사용 하는 항 체의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 더 이상 외피 필요할 수 있습니다.

1. 3 MCFO 마커의 라벨에 대 한 안티와 두뇌를 품 어-하 (1: 500), 반대로 플래그 (DYKDDDDK epitope) (1: 100), 및 안티-v 5 기본 항 체.
2. 기본 직접 활용 된 항 체는 정상적인 1 차 + 2 차 조합 대신 사용할 수 (예., 안티-V5:DyLight 549 (1: 200)). 이 경우에, 2 차 항 체로 직접 활용 된 항 체 치료.
   참고: 각 유전자 형에 대 한 컨트롤을 확인 하는 얼룩의 특이성으로 일부 머리를 유지. 1 차적인 항 체 외피를 생략 하 고 다음 단계로 직접 이동.

성인 뇌 세척 솔루션 (단계 3.3)의 200 µ L에 3 번 1 시간을 위한 조직을 세척 하 고 보조 fluorophore-어원이 같은 말/기본 직접 활용 된 항 체 두뇌 4 솔루션을 하룻밤 세척 희석으로 그들을 품 어 ° C 또는 200 µ L의 전체 볼륨에 RT에서 4 h
참고: 적절 한 항 체의 예: AlexaFluor 488 (1: 250), 안티-V5:DyLight 549 (1: 200) 및 DyLight 647 (1: 100)-항 체를 활용 시켰다.

성인 뇌 세척 솔루션, 4 ° C에서 하룻밤 또는 RT에 1-2 h는 PBS의 200 µ L에서 최종 세척 뒤의 200 µ L에 1 시간에 3 번 두뇌 세척, PBS 최종 세척 단계 Triton X-100의 모든 흔적을 제거 하 고 필요 최적의 얼룩 결과입니다. 유리 coverslips에 방지 페이드 에이전트 설치 매체에 두뇌를 탑재.

6. 이미징에 대 한 두뇌의 장착

가 위를 사용 하 여 적절 한 크기를

이미징은 트림
1. 스페이서. 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 두 개의 유리 coverslips 사이 견본 및 이미징 스페이서 샌드위치.
   참고: 이미징 스페이서는 얇은 (0.12 m m 두께) 접착제 스페이서 껍질 및 유리 coverslips 또는 현미경 슬라이드에 충실 하는 압축 하지 않고 표본의 장착 수.
2. 집게를 사용 하 여, 1 개의 표면에서 접착제 라이너를 제거 하 고 스페이서, 접착 면이 아래로, 유리 coverslip (22 m m x 60 m m)의 표면에 적용. 새로운 유리 coverslip 장착 매체의 10 µ L 적용.
3. P10와 피 펫, 200 µ L 튜브에서 설치 매체의 드롭 옆 coverslip 두뇌를 전송. 조직, 함께 솔루션에 두뇌를 유지 하기 위해 일부 PBS 전송.
4. P10와 피 펫, PBS에서 PBS의 양을 제한 하는 설치 매체의 드롭 두뇌를 이동 합니다. 설치 매체에 있는 표본 이미징 스페이서와 coverslip에 전송 합니다. 충분 한 설치 미디어를 사용 하 여 표본을 커버.
5. 는 스페이서의 상단에서 다른 접착제 라이너를 제거 하 고는 표본 위에 유리 coverslip 추가. 집게의 끝에와 함께 부드러운 압력 밀봉 접착제 영역에 적용 됩니다. 이미지 탑재 된 조직을 즉시 또는 나중에 분석-20 ° C에서 슬라이드 저장.

7. 이미지 수집

1. confocal 형광 이미지 40 X confocal 현미경을 사용 하 여 취득 스택 (나 = 1.2, 물 침수) 목표 또는 63 X (NA = 1.4, 기름 침수) 목표 (픽셀 크기 xy 평면;에서 1024 x 1024 = 두 개의 confocal 섹션 사이의 거리 = 0.5 µ m). 감지기 이득 및 오프셋 아무 포화 픽셀 및 0 픽셀 값은 이미지;에 존재 하는 방식으로 각 채널에서을 조정합니다 이 정보 손실 방지 및 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하 여 보장.
   참고: 지금까지 3D 영상 시간이 소요 때문에에 측정 다른 위치에서 동시에 여러 개의 샘플을 검색 하 여 자동화할 수 있습니다. 물 침수 목적으로 증발을 피하기 위해, 사용 하 여 특별 한 기름 침수 매체 굴절률 n = 1.33.
2. Confocal 스택 최대 밀도 프로젝션, 채널 색조 및 밝기 조정에 변화를 처리 하 고 모든 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 대조 (재료의 표 참조).

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결과

이 섹션에서는 초파리 두뇌의 MCFO 기술을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다. 그림 3 방법의 회로도 보여준다. 3 명의 다르게 막 태그 기자 (myr-smGFP-하, myr-smGFP-플래그 myr-smGFP-V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관 됩니다. 열 충격 펄스 유도 임의로 개별 셀?...

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토론

이 프로토콜 높은 해상도에 관심의 조직 내에서 다른 세포 유형의 형태를 연구 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. MCFO 기술을 다른 epitope 태그로 여러 기자 색 확률적 라벨 (그림 2)에 대 한 조합에 사용 됩니다. Brainbow/Flybow^15,,1617등 다른 방법과 마찬가지로 MCFO 증가 마커 coexpression 통해 레이블 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning