교차 reactivity 무료 및 정찰 병 무료 스냅 칩 샌드위치 Immunoassays 다중화

요약

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

초록

멀티플렉스 단백질 분석 우수한 진단 민감도 단일 단백질에 비해 정확도 보이고 있다. 항 체 microarrays는 단일 칩에 동시에 수행 하는 마이크로 스케일 immunoassays의 수천 수 있습니다. 샌드위치 분석 결과 형식 두 항 체, 각 목표를 감지 하 여 분석 결과 특이성을 향상 하지만 분 따라서 그들의 멀티플렉싱 기능을 제한 하는 시 약 사이에서 겪고 있다. 항 체 colocalization microarray (ACM) 교차 reactivity 무료 다중화 단백질 검출에 대 한 개발 되었습니다 하지만 microarray 제조 분석 실험 중에 비싼 반점을 찍는 현장. 이 작품에서는 단순히 맞춤 2 칩 함께, 따라서 아무 정찰 병 샘플 인큐베이션 및 탐지 항 체 (dAbs) 시의 후속 응용 프로그램 필요에 의해 microarray microarray에서 시 약을 전송 하는 스냅 칩 기술 시연 미리 발견된 슬라이드, 슬라이드 준비 분석 결과 실행에서 해리의 스토리지. 두 메서드 모두 단일 및 이중 전송 두 microarrays 사이 정확한 줄 맞춤을 달성 하기 위해 제공 됩니다 그리고 두 방법에 대 한 슬라이드 제작 설명. 결과 < 40 μ m 맞춤 이중 전송, 625 명소/c m²의 배열 밀도 도달 달성 되었습니다. 50 plexed immunoassay 다중화 단백질 분석에 스냅 칩의 유용성을 설명 하기 위해 실시 되었습니다. 35 단백질의 검출 한계 범위의 pg/ml에서는 이다입니다.

서문

높은 감도 특이성 암^1,2등 복잡 한 질병의 진단에 단일 바이오 마커 보다 여러 단백질을 구성 하는 바이오 마커의 패널 제공할 수 있습니다. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 골드 표준 기술 플라즈마, 낮은 pg/mL에 탐지의 제한 하지만 분석 결과^3,,45당 하나의 대상에 한계를 달성 하는 임상 실험실에서 사용 되었습니다. 항 체 microarrays는 단일 현미경 슬라이드^6,,78에 병렬로 실시 소형된 분석 실험의 수천을 수용에 대 한 개발 되었습니다. 그러나,이 방법의 멀티플렉싱 기능 dAbs, 혼합물의 응용 프로그램에서 발생 하는 시 약 기반 분으로 제한 하 고 대상^9,10 의 증가 함께 더 많은 문제가 된다 ^{, 11}. Pla 외. 다중 샌드위치 분석 실험의 결과 취약점 확장 4N(N-1)로 N은 대상¹²의 수 명시 된 있다.

항 체 microarrays 항 체 colocalization microarray에에서 분 완화 (ACM) 멀티플렉스 샌드위치 분석 결과¹²에 대 한 우리의 실험실에서 개발 되었습니다. 캡처 항 체 (택시) microarray 정찰 병으로 기판에 발견 됩니다. 차단 샘플 표면에 적용 된 다음 개별 dAbs 택시-항 원 복합체와 같은 명소에 발견 후에. 항 체와 항 원 간의 모든 분 시나리오 ACM, 함께 완화 될 수 있습니다 그리고 pg/mL에 탐지의 한계 달성 되었습니다. 그러나 준비 하 고 비싸고 시간이 소모 되는 정렬 목적에 대 한 높은 정밀도 함께 현장 microarray 정찰 병을 사용 하 여,이 넓은 응용 프로그램 제한 실험 동안에 dAbs 안보 분석 결과 프로토콜에서 요구 하는, 다른 실험실입니다. 스냅 칩 라는 휴대용 ACM 개발 되었습니다 교차 reactivity 무료 고 샌드위치 immunoassays^13,,1415다중화 정찰 병 무료. 택시와 dAbs는 사전 분석 결과 슬라이드와 microarray 형태로 각각 전송 슬라이드에 발견 하 고 저장. 분석 결과, 동안 슬라이드를 검색 하 고 dAbs microarray 단순히 함께 두 개의 칩을 스냅 하 여 분석 결과 슬라이드에 집단적으로 전송 됩니다. 스냅인 장치는 신뢰할 수 있는 시 약 전송을 위해 사용 됩니다. 그러나 니트로 코팅 슬라이드는 비교적 큰 항 체 바인딩 용량 액체 작은 물방울을 흡수 분석 결과 슬라이드로 사용 되 고 전송 시 약을 촉진,, 슬라이드는 더 비싼 보다 일반 유리 슬라이드와 microarray 비-투명 슬라이드와 호환 스캐너 신호 수집 필요 합니다.

이 작품에서 스냅 칩 다중 샌드위치 immunoassay 수행 프로토콜을 설명 합니다. 새로운 스냅인 장치 microarray microarray에서 보다 편리 하 고 믿을 수 있는 시 약 전송을 위해 개발 되었습니다. 중요 한 것은, 여기 우리가 시 전송 방법 스냅 칩 일반 유리 슬라이드에 설립 했다. 1024 명소 했다 성공적으로 전송 되 고 크게 확대 대부분 실험실에서이 기술 사용 하 여 유리 슬라이드에 정렬 됩니다.

프로토콜

1. 스냅 칩 제조 및 저장

1. 이전 방법 ( 그림 1a)
   1. 자리 cAb 솔루션 400 µ g/mL 항 체를 포함 하 고 20% 글리세롤 인산 염 버퍼 염 분에 (PBS)을 nitrocellulose (또는 기능성된 유리)에는 잉크젯 microarray 정찰 병 ¹³ 60%의 상대 습도에서 분석 결과 슬라이드 (1.2 각 명소에 대 한 nL) 800 µ m 센터-센터 간격. 슬라이드 한 구석에 따르면 정찰 병 갑판에 고정 되어 있는지 확인 (여기, 왼쪽 아래 사용 되었다).
   2. 60%의 상대 습도와 1 시간 실 온에서 발견된 분석 결과 슬라이드를 품 어.
   3. 클램프 16 구획 16 우물으로 그것을 분할 하는 분석 결과 슬라이드에 슬라이드 모듈 가스 켓. 0.1%를 포함 하는 PBS의 80 µ L을 추가 하 여 슬라이드 세 번 씻어 트윈-20 (PBST) 각 잘 떨고 통, 5 분 각 시간에 450 rpm으로.
   4. 차단 솔루션을 각각 잘 고 450 rpm에서 1 h에 대 한 동요의 추가 80 µ L.
   5. 개 스를 제거 하 고 건조 한 질소의 스트림 분석 결과 슬라이드.
   6. 정찰 병 갑판에 전송 슬라이드를 해결 하 고 정찰 병 갑판의 하단 왼쪽된 모서리에 대 한 슬라이드의 왼쪽 아래를 밀어. 잉크젯 택시에 대 한 것과 동일한 레이아웃으로 정렬 표시 (폴리스 티 렌 마이크로-비즈 솔루션)의 배열을 자리.
   7. 건조 맞춤 표시 하자. 이전 슬라이드를 대칭 이동 하 고 하단 왼쪽된 모서리에 대 한 고정 정찰 병 갑판에 그것을 다시 넣어.
   8. 20 µ g/mL 항 체, 20% 글리세롤과 1 %BSA 포함 하는 솔루션을 발견 하는 소량 준비.
   9. 는 정찰 병을 사용 하 여 ' s 카메라, 맞춤 마크의 사진을. 이 그림을 표준으로 탐지 프로그램으로 구현 하 고 가장 상단 왼쪽된 마크를 식별 하기 위해 잉크젯 정찰 병의 이미지 인식 시스템. 좌표를 사용 하 여 dAb 배열의 첫 번째 장소. 드롭릿 800 µ m의 센터-센터 간격 당 자리 8 nL.
2. 이중 전송 방법 ( 그림 1b)
   1. 전송 슬라이드 1 왼쪽된 하단에 대 한 잉크젯 정찰 병 갑판에 배치. 택시 솔루션, 포함 된 400 µ g/mL 항 체 20% 글리세롤, PBS에서 1 %BSA 60%의 상대 습도 잉크젯 microarray 정찰 병으로 슬라이드에 자리 (0.4 각 명소에 대 한 nL 및 ~ 200 µ m 직경에서). 센터-센터 간격은 400 µ m.
   2. 스냅 스냅 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 분석 결과 슬라이드에 택시 물방울 전송 전송 슬라이드 코팅 nitrocellulose (또는 기능성된 유리) 분석 결과 슬라이드.
      1. 차례 모든 6 버튼 잠금 열림 위치에서 모든 plungers를 90도 스냅 기구 측면. 잘린 모서리 고정된 포고 핀을 직면 하 고 그것의 소켓에서 슬라이드 홀더에 전송 슬라이드를 삽입 합니다. 3 개의 버튼으로 황금 포고 핀 plungers를 슬라이드 맞춤 핀에 대 한 적용 됩니다 있는지 확인 하십시오의 첫 번째 집합 설정.
      2. 스냅 기구 거꾸로 앉아 4 포고 핀에에 니트로-코팅 슬라이드를 삽입 합니다. 실버 핀 plungers를 슬라이드 맞춤 핀에 대 한 적용 됩니다 있는지 확인 하는 3 개의 버튼의 두 번째 세트를 차례로.
      3. 가기 셸 슬라이드 홀더 맞춤 기둥 구멍을 사용 하 여 정확한 위치에 배치 하 여 맞춤 장치를 닫습니다.
      4. 그것의 감 금으로 닫힌된 스냅 기구를 삽입 하 고 밀어 폐쇄 탭 완전히 microarrays 적절 한 압력을 적용 하는 동안 얼굴을가지고. 1 분에 대 한 폐쇄 유지
   3. 슬라이드를 분리. 60%의 상대 습도와 1 시간 실 온에서 분석 결과 슬라이드를 품 어. 세척, 차단, 및 단계 1.1.3-1.1.5에에서 설명 된 대로 분석 결과 슬라이드 건조.
   4. 는 잉크젯 정찰 병 갑판에 밀어 하단 왼쪽된 모서리에 대 한 또 다른 전송 슬라이드를 배치합니다. 자리 dAb 솔루션 50 또는 100 µ g/mL의 항 체 (표 1 참조), 20% 글리세롤과 PBS에서 1 %BSA 포함. 각 자리 0.8 인지 확인 nL와 관광 명소의 센터-센터 간격은 400 µ m.
   5. 분석 결과 및 이전 슬라이드를 저장합니다. 분석 결과 전송 슬라이드 시키는 포함 하는 밀폐 봉지에 밀봉 하 고는-20 ° C 냉동 실에 넣어.

2. 스냅 칩 immunoassays 다중화

1. 검색 냉장고에서 분석 결과 슬라이드. 슬라이드는 실내 온도에 올 때까지 30 분 동안 봉인 가방 두고.
2. 준비 7-포인트 시리얼 단백질 0.05%를 포함 하는 PBS에 급상승 하 여 샘플 솔루션을 희석 트윈 20.
   참고: 여기, 5 희석 요소 사용 됩니다. 각 단백질에 대 한 시작 농도 표 1에 나와 있습니다.
3. 적절 한 준비 샘플 솔루션입니다. 예를 들어 PBST 버퍼에 4 번 인간의 혈 청을 희석.
4. 분석 결과 슬라이드에 16 실 가스 켓을 클램프.
5. Pipetting으로 7 단백질 희석 솔루션 및 단백질-무료 PBST 버퍼 솔루션 8 우물의 한 열을 입력합니다. 같은 슬라이드에 다른 8 우물에서 샘플 솔루션을 플라스틱.
   참고: 각에 들어갈 수 있는 80 µ L 솔루션 잘. 필요한 경우 추가 샘플을 측정 하 더 많은 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
6. 실 온에서 1 h 또는 4 ° C. 세척 슬라이드 세 번 450 rpm, 5 분 때마다 통에 PBST에서 하룻밤을 위해 450 rpm에서 통에 샘플을 품 어. 개 스를 제거 하 고 건조 한 질소 가스의 스트림 아래 슬라이드.
7. 는 냉장고에서 dAbs과 전송 슬라이드를 검색합니다. 실 온에서 30 분 동안 봉인 가방을 유지. 그런 다음 60% 습도 안정화 구슬 재에 대 일 분을 포함 하는 닫힌된 챔버 (예: 빈 팁 박스)에 슬라이드를 품 어.
8. 는 DAb 물방울 전송 스냅 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 분석 결과 슬라이드와 전송 슬라이드 스냅. 1.2.2 스냅 기구 운영에 대 한 섹션을 참조 하십시오.
9. 슬라이드를 구분합니다. 품 어 60% 습도 안정화 구슬 1 h. 클램프 16 구획 가스 켓과 분석 결과 슬라이드를 포함 하는 닫힌된 챔버에 분석 결과 슬라이드와 슬라이드 4 번 린스 450 rpm, 5 분 때마다 통에 PBST를 사용 하 여.
10. 피펫은 80 µ L의 각 음에 PBS에 2.5 µ g/mL streptavidin fluorophore 포함 하는 솔루션. 450 rpm에서 통에 20 분 동안 품 어.
11. 450 rpm에서 통에 3 번과 PBST 슬라이드와 증류수 한 번 씻어. 개 스를 제거 하 고 건조 한 질소 가스를 사용 하 여 슬라이드.

3. 검색 및 데이터 분석 슬라이드

1. 635 nm 레이저를 사용 하 여 형광 microarray 스캐너로 분석 결과 슬라이드를 스캔.
2. 추출 분석 소프트웨어 (예: 배열 프로 분석기) ¹⁶를 사용 하 여 각 자리의 순 강도.
3. 통계 소프트웨어를 사용 하 여 각 단백질의 탐지 (LOD)의 계산 하 고 샘플에서 단백질 농도 결정.
   주: LOD cu 표준의 Y 절편으로 정의 됩니다.rve 3 번 3 개의 독립적인 분석의 표준 편차 증가.

결과

단일 및 이중 전송 방법에 대 한 분석 결과 절차는 그림 1에 표시 됩니다. 단일 전송, 분석 결과 슬라이드에 직접 택시를 발견 하 고는 dAbs 분석 결과 슬라이드 거울 패턴의 택시 (그림 1a)에서 사용 시에 전송 됩니다. 하나의 전송 절차는 필요, 하지만이 방법은 주로 슬라이드와 잉크젯 갠트리 (그림 2) 사이 ?...

토론

이 작품에서는, 우리는 기본적인 실험 설치 연구자 멀티플렉스 교차 reactivity 무료 immunoassays 널리 이용할 수 있게 하는 스냅 칩 기술을 제시 했습니다. 다른 기존 항 체 microarrays, 아니 microarray 정찰 병은 최종 사용자를 위해 필요 합니다. 단일 및 이중 전송 방법을 시연 하 고 이중 전송 월급 우수한 정렬 정확도 ~ 40 μ m 63 µ m¹⁴의 가장 큰 오차와 98%의 관광 명소에 대 한. 새로운 스냅...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline tablet	Fisher Scientific	5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
Bovine serum albumin	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer	SurModics, Inc	SG02
Nitrocellulose coated slides	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
Aminosilane coated slides	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Inkjet microarray spotter	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Slide module gasket	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Humidity Stabilization Beads	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software	Media Cybernetics	Version 4.5
Fluorescence microarray scanner	Agilent	SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody	R&D Systems	MAB10972
Endoglin protein	R&D Systems	1097-EN
Endoglin detection antibody	R&D Systems	BAF1097
IL-6a (see Table 1)	R&D Systems
IL-6b (see Table 1)	Invitrogen