포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

요약

이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.

초록

형광 현미경 검사 법 및 세포 생물학에서 발전은 밀접 하 게 연관는 향상 된 셀룰러 이벤트 자주 하는 방법에 대 한 우리의 이해에 극적인 도약 선도 시각화 하는 기능 세포 기능. 개발 및 슈퍼 해상도 현미경의 상당 하 게 확장 했다 광학 해상도의 한계 ~ 250-20에서 nm. 생물학은 colocalization 회절 제한 된 지역 내에서 분자 상호 작용을 설명 하는 제한 된 더 이상, 오히려 그것은 이제 개별 분자의 동적 상호 작용을 시각화 수 있습니다. 여기, 우리 바닥 상태 고갈 고정된 셀 이미징에 대 한 현미경 검사 법에 의해 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 두 개의 서로 다른 막 단백질, 바인딩과 그물 translocon, sec61β, 그리고 원형질 막 지역화 전압 개폐 L 유형 캘리포니아^{2 +} 채널 (Ca_V1.2)의 요소에서 예제를 제공합니다. 논의 특정 현미경 매개 변수, 고정 방법, 사진 스위칭 버퍼 정립, 그리고 함정 및 이미지 처리의 과제.

서문

셀룰러 신호 반응 번역 세포질 응답을 시작 하는 내부 및 외부 환경 변화. 그들은 인간의 생리, 호르몬 및 신경 전달 물질 방출, 심장 박동, 시각, 수정, 및 인지 기능에 대 한 기초로 제공의 모든 측면을 통제 한다. 이러한 신호 폭포의 병 태 생리 조건 암, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 등의 형태로 심각한 결과 가질 수 있습니다. 수십 년 동안, 생물학과 의학 조사자 이용 형광 단백질, 프로브, 바이오 센서는 형광 현미경 기본 도구로 결합 세포 이들의 정확한 공간과 일시적인 조직 이해 하 신호입니다.

Epifluorescence, confocal, 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등의 광학 기술의 힘은 그들의 감도, 속도, 및 라이브 셀 이미징, 주요 한계는 호환 그들의 회절 제한 된 해상도, 의미 구조 또는 200-250 nm 보다 작은 단백질 복합물은 확인할 수 없습니다. 결정적 슈퍼 해상도의 이론적이 고 실용적인 개발 (예를 들면, 자극된 방출 소모 현미경 (호텔 위치¹), 구조화 조명 현미경 (SIM²) 또는 확률론 슈퍼 해상도 (예: , photoactivated 지역화 현미경 (팜³), 또는 바닥 상태 고갈 (GSD^4,5)), 측면 및 축 해상도 형광 현미경 검사 법의 순서를 회절 방 벽을 넘어 확장 되었습니다 나노미터의 수 만입니다. 따라서, 조사자는 지금 시각화 하 고 단백질 역학과 조직 근처 분자 수준에서 기능을 변환 하는 방법을 이해 탁월한 기능이 있다.

바닥 상태 고갈 현미경 개별 분자 반환 뒤 (GSDIM), 또는 단순히 GSD로 알려져 있다 circumvents 회절 제한 fluorophores^4,5를 동시에 방출의 수를 줄임으로써. 높은 에너지 레이저 빛 fluorophore 분류 샘플, 광자와 전자를 폭격 하 고 확률 그들은 ' 스핀 플립 '을 받게 되며⁴상태 삼중 항 또는 ' 어두운 상태 '를 입력 증가 자극 하는 데 사용 됩니다. 이 효과적으로 접지 상태를 고갈 시킨다, 그러므로 이름 '그라운드 상태 고갈'. Triplet 상태에 fluorophores 광자를 방출 하지 않는 하 고 샘플 주차 나타납니다. 그러나, 이러한 fluorophores 확률론 바닥 상태를 반환 하 고 triplet 상태에 반환 하기 전에 접지 흥분 상태 전환을 방출 하는 여러 광자를 통해 갈 수 있다. 적은 fluorophores 방출 어떤 주어진된 시간에, 함께 포 톤 버스트 fluorophores 이웃 공간 및 일시적으로 구분 되는 개별 fluorophores에서 방출. 광자의 버스트 가우스 기능, 렌즈, 사용 하는 빛의 파장의 수 가늠 구멍 (NA)에 종속 되는 지역화 정밀 fluorophore의 위치에 해당 하는 계산된 중심으로 들어갈 수 있는 여기 고 결정적인, fluorophore 당 방출 된 광자의 수. GSD에의 한 제한, fluorophores의 하위 집합만 적극적으로 언제 든 지 방출, 이후 이미지 수천을 수집 해야 합니다 완전 한 현지화 지도를 만들려고 몇 분 동안 이다. 높은 레이저 전원 요구와 함께 긴 수집 시간 GSD 라이브 샘플 보다 고정에 적합 한 더 나은 의미 합니다.

이 문서에서는 설명 합니다 막 및 바인딩과 그물 (ER)의 슈퍼 해상도 현미경 이미징에 대 한 고정된 샘플의 준비-상주 단백질 (필요한 소모품 및 시 약 참조 테이블의 재료의 목록)에 대 한. 어떻게이 프로토콜 쉽게 계량 크기와 L 유형 전압-문이 캘리포니아^{2 +} 채널 (Ca_v1.2) 심장 myocytes의 sarcolemma에서의 클러스터링의 정도에 적응 하거나 수는 응급실의 세포 분포를 시각화 하는 데 사용의 예 시연 됩니다. 개시, 번역, 그리고 궁극적으로 많은 캘리포니아^{2 +}의 기능 이해에 매우 중요 하다는 유통 및 이러한 세포 구성 성분의 이해-종속 신호 폭포. 예를 들어 Ca_v1.2 채널은 흥분 수축 연결, 수용 체-중재 Ca^{2 +} 출시는 응급실에서 아마도 포유류 세포에서 가장 유비 쿼터 스 신호 폭포는 근본적으로 중요 합니다.

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프로토콜

1. 세척 유리 Coverslips

1. 샘플 처리 하기 전에 하루 1 시간에 대 한 코의 1 M 솔루션에서 sonicating 여 #1.5 유리 coverslips를 청소. 이것은 coverslips에 있을 수 있는 어떤 형광 오염 물질을 제거 합니다.
   1. 드 이온된 수와 coverslips에서 코를 철저 하 게 린스.
   2. 일단 코에 청소, 70% 에탄올 사용 하 여 준비까지 있는 coverslips 저장.

2. 코팅 유리 Coverslips

참고:이 섹션의 단계는 오염을 방지 하기 위해 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.

1. 집게를 사용 하 여 개별 coverslip 70% 에탄올 솔루션에서 제거 하 고 신속 하 게 과잉을 제거 하는 화 염. 장소 6 잘 플레이트에 coverslips. 없으면 문화 후드에 불타는 옵션, 고려 압력가 마로 소독은 coverslips 드 이온된 수 또는 적어도 30 분에 대 한 문화 후드에 자외선에서 살 균 세 정 후
2. 세포의 접착을 투입, 살 균 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온에서 1 h와 coverslips 코트.
3. 폴 리-L-리 신을 발음 하 고 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)와 coverslips를 헹 굴. 건조 한 공기 및 냉장고에서 밤새 껏 두기.
4. 다음날 아침 냉장고에서 있는 coverslips를 제거 하 고 실 온에서 30 분 이상 50 µ g/mL의 농도에서 laminin의 300 µ L을 추가. laminin는 coverslip에 직접 배치 신중 하 게.
   참고:이 laminin 단계 HEK293 세포 또는 COS-7 셀에 대 한 필요 하지 않습니다 하지만 격리 된 심 실 myocytes 필요. 다른 1 차 셀 혈관 평활 근 세포 또는 뉴런을 준수 수 있습니다와 같은 더 나은 콜라겐 또는 fibronectin 코팅 coverslips.

3. 셀의 준비

1. 경작된 한 세포
   1. 성장 COS-7 셀 (또는 선호 셀 라인) 10 mL Dulbecco에서에서 10 cm 문화 접시에 ' s 수정 이글스 매체 (DMEM) 문화 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보완 페니실린/스 (PS) 솔루션입니다. 37 ° C, 5% CO ₂ 셀 문화 인큐베이터에서 셀 성장.
   2. 셀 도달 90% confluency DMEM 미디어를 발음 하 고 0.05% trypsin EGTA 솔루션의 5 mL을 추가 하 여 10 cm 접시에서 그들을 수확. 일단 셀 모아 분리를 시작, 즉시 보충된 DMEM과 트립 신을 무력화. 접시에서 셀을 제거 하려면
      1. 사용 5 mL 혈 청 학적인 피 펫. 남아 있는 모든 셀을 제거 하려면 여러 번 접시의 베이스에 대 한 매체를 플라스틱 부착 homogenously 문화 매체를 통해 세포를 배포 하 고.
   3. 세포 transfection에 대 한 70 %confluency 달성 하기 위해 35mm 문화 요리에 접시. 접시에 매체의 볼륨을 확인까지 2 mL 신선한 DMEM/FBS/PS 솔루션.
   4. 원하는 플라스 미드 DNA와 transfect COS-7 셀 구조 (예를들면, 플라스 미드 sec61β-mCherry), 적절 한 transfection 시 약을 사용 하 고 제조 업체에 따라 ' s 지침.
      참고: 플라스 미드 또는 transfection 시 약 사용에 따라 표현 하는 단백질에 대 한 24-48 시간 걸릴 수 있습니다.
2. 성인 마우스 심 실 myocytes
   1. 성인 마우스 심 실 myocytes 확고 Langendorff 관류 방법 ⁶을 사용 하 여 분리. 다시 중간 199 (M199) ps. 2.5 %FBS 1% 보충에 myocytes의 결과 펠 릿을 중단

4. 셀을 도금

1. 페 COS-7 셀
   1. 2 mL DMEM/FBS/PS 솔루션에서 35mm 요리 발음 및 캘리포니아 ^{2 +} 1 mL를 추가-무료 PBS. 접시 2 분에 대 한 보육을 수확 셀에서에서 반환 접시 첫 발음 Ca ^{2 +} 여-무료 PBS와 다음 0.05% trypsin EGTA 솔루션의 1 mL을 추가.
      한 번
      1. 셀 모아 및 분리, 즉시 보충된 DMEM 1 mL와 트립 신을 무력화 하기 시작 합니다. 부드럽게 transfected 세포는 2 mL의 트립 신 EGTA DMEM 서 스 펜 션 전체에 고르게 분포 되도록 여러 번 위아래 플라스틱.
   2. 접시 페 폴 리-L-리 신 코팅된 coverslips는 적절 한 밀도 COS-7 셀을 단일 셀 구상 될 수 있다, 접시 볼륨을 작성 DMEM/FBS/PS와 함께 최대 2 mL (예를 들어는 coverslip 90 µ L 셀 서 스 펜 션 추가 1910 µ L 보충 DMEM 추가, 접시를 균등 하 게 세포 소용돌이).
      참고: 셀 계산에 필요 하지 않지만 각 접시에 추가 될 셀의 셀의 confluency에 따라 달라 집니다.
   3. 반환 도금 셀 문화 인큐베이터 하룻밤 준수 및 복구를 셀 수 있도록 셀.
2. 성인 마우스 심 실 myocytes
   1. 개별 셀을 시각화 수 있도록 적절 한 밀도에 코팅 된 coverslips에 직접 laminin 및 플레이트 myocytes를 발음. 이 격리에서 얻은 실행 가능한 세포의 밀도에 따라 달라 집니다.
   2. Coverslip 그리고 접착을 허용 하도록 ~ 45 분에 대 한 37 ° C, 5% CO ₂ 셀 문화 인큐베이터에서 장소에 돔에 세포 현 탁 액을 균형.

5. 셀의 고정

1. 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 신중 하 게 매체를 발음.
   1. PBS 한번 부착 셀 린스.
   2. 개별 응용 프로그램 및 항 체에 최적화 된 고정 제와 수정 셀.
      참고:는 정착 액을 선택할 때 염두에 두어야 하는 중요 한 기준 또한 관심의 항 원에 구조적 변화는 하면서 샘플의 세포질 구조의 보존 이다. 3 %paraformaldehyde/0.1% (PFA/조지아)와 프로토콜 고정이 고 100% 정착의 목적을 위해 메탄올 설명.
2. Transfected COS-7의 PFA/조지아 고정 세포를 표현 하는 Sec61β-mCherry
   1. 혼합 1.9 mL 16 %PFA 20 µ L 50%가 추가 10 mL의 최종 볼륨을 만들기 위해 PBS.
   2. 추가 1 mL는 갓 실 온에서 10 분에 대 한 세포와 수정 각 접시 PFA/조지아 솔루션을 준비.
   3. PFA/조지아와 린스 셀 3 회 PBS 발음.
   4. 씻어 5 시간 5 분 대 한 PBS, 준수 셀. 적당 한 속도 (예를 들어, 분 당 사이클 50)으로 설정 하는 회전에 모든 세척 단계를 수행 하십시오.
   5. 다음, 갓 드 온수에 0.1% 질량/볼륨 나트륨 borohydride 준비 1 mL와 함께 무료 알데하이드 그룹을 줄일.
   6. 린스 세포 3 번 5 분 각 나트륨 borohydride와 알코올 무료 알 데히드와 반응 하는 때 생산의 모든 흔적을 제거 하는 PBS에 대 한 두 번 다음 세척.
3. 성인 마우스 심 실 myocytes의 메탄올 고정
   1. 신중 하 게 셀에 얼음 처럼 차가운 100% 메탄올의 1 mL을 추가. 6 잘 플레이트 기울기와 사이드 벽 보다는 coverslip에 직접 메탄올 플라스틱. 다음 균등 하 게 씻어 메탄올 수 있도록 수평을 다시 6 잘 플레이트를 기울기 이상의 셀. -20 ° c.에 5 분에 대 한 수정
   2. 정착 액과 린스 셀 3 회 PBS 발음.
   3. PBS, 5 번 5 분 각는 회전에 대 한 준수 셀 세척.

6. 비 특정 바인딩 차단

1. 블록 차단 솔루션에 실 온에서 1 h (재료의 표 참조).
   참고: 다양 한 솔루션은 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 비 면역 혈 청 1 차 항 체로 동일한 종에서를 포함 하 여 일반적인 항 체 바인딩 차단 하 사용할 수 있습니다.

7. 탐지

1. 1 차적인 항 체 외피
   1. Aspirate 차단 솔루션. 세척 하지 또는 린스.
   2. 준비 다음과 같이 (단계 7.1.5 참조) 주요 항 체 솔루션: 10 µ g/mL의 농도를 1 차적인 항 체 희석 (또는 제조 업체 ' s 제안 농도) 항 체 외피 솔루션에서 (재료의 테이블 참조 ). coverslip에이 작은 볼륨 밸런스 하 고 신중 하 게 위에 플라스틱 파라핀 영화의 사각형을 설정 합니다. 이 coverslip 통해 항 체의 작은 볼륨을 확산 하는 데 도움이 하 고 증발 방지.
   3. 습도 챔버에 6-잘 접시를 놓고 냉장고에서 밤새 품 어.
   4. 아침에는 습기에서 셀을 제거, 신중 하 게 평방 파라핀 영화는 coverslip의 표면에서 제거 하 고 기본 항 체 솔루션 발음.
   5. 린스 3 회 PBS, 다음 씻어 5 시간 5 분 동안 세척 블록 솔루션 (재료의 표 참조)는 회전에.
      참고:이 프로토콜 사용 하 여 다음 항 체, 이미지에 대 한 안티-RFP 마우스 단일 클론 항 체 그림 2에 표시 되 고 polyclonal FP1 ⁷ 안티-Ca _V 1.2 토끼 항 체 (교수에서 선물. 요하네스 지옥, UC 데이비스) 그림 3에 표시 된 이미지에 대 한. 습도 챔버에 관해서는 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 도시락 줄지어 젖은 종이 수건 작품. 그러나이 프로토콜 라벨 특이성을 향상 하 고 세척 단계에 대 한 희석된 차단 솔루션을 사용 하 여 배경 감소 단계, 세척에 대 한 PBS를 사용할 수 있습니다.
2. 이차 항 체 외피
   1. 세척 솔루션을 발음 하 고 200 µ L 활용 된 이차 항 체 희석 솔루션 1:1,000 항 체 외피 솔루션에 추가. 장소는 coverslip 위에 파라핀 영화의 광장 (7.1.2 단계 참조).
   2. 어둠 속에서 실 온에서 1 h 품.
   3. Aspirate 이차 항 체와 PBS로 3 회 린스.
   4. 로커에 5 분에 대 한 5 배 희석 차단 솔루션 셀 세척.
   5. 세척 PBS 가진 5 분 동안 3 번.
      참고:이 프로토콜 각각 그림 2 및 그림 3, 반대로 마우스 알 렉 사 647 활용된 2 차 항 체와 반대로 토끼 알 렉 사 647 활용 된 이차 항 체의 사용 설명. 단일 단백질 라벨에 대 한 알 렉 사 647입니다 때문에 그것의 높은 광자 수 (지역화 정밀도 향상) 및 낮은 듀티 사이클 (임시 해상도 향상) 선호 fluorophore ⁸. 거 또는 Cy-염료, 같은 많은 다른 fluorophore 활용 된 이차 항 체 옵션 사용할 수 있습니다. 뎀시 그 외 참조 ⁸, Chozinski 외. ⁹ 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 여러 fluorophores/염료의 적합성의 포괄적인 평가.

8. -고정 (선택 사항)

1. 희석 50 µ L 50%가 10 ml PBS 0.25%가 솔루션을 얻을. 후 실 온에서이 솔루션의 10 분에 대 한 셀을 수정.
2. 는 회전자에 5 분 동안 3 회 PBS로 세척.

9. 샘플의 스토리지

1. 냉장고 (4 ° C)에 샘플 영상까지 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일 줄지어 컨테이너에 저장.
2. (몇 개월)까지 샘플의 장기 저장용, 세균성 성장을 방지 하기 위해 3 m m 나트륨 아 지 드를 포함 하는 PBS에 저장.

10. GSD 슈퍼 해상도 이미징 Photoswitching 버퍼 준비

1. 산소 청소 준비 ' GLOX ' 다음과 같이 솔루션:
   1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 12.5 µ L catalase (주식 34 mg/mL), 3.5 mg 추가 포도 당 산화 효소, 및 0.5 µ 1 M l 트리 스 (pH = 8) 49.5 µ L PBS에.
   2. 솔루션으로 구성 요소를 분해 후 4 시 3 분 20,800 x g에서 원심을 짧게 소용돌이 ° c.
      참고: GLOX, 산소 청소 솔루션 photobleaching를 발견 되었습니다. GLOX 최대 1 주 동안 냉장고에서 유지 한다. 반복 분리기 단계 때마다 사용 됩니다.
2. 다음과 같이 준비 photoswitching 유도 thiol 솔루션:
   1. PBS에서 100 m m β-mercaptoethylamine (MEA) 솔루션을 준비 하 고 pH 8 또는 양자 택일로 사용 하 여 β-mercaptoethanol (βME)에 pH를 수정. 1 주까지 동안 냉장고 (-20 ° C)에서 aliquoted MEA 솔루션 저장.
3. 이미징, 직전 얼음에 최종 스위칭 버퍼는 thiol 추가 하 여 준비 및 산소 청소 구성 요소를 함께. 500 µ L에 대 한 GLOX-MEA, 50 µ L MEA에 5 µ L GLOX를 추가 (pH = 8)과 445 µ L 염 분 버퍼 (2.5 mL 1 M Tris pH = 8, 29.22 mg NaCl (10mm 최종 농도), 5 g 포도 당 및 47.5 물). 또는, GLOX-βME 솔루션 5 µ L GLOX 5 µ L βME, 490 µ L 염 분 버퍼에 추가.
   1. 얼음에 솔루션을 유지 하 고 필요에 따라를 사용 하 여 유리 우울증 슬라이드에 샘플을 탑재.
      참고: βME 또는 MEA Thiol 포함 솔루션 photoswitching 알 렉 사 647 ¹⁰ 등 cyanine 기반 염료 또는 알 렉 사 568 같은 xanthene 기반 염료의 유도. MEA는 알 렉 사 568 또는 때 2 단백질 알 렉 사 568 및 647 이중 라벨 방식으로 이미지를 위한 선호 하는 반면 βME 알 렉 사 647와 더 나은 결과 생성 합니다. 버퍼의 산성화 때문에 시간 동안 저하 됩니다. 이 샘플의 평균 광자 수에 있는 감소를 이어질 것입니다. 이 방지 하려면 그것은 후 2-3 h 또는 평균 광자 수에 드롭 또는 유도 photoswitching로 이동 하는 시간의 주목할 만한 확장 관찰은 신선한 photoswitching 버퍼를 확인 하는 것이 좋습니다. 최근 기사 설명 우리는 아직 테스트 하지는 하지만 보도 전시 안정적인 산도 몇 일 동안 레벨 그리고 GLOX 멀티 컬러 이미징 응용 프로그램 ¹¹ 보다 더 뛰어난 새로운 이미징 버퍼 황소 EA.

11. 샘플 장착

1. 우울증에 (섹션 1-9 참조) 레이블이 셀 마운트 coverslips 슬라이드, 100 µ L를 사용 하 여 이미지 버퍼.
2. 인감 이미지 버퍼의 급속 한 산화를 방지 하기 위해 실리콘 접착제 coverslip의 가장자리. 잠깐 몇 분까지 실리콘 접착제는 완전히 완 치 달리는 coverslip 이미징 때 드리프트 것.
   참고: 실리콘 접착제 βME의 접촉으로 오는 경우 강하게 하지 것입니다. 실리콘 접착제 이미징 버퍼를 접촉 하지 않도록 coverslip의 가장자리를 건조 해야.

12. 이미지 수집

1. 이미징 그림 2 및 그림 3에 사용 된 매개 변수 목록에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
2. Fluorophore 선택에 따라 샘플을 밝히는 적절 한 레이저를 선택 하려면
   . 이 프로토콜에 사용 된 SR-GSD 시스템은 고 출력 레이저를 갖추고 (488 nm, 1.4 KW/cm ², 532 nm, 2.1 KW/cm ², 561 nm, 2.1 KW/cm ² 642 nm, 2.1 KW/cm ²). 642 nm 레이저를 사용 하는 그림 2.
3. 높은 구나.는 기름 침수 렌즈 사용 여기에서 사용 하는 SR-GSD 시스템은 HC PL APO 160 X 갖추고 / 1.43 나 목표.
4. 적절 한 dichroic 이미징 큐브를 선택 했다. 이 프로토콜에서 SR-GSD 시스템은 488 HP-T, 갖추고 532 HP-T, T-568 HP, 642 HP-T 505-605 nm, 550-650 nm와 660-760 nm의 방출 밴드 패스 필터.
5. 2D 수집 모드를 선택합니다. 프레임 전송 모드와 노출 시간을 10 밀리초 (100 Hz)에 카메라를 설정 합니다. 300을 EM 이득을 설정 합니다. 검색 임계값을 선택 합니다.
   참고: 낮은 임계값 높은 배경 이미지를 생산. 높은 임계값 관심의 신호 필터링 수 있습니다. 비 페 셀 또는 셀만 이차 항 체와 incubated의 coverslips 이미징 등 부정적인 컨트롤에 따라 임계값을 결정.
6. 자동 이벤트 제어 및 설정된 이벤트 8 이미지 당.
7. GSD 수집 탭에서 픽셀 크기를 입력 (10 시작 또는 20 nm 픽셀 크기). 있도록 " 히스토그램 모드 " 이미지 수집 하기 전에 고해상도 이미지 계산 옵션에서 GSD 도구 탭에서 선택.
8. 원형질 막에서 단백질 이미지 TIRF 모드를 선택 하 고 침투 깊이 확인 하기 위해 발생 각도 수정.
9. (펌핑 라는) 어두운 상태로 전자 전송, 레이저 강도 100%로 설정.
10. 펌핑 하는 동안 단일 분자 검출을 선택 하 고 자동으로 때 프레임 상관 관계는 0.20 얻으려고 설정.
11. 수집, 50%로 레이저 강도 설정.
12. 60000 수집 프레임 수를 설정.
    참고: 탐정 샘플에서는 프레임 이것 보다 더 찾을 수 있습니다. 더 이벤트 감지 때 fluorophore photobleaching와 수집의 관측에 따라 프레임 수를 수정.
13. 시작 수집.
    참고: 수집의 시작 부분에 모든 염료 분자 형광 상태에 있으며 다음 어두운 상태로 전환. 프레임 상관 관계에는 0.20에 도달 하면, 이미지 획득 시작 됩니다. 프레임 당 미만 8 이벤트를 탐지할 때 405 레이저는 바닥 상태에 어두운 상태에서 전환 fluorophores 격려에, 전환 됩니다. N의 데이터 집합에 대 한 이미지를 취득 하는 경우 = n에서 셀 x TIRF 침투 깊이, 검출 임계값 및 프레임 인수 수가 일정 유지 한다와 같은 y 동물, 매개 변수를 =.

13. 분석 이미지

1. 단백질 클러스터 크기 척도를 사용 하 여는 ' 입자 분석 ' ImageJ의 기능.
   참고: 추가 분석 수행할 수 있습니다 확률론 광학 재건 상대 지역화 현미경 기반 분석 (스톰-RLA) 또는 유사한 ¹³를 사용 하 여.
   1. 클러스터 분석 ( 그림 3) ImageJ를 사용 하 여 다음과 같이 수행:
   2. 분석 이미지 파일을 엽니다. (섹션 12) 위에서 설명한 이미징 소프트웨어에 생성이 10 nm 히스토그램 단일 분자 지역화 지도 해야한다.
   3. 이미지를 시각화에 명암과 밝기 조정: 이미지 메뉴 선택에서 클릭을 다음 밝기 및 대비 조정. 자동 옵션을 클릭 합니다.
   4. 8 비트 이미지 형식을 변경: 이미지 메뉴를 선택 하 고 다음 유형을 선택 하 고 8 비트 선택 하십시오.
   5. 이미지의 축척 설정: 분석 메뉴를 열고 설정된 규모를 클릭 하 고 다음 매개 변수를 입력: 거리 = 1, 알려진 거리 = 10, 1 픽셀 = 10 nm.
   6. 얻을 수 측정을 선택 하려면 분석 메뉴를 열고 설정된 측정, 선택한 영역 옵션 옆에 확인란을.
   7. 는 이미지의 임계값을 조정합니다. 오픈 이미지 메뉴, 선택 조정, 선택한 다음 임계값 보다 높거나 선택 합니다. 255, 최대 값을 이동 하 고 1을 클릭 하 여 최소값 적용 이동.
   8. 입자를 분석 하려면 분석 메뉴를 열고, 분석 입자를 선택. 픽셀 단위를 선택 하 고, 결과 표시 하 고 요약 하 여를 배치 합니다. 4-무한대 크기 설정 (해상도 이기 때문에 ~ 20 nm), 맨 손으로 윤곽선 옵션을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다. 평균 클러스터 크기와 이미지에 클러스터의 수와 같은 분석 정보를 포함 하는 요약 파일을 만들 수 것입니다.
      참고: 주의 해야 행사 때 지역화 된 점의 수로 특정 클러스터 내에서 단백질의 수에 대 한 결론을 만드는 선형 상관 하지 수 단백질의. GSD localizes 염료 항 체를 활용 하 여 피토 프에서 형광 라벨을 배 수량 링크 오류 > 10 nm 어떤 방향으로. 또한, polyclonal 항 체를 사용 하는 경우 하나 이상의 항 체는 하나의 항 원에 바인딩할 수 있습니다와 혼동 문제 더욱, 상업 2 차 항 체 평균, 3-6 한 fluorophore 항상 동일 하지 않습니다 그래서 염료의 분자에, 활용은 한 단백질입니다. 1 차적인 항 체 (이차 제거)에 직접 염료를 변화 하거나 nanobody 기반 라벨링 제도 ¹⁴를 사용 하 여 연결 오류를 줄일 수 있습니다.

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결과

소개에 명시 된 여러 다른 슈퍼 해상도 현미경 이미징 형식 있습니다. 이 프로토콜은 GSD 슈퍼 해상도 영상에 집중 한다. 대표 이미지와 지역화 지도 그림 2 및 그림 3에 나와 있습니다.

그림 2 와 ER 단백질, mCherry-Sec61β, 위에서 설명한 메서드를 사용 하 여 처리 ?...

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토론

회절 한계를 넘어 이미지를 허용 하는 기술의 최근 폭발 공간과 시간에서 신호 하는 포유류 세포의 복잡성에 새로운 윈도우를 제공 했다. 이러한 기술에는 폭풍, 호텔 위치, 팜, GSD, 시뮬레이션, 및 그들의 이체 (예를 들어, dSTORM, FPALM) 포함 됩니다. 이러한 기술 뒤에 과학자의 독창성 빛의 회절을 경 세 하는 물리학의 법칙에 의해 부과 된 한계를 우회 하 것을 허용 했다. 이 거 대 한 성취에도...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOH	Thermo Scientific	P250-500	To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mm	Marienfeld Superior	0107032)	To grow/process/image cells
10x PBS	Thermo Scientific	BP3994	Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-Lysine	Sigma	P4832	Aids with cell adhesion to cover glass
laminin	Sigma	114956-81-9	Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199	Thermo Scientific	11150-059	Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995	Gibco	11995	Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific	10437028	Media supplement
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333	Media supplement
0.05% trypsin-EDTA	Corning	25-052-CL	Cell culture solution
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transient transfection reagent
Ca2+-free PBS	Gibco	1419-144	Cell culture
100 % Methanol	Thermo Fisher Scientific	A414-4	Cell Fixation
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell Fixation
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	SLBR6504V	Cell Fixation
SEAblock	Thermo Scientific	37527	BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100	Sigma	T8787	Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)	Gift	N/A	Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFP	Rockland Inc.	200-301-379	Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A31573	Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A11031	Secondary antibody
Sodium azide	Sigma	S2002	Prevents microbial growth for long term storage of samples
Catalase	Sigma	C40	Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Photoswitching buffer ingredient
Tris	Sigma	T6066	Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride	Fisher	BP2664100	Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanol	Sigma	63689	Photoswitching buffer ingredient
NaCl	Fisher	S271-3	Photoswitching buffer ingredient
Dextrose	Fisher	D14-212	Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slides	Neolab	1 – 6293	To mount samples
Twinsil	Picodent	13001000	To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmid	Addgene	49155
Leica SR GSD 3D microscope	Leica
ImageJ
Washing block solution			20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution			0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution			1:1000 in PBS