레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

요약

Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.

초록

매혹적인 차이 teleost 및 포유류 망막 신생 및 심각한 손상 후 재생 teleost 망막의 평생 가능성은. Zebrafish에 재생 경로 조사 포유류에서 망막 퇴행 성 질환의 치료를 위한 혁신적인 전략을 개발 하는 새로운 통찰력을가지고 있습니다. 여기, 우리는 532 nm 다이오드 레이저에 의하여 성인 zebrafish에 외부 망막에 초점 병 변의 유도에 집중 했다. 지역화 된 부상 망막 변성 및 손상의 지역에서 직접 재생 하는 동안 자리를 차지할 생물 학적 프로세스를 조사 하 고 있습니다. 비-침략 적 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여, 우리는 손상 된 지역 및 모니터 후속 중생의 위치를 정의 하 수 있었다 vivo에서. 실제로, 10 월 영상만 사용할 수 있었던 이전 조직학 분석 정보를 제공 하는 제 브라 망막의 고해상도, 단면 이미지를 생성 합니다. 조직학 단면도 수행한 실시간 10 월에서 데이터를 확인, 그리고 망막 상해의 유도 후 재생 응답 immunohistochemistry에 의해 조사 되었다.

서문

비전 아마 인간의 가장 필수적인 의미 이며 그 장애는 높은 사회 경제 충격. 공업화 한 세계에서 망막 퇴행 성 질병 시력 손실과 실명 성인 인구¹중의 대다수를 위한 계정. 망막 화 (RP)에 영향을 미치는 약 1.5 백만 사람들 전세계^2,360와 20의 나가 사이 사람들에서 실명의 가장 일반적인 상속 된 원인입니다. 그것은 상속 된 망막 장애 망막 안료 상피 하 고, 그 후, gliosis의 변성 및 내부 신경⁴개조 (PRs) 대뇌의 진보적인 손실에 의해 특징의 다른 유형의 가족. 질병의 과정 봉, 희미 한 빛에 콘, 컬러 비전 및 시력⁵에 필수적인 색 비전에 대 한 책임은 일반적으로 시작 하는 두 홍보 세포 유형에의 증분 손실에 의해 설명 될 수 있다. 단일 유전자 결함은 RP를 일으킬 충분 합니다. 지금까지 45 유전자에서 130 개 이상의 돌연변이 질병⁶와 연결 되었습니다. 이 다양 한 질병 고기 리드 이며 유전자 치료는 비 일반화할 이유 중 하나 이렇게 복잡 한 치료 접근. 그러므로, 망막 유년에 눈부신 질병 치료에 새로운 일반적인 치료 접근을 개발 하는 긴급 한 필요가 있다.

종종 망막 변성 관련 홍보 손실; 따라서, 홍보 세포 죽음은 망막⁷에 퇴행 성 프로세스의 특징 이다. 그것은 이미 홍보 세포 죽음 뮐러 명과 셀 (MC) 활성화와 확산⁸자극 입증 되었습니다. MCs, 척 추가 있는 망막에 주요한 glial 세포 유형 망막 신경 세포 사이 아무것도 "접착제" 보다는 더 많은 것 한 번 고려 되었다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구 MCs 단순한 구조 보다는 더 많은 지원⁹행동 나타났습니다. 다른 기능 중 MCs 성체에도 참여 하 고¹⁰을 복구 합니다. 실제로, 악화 망막에서 diffusible 요소에 대응, MCs 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 식 크게 증가. 그러므로, GFAP 라벨로 망막 상해 및 변성¹¹응답 보조 MC 활성화에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다.

최근, 우리 개발 zebrafish (Danio rerio) 망막 변성을 유도 하는 레이저를 사용 하 여 초점 상해의 소설을 각 색을 했다. 초점 부상 부상된 사이트에 셀의 이동 및 망막 재생¹²중 사건의 정확한 타이밍 등 특정 생물 학적 과정을 공부에 대 한 유리 하다. 또한,는 zebrafish가 되고있다 시각적 연구에 중요 한 다른 척추 동물의 시각적 시스템 사이의 유사성 때문에. 인간과 teleost retinae의 심한 형태학 및 조직학 특징 몇 가지 차이점을 표시합니다. 따라서, 인간과 zebrafish retinae 망막 프로젝션 뉴런, 신경 절 세포 안쪽에 거주 하는 동안 빛 감지 대뇌 바깥쪽 레이어를 차지 같은 계층된 패턴에 같은 주요 셀 클래스 포함 신경 층, 렌즈에 인접입니다. 망막 수, amacrine, 바이 폴라, 및 가로 셀, 포토 리셉터와 신경 절 세포 층¹³사이 지역화합니다. 또한, zebrafish 망막은 콘 지배 하 고 따라서 보다, 예를 들어 집중적으로 공부 쥐 망막 인간의 망막에 더 가까이. 매혹적인 차이 teleost 및 포유류 물고기 망막과 망막 재생 손상 후에 지속적인 성체입니다. Zebrafish, MCs dedifferentiate를 중재 부상된 망막^14,15에서 재생 됩니다. 닭, MCs는 또한 세포 주기를 다시 입력 하 고 dedifferentiate 일부 용량을가지고. 성인 물고기에 망막 상해 다음 MCs는 새로운 신경¹⁶생산을 손상 된 망막 조직을 마이그레이션할 조상 및 줄기 세포의 특정 특성을 채택. 진 식 포유류 MCs의 프로 파일링 망막 창시자, 예기치 않은 유사점 그리고 닭고기, 설치류, 심지어 인간의 망막에 MCs의 본질적인 neurogenic 잠재력에 대 한 증거는¹⁷성장 하 고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 왜 재생 응답 조류와 포유류에 낮은 물고기에 강력한 응답 비교는 아직 이해 되지. 따라서, zebrafish에 내 생 수리 메커니즘을 이해 포유류와 인간 자극 망막 중생에 대 한 전략을 제안할 수 있습니다. 망막 변성 환자 치료를 위한 치료 도구로 MCs의 내 생 수리 메커니즘을 채용 우리 사회에 대 한 뛰어난 영향을 미칠 것 이다.

여기, 우리 안과 연구에서 변성/재생 모델을 고용 하는 데 필요한 단계를 제공 합니다. 우리는 먼저 부상 사이트, 그리고 인접 한 MCs의 마지막으로 머릿속 참여 개발 이벤트의 이미징에 다음 neurosensory 망막에서 초점 손상을 유도에 집중 했다. 일반적인 프로토콜 비교적 쉽게 수행 하 고 다양 한 망막을 나중에 평가 대 한 가능성을 엽니다.

프로토콜

모든 실험 성명 안과 및 안과 (ARVO)에 비전 연구를 위한 협회의 비전 연구에서 동물 사용에 대 한 준수 하 고 존중 하는 정부 기관의 관련된 규정.

1. 동물

1. 유지 TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) 스트레인 26.5 ° C의 온도와 물 표준 조건 하에서 6-9 개월 ~ 14/10 h 명암 주기 ¹⁸ 세.
2. 정부 당국에 의해 승인 후 동물 실험에 대 한 관련 기관의 동물 보호 지침을 따릅니다.

2. 가역 전신 마 취

1. 준비 물 탱크 그리고 트리 스의 1 M의 2.1 mL 97.9 ml tricaine 분말의 400 밀리 그램을 용 해 하 여 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금 (tricaine)의 재고 솔루션 버퍼링 식 염 수 (TBS). 어둠 한 달에에서 4 ° C에서 1 M Tris (pH 9)와 저장소 pH 7.0 조정.
   참고: Tricaine는 동물의 자연 생활 상태 처럼 물에 준비 되어야 한다, 원래 탱크 물 사용 하는 선호.
2. 재고 솔루션 1시 25분 탱크 물에 희석 하 고 즉시 사용.
3. 10 cm 배양 접시 그들이 움직이지 되 고 외부 자극 (약 2-5 분, 무게와 연령에 따라)에 응답 하지 않는 때까지 마 취 솔루션 50 mL를 포함 하는 제 브라 넣습니다.
4. 전송할 각 물고기 손으로 레이저 치료 ( 그림 1A)에 대 한 맞춤 실리콘 핀 홀더.
   주의! 물고기 탱크를 10 분만에 외부 마 취 남아 있을 수 있습니다.
5. 치료 및 이미징 후 마 취를, 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에서는 zebrafish 장소.
6. Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.

3. 망막에 초점 부상 레이저

참고: A 532 nm 다이오드 레이저는 zebrafish의 망막에 초점 빛 피해를 만드는 데 사용 됩니다. 레이저의 실험 설정 수 성인 제 브라에서 재현할 수 초점 망막 상해의 설립.

1. 레이저의 출력 설정: 70 mW; 공중 직경: 50 µ m; 펄스 기간: 100 양
   주의! 레이저 빛 사용 하려면 적절 한 개인 보호와 지역의 라벨.
2. 치료 전에 눈에 붙이기 2 %hydroxypropylmethylcellulose 1-2 방울을 적용 하 고 2.0 m m 저 레이저 렌즈를 사용 하 여 초점을 망막에 레이저를 목표로 빔.
   주의! hydroxypropylmethylcellulose 방울 점성 있고 아가미에가 경우 호흡에 문제를 일으킬 수 있습니다.
3. 왼쪽에 시 신경 주위 장소 4 레이저 명소 눈과 눈을 오른쪽, 치료를 사용 하 여 내부 통제로.

4. Vivo에서 망막 형태학의 이미징

1. 마 취에서 그들 되살리는 없이 시각화 zebrafish 망막 레이저 유도 후에 직접적으로 0 일에. 전신 마 취를 사용 하는 전혀 다른 시간 포인트 (섹션 2 참조: 가역 전신 마 취). 맞춤 실리콘 핀 홀더 ( 그림 1 B, B.1)에 고정된 zebrafish 장소.
2. 최적의 이미지를 잘라 zebrafish 눈에 맞게 상용 하이드로 겔 콘택트 렌즈 (Ø 5.2 m m, r = 2.70 m m, 중심 두께 = = 0.4 m m) 구멍 펀치를 사용 하 여. 스 렌즈의 오목한 표면 작성 및 각 막 위에 놓습니다.
3. 78 D 비 접촉 슬릿 램프 렌즈 OCT 시스템을 장비.
4. 집중은 IR 적외선 (IR) 이미지 + 10 월 모드 ( 그림 2A)는 적외선을 눈의 저 시각화를 클릭 하 여 그림에서 " 취득 " 버튼 ( 그림 2B) 지역화 하는 레이저 시스템을 사용 하 여 망막에 반점 ' s 소프트웨어.
5. 시각화 IR + 10 월 망막 층의 3 차원 섹션 모드를 클릭 하 여 사진의 찍을 하 고는 " 취득 " 버튼 ( 그림 2B). 외부 핵 층 (ONL)에서 상해의 심각도 관찰 (섹션 3 참조: 레이저 망막에 초점 부상) 이러한 이미지.
6. 치료 및 이미징 zebrafish는 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에 배치 후 마 취를.
7. Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.
8. 망막 형태론의 비슷한 vivo에서 이미징을 수행 하는 하루에 1, 3, 7, 14 및 주 6.

5. 되며 & 오신 (H & E) 얼룩

1. zebrafish 감기 (4 ° C)에 침수에 의해 안락사 마 취 솔루션 enucleate 및 적어도 10 분 동안 얼음에 눈 즉시으로 의미의 작은 곡선된 겸 자.
2. 20 h 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 전체 눈을 해결 하 고 다음 등급된 알코올 시리즈에서 샘플을 탈수 (크 실 렌 에탄올 70%, 3 분 두 번에 대 한 에탄올 96%, 에탄올 100 %5 분 두 번, 5 분 두 번에 대 한 100 %3 미 n 한 번).
   주의! PFA는 눈, 코, 그리고 상부 호흡기 트랙에 자극 수 있습니다. PFA는 알려진된 인간 발암 물질 의심된 생식 위험.
3. 파라핀에 샘플을 포함, 시 신경 머리의 수준에서 5 µ m 섹션을 잘라 고 유리 슬라이드에 탑재.
4. 5 분 0.1% 산 되며 솔루션 deparaffinized 섹션 얼룩 및 염 산 믹스에 슬라이드를 찍기 후 두 번 증류수에에서 슬라이드를 찍어 (2 mL 25% HCl 250 ml에서 증 류 물) 및 암모니아 (250 ml에서 2 mL 25% 암모니아를 혼합 소 주 물)입니다. 적어도 10 분에 대 한 수도 물에 의해 얼룩이 지는 hematoxylin의 개발 후 오신 G 용액 0.5 %3 분에 대 한 섹션을 얼룩
5. 아크릴 수 지 장착 매체에 탈수 슬라이드를 탑재 하 고 가벼운 현미경 슬라이드 관찰.

6. MC 활성화 Immunohistochemistry

1. 적절 한 기선 또는 10-15 분 동안 전자 레인지에 3 분에 대 한 항 원 검색 버퍼 (트리 스-EDTA + 0.05% 비 이온 세제, pH 9.0)에서 deparaffinized 섹션을 열 및 5 TBS와 세 번 씻어 각 분.
2. 원형 한 실리콘 섹션 펜 및 100 µ L를 추가 차단 솔루션 (TBS + 10% 염소 정상 혈 청 + 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.6) 1 헤에 대 한 실 온에서
3. 안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질으로 얼룩 (GFAP) 토끼 polyclonal 항 체 그리고 방지 글루타민 합성으로 (GS) 마우스 단일 클론 항 체, 1: 200 희석 (샘플 당 40 µ L)에서 모두. 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 품 어. TBS + 0.1%로 세 번 세척 5 분 트윈 20.
4. 완료 시각화와 적절 한 2 차 항 체입니다. 이 프로토콜 사용 하는 염소-토끼 IgG H & GFAP와 염소 반대로 마우스 IgG H L 녹색 이차 항 체 & L GS, 1 헤에 대 한 실 온에서 1: 500 희석에 모두 밝은 빨간색
5. DAPI를 포함 하는 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 형광 현미경 슬라이드 관찰.

결과

실시간 10 월: 망막 수리에 MCs의 역할 분석, 우리 zebrafish 망막에 손상의 잘 delineated 영역 유도 레이저 부상 모델 사용. 손상의 사이트 했다 vivo에서 10 월 처음으로 (0 일) 부상 (그림 3)에 따라 60 분 이내에 의하여 몇 군데. 물고기 눈의 광학에 대 한 보상, 맞춤 콘택트 렌즈는 각 막에 배치 했다. 레이저 치료 후 즉시 확산 하이퍼 반사 ?...

토론

제 브라에서 망막 재생/변성 cytotoxin 중재 세포 죽음²², 기계적 상해²³, 열 상해²⁴등 다른 방법으로 조사 되었습니다. 우리 고용 zebrafish 망막 손상 532 nm 다이오드 레이저. 따라서, 우리의 모델 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 급속 하 게 외부 망막, PRs 계층에서 특히에 상해의 잘 정의 된 영역을 만들었습니다. 또한,이 실험 설정 안 n...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid hematoxylin solution	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2852
Albumin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A07030
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	5470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%	Carl Roth, Arlesheim, Switzerland	X883.2
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11020
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrogel contact lens	Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland	n.a.	1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody	Millipore, Billerica, MA, USA	MAB302
HRA + OCT Imaging System	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Spectralis
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody	Invitrogen, Waltham, MA, USA	180063
Silicone pin holder	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland	n.a.
Slit lamp adapter	Iridex Corp., Mountain View, CA, USA	n.a.
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
78D non-contact slit lamp lens	Volk Optical, Mentor, OH, USA	V78C
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Ocular fundus laser lens	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom	R2100-EU	Steamer