Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

요약

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

초록

항 원 특정 살인에 대 한 현재 방법은 생체 외에서 사용을 제한 또는 전염병 모델에 활용. 그러나, 감염 없이 항 원 특정 살인을 측정 하기 위한 프로토콜이 아니라 있다. 이 프로토콜은 설계 및 항 원 특정의 검출 함으로써 이러한 한계를 극복 하는 방법을 설명 합니다⁺ T vivo에서세포 CD8 하 여 목표 셀의 살인. 이 분석 결과 죽이고 전통적인 CFSE 표시 대상 접종 모델을 병합 하 여 수행 됩니다. 이 조합은 분석 결과 감염 또는 종양의 성장에 따라 의존 하지 않습니다 직접 그리고 신속 하 게 항 원 특정 CTL 잠재력을 평가 하는 연구원을 수 있습니다. 또한, 판독 cytometry에 기반 하 고 그래서 대부분 연구자에 게 쉽게 접근할 수 있어야. 연구의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 테스트 중인 가설에 적합 한 식별 됩니다. 항 원 강도 변화와 차동 cytolytic 함수에서 발생할 수 있는 T 세포에 돌연변이 세포 수확 및 평가 대 한 최적의 시간을 결정을 신중 하 게 평가 해야 합니다. 예방 접종에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 맞게 최적화 된 hgp100_25-33 , OVA_257-264, 하지만 추가 유효성 검사는 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 펩 티 드에 대 한 필요할. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

서문

CD8의 cytolytic (CTL) 잠재력을 평가 하기 위해 존재 하는 여러 프로토콜⁺ 또는 CD4⁺ T-셀. 이 평가 생체 외에서 제어 조건^1,,23에서 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 전염병 모델, LCMV, 고전적인 차동 CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르) 대상 셀을 표시를 사용 하 여 CTL 기능 검사 어디는 CFSE^안녕-레이블이 지정 된 셀 펩 티 드 및 CFSE^lo펄스-레이블이 대상 셀 남아 있다 unpulsed. 셀에 1:1 비율로 주입은 그리고는 CFSE^안녕의 손실에 대 한 평가-흐름 cytometry⁴펄스 대상 이라고 표시 된. 백신 및 제거 모델도 비슷한 전략에 vivo에서 두 CD8 살해의 평가 대 한 사용⁺ 와 CD4⁺ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포^5,6. 이 강력한 분석 결과 이지만 대상 주입 전에 면역 시스템 프라임 전염 성 요원의 사용을 요구 한다.

이 프로토콜을 다른 한편으로, 아무 사전 감염 호스트의를 요구 하 고 대신 예방 접종 전략 대상 주입 전에 면역 체계를 이용 한다. 이 예방 접종 이라고 covax⁷, 수용 체 통행세 같이 7 (TLR7)의 구성 된 immunostimulatory 칵테일의 제공을 요구 하는 펩타이드 백신의 물 배합의 구성 주 작동 근 (imiquimod 크림), agonistic 안티-CD40 항 체, 그리고 interleukin-2 (일리노이-2) 펩 티 드 관련 못쓰게 하 고 강력한 면역 반응의 도출에 대 한 immunostimulatory 에이전트의 시너지 조합에 지도. 따라서,이 분석 결과 제공 CTL 함수의 빠른 판독 백신 3 일전 주입 대상 셀의 함수의 평가 대 한 셀에 함께 관리 된다. 또한, covax 못쓰게가 강하다 충분히 주입 후 4와 24 h 사이 끝났다 항 원 특정 T 세포의 살해 능력을 볼 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 항 원 및 가설 테스트에 적합 한 대상 살인의 탐지를 위한 식별 됩니다. 주의 깊은 평가 수행 해야 합니다, 유전 변경 뿐 아니라 항 원 강도에 유사로 T-세포에서 테스트 되 고 될 수 있습니다 대상 살인의 다른 타이밍 검출 필요로 하는 차동 CTL 함수. 또한, 예방 접종에 맞게 최적화 된 인간 흑색 종 항 원 glycopeptide 100 (hgp100_25-33)에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 동안 ovalbumin (OVA_257-264)_257-264 ^8,9 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 항 원 모델의 사용 추가 유효성 검사가 필요한 것 이다. 예상된 한 보조로는 covax와 함께에서 CTL effector 기능을 자극 하는 대상 항 용량 차이, 때문에 일리노이-2 복용량 농도 및 복용량 주파수의 최적화는 원하는 목표를 달성 하기 위해 필수적인 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터의에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 백신에 대 한 펩 티 드의 준비

1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 농도와 30에 대 한 소용돌이와 동결 건조 된 펩 티 드를 분해 s.
   참고: hgp100_25-33, 최종 농도 1 mg/mL 및 OVA_257-264, 최종 농도 0.5 mg/mL입니다. 주입 전에 펩타이드 reconstitute 재구성 후 저장 하지 마십시오.

2입니다. 유전자 변형 마우스에서 Splenocytes의 격리

참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.

1. 승인 된 CO₂ 질 메서드를 사용 하 여 OT-1 유전자 변형 마우스를 안락사 하 고 비장을 제거 합니다.
   참고: 적절 한 유전자 변형 마우스는 선택의 펩 티 드에 대 한 특정이 단계에서 이용 된다.
   1. 그것의 오른쪽에 마우스를 놓는다. 스프레이 70% 에탄올 (EtOH) 마우스의 왼쪽. 집게를 사용 하 여 피부를 끌어와 수술가 위;를 사용 하 여 피부를 잘라 비장은 복 강 내 표시 되지 것입니다. 부드럽게 잘라 오픈 액세스 비장 하 복 막 구멍. 집게를 사용 하 여 비장을 제거 합니다.
2. (1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 PBS) 2 mL 매체 A와 페 트리 접시에 70 µ m 필터에 그것을 배치 하는 플런저의 끝으로 비장을 스매싱 하 여 비장을 세분화.
   1. 페 트리 접시를 50 mL 원뿔 튜브에 장소는 splenocytes를 수집 합니다. 매체 수집 하는 모든 셀을 두 번 A의 5 mL를 페 트리 접시를 씻어. 매체는 최대 25 mL를 추가 하 고 셀 475 x g에 실 온에서 5 분 동안 원심.
3. 셀을 발음 하 고 1 ml에서 / 비장 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼를 resuspend. 품 어 5 분에 대 한 실 온에서 매체 A의 추가 10 mL와 475 x g.에 상 온에서 원심 분리기 Resuspend 매체 A의 10 mL에 펠 릿 및 셀 서 스 펜 션 깨끗 한 50 mL 원뿔형으로 70 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 파편을 제거.
4. Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10의 최종 농도에 PBS에 셀 resuspend⁶ -⁶ 셀/100ml. OVA_257-에 대 한 특정₂₆₄ 10⁶ 셀/mL에서 resuspend, 및 hgp100에 대 한_25-33 특정 100⁶ 셀/mL에서 resuspend.
   1. 스핀 475 x g.에서 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포는 상쾌한 발음 하 고 세포를 씻어 15 mL 차가운 PBS에 resuspend. 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다. 스핀 475 x g.에서 5 분 동안 실내 온도에 세포는 상쾌한 발음 하 고 최종 볼륨 단계 2.4에서에서 결정에 따라 차가운 PBS에 resuspend.
   2. 단일 세포 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 받는 사람 C57/BL6 마우스에 주사까지 얼음에 계속.

3입니다. 유전자 변형 쥐에서 Splenocytes의 주입

1. 등 쪽으로 restrainer에서 받는 사람 C57/BL6 마우스를 놓습니다. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. 경사 면 27 G 바늘을 사용 하 여 꼬리 정 맥에 정 맥의 단일 세포 현 탁 액 (제 2) 100 µ L를 관리할 수 있습니다.

4. Covax 관리

참고: 셀 오후에 주입 하는 경우 covax 해야 관리할 수 세포 주입의 18 h 이내 다음 아침.

1. 1-3 %isoflurane 분명 마 취 상자에 마우스를 놓습니다. 후 마우스는 완전히 마 취, 마 취 실에서 매니폴드에 연결 된 코 콘 쥐 전송. 마우스를 등 쪽 사이드와 절제 된 유지.
   참고: Anesthetization 철수 반응 elicited 하지 확인 하려면 간단한 발가락 핀치에 의해 확인 된다. 연방 법률 허가 수 의사 순서 isoflurane 사용을 제한합니다.
2. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. (단면도 1)에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 피하 주사 꼬리 기본 지역 위로 향하도록 바늘 경사 쪽으로 4-5 밀리미터를 관통 하는 주사기 27 G 바늘을 사용 하 여.
   참고: 쥐 꼬리¹⁰의 기지에서 피하 주사와 함께 하나의 측면에서 예방 접종.
3. 백신 주사 사이트를 100 µ L 안티-CD40 항 체 (주식 0.5 mg/mL) 측면을 주입.
4. 예방 접종 사이트에 imiquimod 크림 50 mg/마우스를 신중 하 게 적용 됩니다. 크림은 더 이상 볼 수 하 고 완전히 흡수 될 때까지 imiquimod 크림 표면에 문질러.
5. Intraperitoneally 100000 IU/mL rhIL-2 단백질의 100 µ L를 주사 (i.p.) 더 낮은 복 부 지역에. 그들은 완전히 마 취에서 회복 후 5 분 동안 쥐를 관찰 합니다.
   참고: 실험은 일시 중지이 시점에서 3 일 동안.

5. 격리의 대상 Splenocytes CFSE와 라벨에 대 한

참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.

1. 승인 된 CO₂ 질 방법 C57BL/6 마우스 안락사 2.1.1 단계에서 spleen(s)를 제거 합니다. 비장을 세분화 하 고 세척 단계 2.2.1-2.2.3에서와 같이 splenocytes. 붉은 혈액 세포 단계 2.3-2.3.2에서 lyse
2. hemocytometer를 사용 하 여 계산에 대 한 셀을 제거 하 고⁶ 셀/10ml CFSE 라벨 솔루션 (7 단계에서 설명)에서 세포의 최종 농도 대 한 계산. G. Aspirate 상쾌한 x 475에 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포를 스핀.

6. 펩 티 드 대상 Splenocytes의 펄스

참고: 펩 티 드 펄스 살 균 방식으로 수행 합니다.

1. 완전 한 미디어에 10⁶ 셀/mL에서 셀 resuspend (RPMI 1640 미디어 10 %FBS, 1 %L-글루타민 (L-Gln), 1% 페니실린/스 (펜/Strep)). 2 튜브 (15 mL conicals)로 셀을 나눕니다. 각 튜브 펄스 또는 unpulsed 레이블.
2. 펩 티 드 라는 튜브에 펄스를 추가 합니다. OVA_257-264 펄스에 대 한 1 µ g/mL을 추가 하 고 hgp100_25-33 펄스, 2 µ g/mL를 추가 합니다.
   참고: unpulsed 셀 펩 티 드의 추가 없이 그냥 펄스 셀 같은 외피를 받 다.
   1. 셀 + 1 시간 동안 37 ° C에서 펩 티 드를 품 어.
3. 완전 한 미디어의 10 mL을 추가 (RPMI 1640 미디어 10 %FBS, 1 %L-글루타민 (L-Gln), 1% 페니실린/스 (펜/Strep)) 씻어 각 관 모두 펄스를 대상 셀 unpulsed. G. Aspirate 상쾌한 x 475에 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포를 스핀.

7. 준비 CFSE의 대상 Splenocytes 라벨에 대 한

1. 세척 단계 6.3;에서 셀 동안 CFSE 라벨 솔루션을 준비 펄스 셀으로 CFSE^loCFSE^안녕 하 고는 unpulsed로 표시 됩니다. 10⁶ 셀 CFSE 라벨 솔루션의 1 mL를 준비 합니다.
   참고: CFSE 빛에 민감한 이며 항상 빛 으로부터 보호 되어야 한다.
   1. CFSE^안녕 준비-미디어 RPMI 1640 2%에서에서 5 µ M/mL의 최종 농도 대 한 1 uL/mL CFSE (5 m m 재고 솔루션)를 추가 하 여 라벨 미디어 FBS.
   2. CFSE^lo 준비-1 uL/mL CFSE (0.5 m m 재고 솔루션) 2%와 0.5 µ M/mL RPMI 미디어 1640의 최종 농도 대 한 추가 하 여 라벨 미디어 FBS.

8. 라벨링 CFSE와 대상 Splenocytes

참고: CFSE 라벨 살 균 방식으로 수행 해야 합니다.

1. 10⁶ 셀/mL CFSE 라벨 미디어에서 (에서 단계 6.3) 펄스와 unpulsed 대상 셀 resuspend Resuspend 펄스 셀 준비 CFSE^안녕-미디어와 함께 unpulsed 셀 라벨 준비 CFSE^lo-라벨 미디어.
2. 세포와 부드러운 반전 또는 소용돌이 CFSE 라벨 미디어 믹스. Vortexing에 의해 혼합 하지 마십시오. 셀을 품 어 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 미디어 CFSE 라벨 리믹스 셀 마다 5 분.
3. 475 x g에 5 분 동안 실 온에서 각 셀 서 스 펜 션 및 스핀 세포를 완전 한 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
4. 상쾌한 발음 하 고 10 mL 차가운 PBS에 셀 resuspend. 475 x g에 5 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀.
5. 8.4 단계를 반복 합니다.
6. 계산 셀과 믹스 펩 티 드-펄스, CFSE^안녕-표시 unpulsed, CFSE^lo-셀 받는 쥐로 주입에 대 한 1:1 비율로 표시. 1 x 10⁶ 초기 흐름 cytometry 평가 (11 단원)를 사용 하 여 셀을 혼합 한 약 수를 유지 합니다.
   참고: 주입에 대 한 최종 볼륨 마우스 당 100 µ L입니다. 마지막 셀 수 10e6 셀입니다. 주사기와 바늘에 볼륨의 손실 고려 되어야 하 고 500 µ L에서 추정 한다.

9입니다. 대상 세포의 주입

참고: 계속 하기 전에 가능한 만큼 많이 주입 하는 동안 빛에서 보호 CFSE 표시 셀.

1. 등 쪽으로 restrainer에서 받는 사람 C57BL/6 마우스를 놓습니다. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. 관리 100 µ L 단일 세포 현 탁 액의 정 맥 꼬리 정 맥에 베벨 면이 위로 향하도록 합니다.

10입니다. 다시 격리 대상 셀의

참고:이 단계의 타이밍은 중요 하 고 CTL 세포 독성과 자극에 대 한 항 원의 강도 의존. 죽이 OVA_257-264 펄스 대상의 평가, 대 한 세포를 주입 후 수확된 4-6 h을 있이 필요가 있다. CFSE 표시 된 셀은 어둠 속에서 빛, 민감한 프로세스 spleens 이후.

1. 승인 된 CO₂ 질 방법 받는 사람 C57BL/6 마우스 안락사
2. 2.1.1 단계에서 spleen(s)를 제거 합니다. 비장을 세분화 하 고 세척 단계 2.2.1-2.2.3에서와 같이 splenocytes. 붉은 혈액 세포 단계 2.3-2.3.2에서 lyse
3. Cytometry에 의해 평가 대 한 정렬 (FACs) 버퍼 (1 %BSA + PBS) 1 mL 형광 활성화 된 세포에 세포를 resuspend.

11. 제어 논리 Cytometry CTL 활동을 결정 하

1. 표준 교류 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 CTL 활동의 평가 수행 합니다. 여기¹¹488 nm 레이저와 교류 cytometer에 FITC 채널을 사용 하 여 셀을 획득 합니다.
   1. 게이트 앞으로 분산형 (FSC) vs 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 라이브 세포에. CFSE 긍정적인 총인구에 대 한 라이브 림프 구 게이트 내에서 subgate.
      참고: 삽입 된 CFSE 표시 셀 비장에 총 림프 톨의 작은 하위 집합을 만들 것입니다. CSFE-긍정적인 세포는 로그 눈금에 두 개의 뚜렷한 인구로 표시 되어야 합니다.
   2. 히스토그램 형식을 사용 하 여 unpulsed (왼쪽된 피크, CFSE^lo) 및 펄스 (오른쪽 피크, CFSE^안녕)의 비율을 결정 인구. CFSE^{안녕하세요} 셀의 손실 항 원 특정 CTL 활동을 나타냅니다.

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결과

CFSE 표시 대상 셀의 주입, 전에 1:1 셀 혼합 CFSE^안녕 와 CFSE^소호 대상 셀의 기준 주파수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 실행 됩니다. 그림 1 A CFSE 인구에 있는 변화를 검출 하는 제어 전략, 초기 게이트 FSC 그리고 SSC 매개 변수를 사용 하 여 이루어집니다. 이 인구는 레이블 없는 생 splenocytes에 비해 상대적으로 작은 총 CFSE 긍?...

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토론

이 프로토콜은 간단 하 고, 신중 하 게 수행 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다음 테스트 되 고 항 원 특정 T 세포의 주입 covax 못쓰게 펄스 목표의 모든 살인을 볼 필요가 있다. 물 기반 covax 예방 접종 급성 염증 상태, 만성 염증 성 단계에 대 한 만듭니다 수 있지만 더 나은 생산할 수 있습니다 느린 원 출시 석유 기반의 접근 방식으로 단기 물에 기초를 둔 배합을 대체 결과

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice	Charles River	027	C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice	Jackson Labs	003831
hgp10025–33	CPCScientific	834139	KVPRNQDWL
OVA 257–264	CPCScientific	MISC-012	SIINFEKL
Imiquimod cream 5%	Fougera	51672-4145-6	Aldara Cream
CD40-specific mAb	BioXcell	BE0016-2	clone FGK4.5
rhIL-2 protein	Hoffman LaRoche Inc	136	Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep	Kendall	S-17474
PBS	Life Technologies	10010-023	Phosphate Buffered Saline
FBS	Life Technologies	26140-079	fetal bovine serum
RBC lysis buffer	Life Technologies	A10492-01	red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
L-Glutamine	Life Technologies	25030081
Pen/Strep	Life Technologies	15140122	penicillin/streptomycin
CFSE	Life Technologies	C34554	5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
1.5 mL MCT graduated natural	Fisher	05-408-129	microcentrifuge tube
70% ethanol	Fisher	BP8201500	EtOH
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061
Hemocytometer	Fisher	267110
27 gauge needle	BD	305109
1 mL syringe	BD	309659