체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

요약

시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

초록

N-니트로 시 토 크롬 P450 산화 전시 활동을 요구 하는 환경 발암 물질의 기초가 튼튼한 그룹. 대사 활성화의 허용된 메커니즘 저절로 DNA alkylating 에이전트를 분해 하는 α-hydroxynitrosamines의 대형을 포함 한다. DNA 손상의 결과 돌연변이 축적 궁극적으로 암으로 이어질 수 있습니다. 새로운 증거는 α-hydroxynitrosamines 수 수 추가 산화 nitrosamides에 processively 시 토 크롬 P450s에 의해 나타냅니다. Nitrosamides α-hydroxynitrosamines 보다 일반적으로 더 안정 하 고 또한 DNA를 알 수 있습니다, 때문에 nitrosamides 발암에 역할을 재생할 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 니트로의 생체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매 물질 대사에서 nitrosamide 생산을 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 관련 nitrosamides 및 생체 외에서 시 토 크롬 P450 물질 대사 분석 결과 검색에 대 한 액체 착 색 인쇄기-nanospray 이온화 높은 해상도 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 합성 하는 일반적인 접근 방식을 활용 합니다. 이 방법은 n ′-예제 연구에서 nitrosonornicotine의 작은 대사 산물으로 n ′-nitrosonorcotinine를 감지. 메서드는 높은 감도 및 선택적으로 인해 정확한 대량 검출. 다양 한 nitrosamine-시 토 크롬 P450 시스템에이 방법의 응용이이 변환의 일반 성을 결정 하는 데 도움이 됩니다. 시 토 크롬 P450s 다형성을 활동에서 변화 하기 때문에 개별 암 위험 평가에 도움이 수 nitrosamide 대형의 더 나은 이해.

서문

N-니트로 사 민 다이어트, 담배 제품 및 일반 환경;에 있는 발암 물질의 큰 클래스는 ¹인체에서를 endogenously 형성 수 있습니다 또한. 이상의 300 N-nitroso 화합물 테스트 및 > 90%에서 발암 성 평가 했다 동물 모델^2,3. 그들의 성에 전시, 먼저이 화합물 시 토 크롬 P450s^1,,23에 의해 작동 한다. 연구는 시 토 크롬 P450s 쉽게 산화 α-hydroxynitrosamines (그림 1)는 ~ 5의 반감기와 반응성이 매우 높은 화합물에 니트로 자발적으로 alkyldiazohydroxides를 분해 하기 전에 s. 후자는 H₂O N₂의 손실 후에 DNA을 알 수 있습니다. 결과 DNA adducts unrepaired, 암 개발¹이어질 중요 onco-또는 종양 억제기 유전자는 돌연변이 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 많은 노력 변화 통로의 완전 한 이해를 얻으려고 소비 되어, DNA adducts, 그리고 발암 성 니트로의 시 토 크롬 P450 산화의 다운스트림 대사 산물. 이 지식에 개별 암 위험 평가⁴잠재적인 응용 프로그램 합니다.

그림 1: 일반 및 니트로의 제안 된 대사.
(1) 니트로 P450s α-hydroxynitrosamines (2) 자발적으로 alkyldiazohydroxides (3)을 분해 하는에 산화 됩니다. 이러한 화합물 형태로 DNA adducts DNA에 바인딩할 수 있습니다. 그것을 가정 했다 그 2 는 nitrosamides 4P450s에 의해 더 산화 된다. 이러한 형태로 소설 DNA adducts 또는 3 알려진된 DNA adducts 형태로 분해 DNA에 직접 바인딩할 수 있습니다. R₁ 과 R₂ 알 킬 그룹을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Α-hydroxynitrosamine 가설을 단단하게 광범위 한 데이터에 의해 지원 됩니다, 하지만 몇 가지 불일치;는 주요 것은 α-hydroxynitrosamines^5,6의 짧은 반감기 이다. 이러한 화합물 바인딩과 그물 막에 생산 고 나중 핵 DNA를 알 알려져 있다. 몇 초 그들의 일생을 감안할 때, 그것은 어떻게 이러한 중간체 살아남을 필요한 여행 하지만 cytosol 수수께끼 이다. 하나의 가설은 이다 α-hydroxynitrosamines의 부분 산화 processively는 nitrosamides^7,8, 비교⁹에서 매우 안정적입니다. 이것은 아마도 시 토 크롬 P450 활성 사이트에서 α-hydroxynitrosamines의 보존을 통해 발생 합니다. 산화의이 유형에 대 한 전례가 니코틴¹⁰, 알콜¹¹, 그리고 간단한 alkylnitrosamines^12,13보아 왔다. 또한, nitrosamides는 직접 연기 발암 물질^2,3. ⁹그들의 반응 따라, 이러한 화합물 생산 DNA adducts 함께 새로운 α-hydroxynitrosamines에서 인 동일 하, 미개척된 DNA adducts (그림 1) 추정 된다. 따라서,이 가설 뿐만 아니라 설명 한다 cytosol, 통해 전송 하지만 또한 DNA의 형성 제품 손상.

이 문서에는 생체 외에서 시 토 크롬 P450 중재 변환 니트로의 nitrosamides 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. N ′-nitrosonorcotinine (NNC) 시 토 크롬 P450 2A6에 의해 n ′-nitrosonornicotine (NNN)의 이전에 보고 된 변환 예제¹⁴로 전시 됩니다. 다양 한 기질-효소 시스템에이 프로토콜의 응용 프로그램 전반적인 nitrosamine 대사 nitrosamides의 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 자료 및 일반 절차

1. 종합 NNN 앞 ¹⁵에서 설명한. Norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH 재생 시스템, 0.5 x 반응 버퍼, 및 다른 모든 화학 시 약 급료에 상용 소스 로부터 용 매 또는.
2. 500 MHz 분석기에 기록 NMR 스펙트럼. 보고서 화학 당 부품으로 교대 백만 (ppm). 잔류 용 매 피크를 사용 하 여 내부 참조 ¹ H NMR (7.26 ppm CDCl ₃)와 ¹³ C NMR (77.2 ppm CDCl ₃).
   참고: 피크 분할은 다음과 같은 약어를 사용 하 고 있다: s 내의 d = 더블 릿, dd = = 남자, dt의 남자 용 상의 삼중 항, dq의 더블 릿 = 사중주, ddd의 더블 릿 = = 남자, 그리고 m의 남자 용 상의의 더블 릿 multiplet =.
3. LTQ Orbitrap Velos와 m/z로 보고서 데이터에 선택 된 화합물에 대 한 고 분해능 질량 분석 (HRMS) 수행.
4. 사용 polygram 미리 254 nm 형광 표시기 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)와 실리 카 젤 TLC 판 (40 m m x 80 m m, 두께 0.2 m m) 코팅. UV 램프 조사 하 여 TLC 번호판을 시각화.
5. 1.5 cm x 15 cm 유리 열을 사용 하 여 Å, 70-150 메쉬 실리 카 젤 60에 플래시 크로마토그래피를 수행.

2. Nitrosamide 긍정적인 통제의 준비 (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)

1. 건조, 하룻밤 오븐에서 (16 h, ~ 140 ° C), 25 mL, 둥근 바닥 플라스 크 자기 볶음 bar가 포함 된. 아침에 차가운 흐름의 N ₂ N ₂ 흐름을 유지 하는 석유 bubbler를 사용 하는 동안 플라스 크 속도 초당 1 개 거품.
   참고: 냉각 후, 아무 주의 N ₂ 플라스 크를 유지 하는 필요.
2. 연기 후드, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), 아세트산 무수 물 (5 mL), 및 초 산 (1 mL)을 추가 냉각된 플라스 크. 지속적으로 물이 얼음 욕조와 0 ° C에 냉각 하는 동안이 혼합물을 저 어.
   주의: 아세트산 무수 물과 아세트산은 부식성.
3. 추가 나노 ₂ (33.3 mg, 0.483 mmol) 한 부분을 지속적으로 2.5 h. TLC에 의해 모니터 반응 진행에 대 한 혼합물을 저 어 (100 %EtOAc, R _f = 0.19, 단계 1.4 참조).
   참고:이 시간이 지남에 혼합 될 것입니다 점점 노란색 가끔 버블링.
4. (18 mL) 얼음 처럼 차가운 H ₂ O로 혼합물을 붓는 의해 반응을 끄다. 바로 채널 ₂ Cl ₂ 100 mL separatory 깔때기에 18 mL와 용액을 추출 합니다. 추출 물의 레이어 채널 ₂ Cl ₂ (각 9 mL)와 적어도 2 추가 시간.
5. 풀링된 생명체 2 분 필터 MgSO ₄ 이상 ~ 100 mg을 건조 하 고 원유, 노랑, 석유를 회전 증발에 의해 솔루션을 집중. 증발 잔류 초 산을 제거 하는 동안 30 ° C에 물 목욕 열.
   참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 화합물 채널 ₂ Cl ₂와 2-8 ° c.에 어둠 속에 저장 하는 솔루션에 용 해 하는 경우
6. 칼럼 크로마토그래피에 의해 원유 화합물 정화 (단계 1.5 참조) 실리 카 젤을 사용 하 여 고정 위상 및 100%로 EtOAc eluent ¹⁶.
   주의: NNC와 관련된 nitrosamides 처리 주의 그들은 인간의 발암 물질로 간주 됩니다.
7. CDCl ₃ 순수 화합물을 녹이 고 NMR을 사용 하 여 (단계 1.2 참조) 구조를 확인 하 고이 솔루션 ¹⁷의 몰 확인 하. 2-8 ° C까지 필요에 어둠 속에서이 솔루션을 저장.
   참고:이 솔루션 (3.5 단계)의 체 외에 분석 결과에 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. NMR 스펙트럼 및 화학 교대 지원 정보에서 사용할 수 있습니다.
8. 순수한 NNC 솔루션으로는 정확한 확인 질량 부모 고 1.3 및 4.3 단계에서 설명 하는 매개 변수에서 고해상도 질량 분 서 계 (HRMS)에 직접 주입 하 여 제품 이온 대중의 결정.
   참고: 제품 질량 체 외에 대사 분석 결과 (4.3 단계)에서 화합물 검출을 위해 사용 됩니다.

3. 예제 nitrosamine P450 생체 외에서 부 화

1. -80 ° C 냉동 고에서 P450 2A6 Baculosomes, 생생한 NADPH 재생 시스템, 그리고 10 mM NADP ⁺ 재고 솔루션을 제거 하 고 얼음에 녹여 그들. 일단 해 동, 희석 Baculosomes 및 NADPH 재생 시스템 1: 10과 1:50, 0.5 X 반응 버퍼 단일 1 mL 튜브에 각각. 마찬가지로, 추가 반응 버퍼 X ⁺ 재고 솔루션 0.5 97 μ를 NADP의 3 μ.
   참고: NADP ⁺은 빛에 민감한입니다. 이 솔루션의 컨테이너 알루미늄 호 일에 감싸서 보호 유지. 효소 솔루션은 민감한 freeze-thaw 주기; 이 2 개 이상의 주기를 제한 합니다. Aliquots 미래 실험을 위한 필요에 따라 준비.
2. 각 보육에 대 한 추가 50 μ 효소 솔루션 (5 pmol P450 포함) 1 mL의 튜브 반응 버퍼와 4 μ M NNN 솔루션의 포함 40 μ. 미리 물을 욕조를 사용 하 여 37 ° C에서 2 분에 대 한이 새로운 혼합물을 품 어 고 희석된 NADP ⁺ 솔루션의 10 μ를 추가 합니다. 37에 1-30 분에 대 한 전체 시스템을 품 어 ° c.
   참고: 보육 시간 5 분 간격을 사용 하 여 (예: 5, 10, 15 분, 등) 충분 한 nitrosamide 형성 시간 코스를 제공 합니다.
3. 원하는 보육 시간 후 3.0 N ZnSO ₄의 첫 번째 추가 10 μ와 3.0 N Ba(OH)의 다음 10 μ 끄다 _2. 소용돌이이 솔루션 및 백색 침전 물은 형성할 것 이다. 원심 침전 작은 4 분 8000 x g에서 샘플.
   참고: 절차 해야 하지 일시 중지이 단계에서 수성 해결책에 있는 안정성을 제한 하는 구성 된 nitrosamides로 합니다. 허위 제외 어 긴 일시 중지 될 수 있습니다.
4. 즉시는 상쾌한 플라스틱 및 액체 크로마토그래피 긍정적인 nanoelectrospray-이온화 고해상도 탠덤 질량 분석에 의해 2 μ를 분석 (LC-NSI ⁺-HRMS/MS, 4.1 4.3 단계).
5. 긍정적인 제어 외피에 대 한 흐름의 N ₂ 1 mL 튜브에 합성된 NNC 솔루션의 100 fmol을 포함 하는 약 수를 증발. 이 유리병에 3.2 단계에서 전체 효소 시스템을 추가 하 고 3.3-3.4 단계에 설명 된 대로 진행.
6. 부정적인 제어 외피 수행 실험 설명된 (3.2-3.4 단계)로 바꾸기는 50 μ 효소 반응 버퍼 X 0.5 솔루션 제외.

4. LC-NSI ⁺에 의해 nitrosamide 탐지에 대 한 매개 변수 예제-HRMS/MS

1. LC에 대 한 구성 요소를 사용 하는 상업, 손 포장 ¹⁸ C18 UPLC 시스템 단계 4.2에서에서 다음과 같은 여러 단계로 그라데이션 적용 (5 μ m), 100 m m x 75 μ m, 15 μ m 구멍 모 세관 칼럼.
2. 용 매와 용 매 b MeCN로 사용 하 여 5 mM NH ₄ OAc 1 μ/분 5 %B 실행 하 여 열에 샘플을 로드 0-5 분, 그리고 다음 이후에 0.3 μ/분 유량을 둔화. 다음, 실행 그라디언트 5에서 20% 이상 4 분, 55% B 10 분 이상 램프 및 다음 5%를 다시 평형 b.
3. 수행 LC NSI ⁺-LTQ Orbitrap에 HRMS/MS. 전체 검사와 MS ² 조각화 NNC 위한 모니터. 60, 000의 해상도에서 전체 검사를 수행 하 고 5 ppm의 대량 허용에 정확한 부모 질량 (192.07670)를 추출 합니다. 격리 하 부모 이온 (2.0 amu) 및 조각 충돌 유도 된 분리 (CID) 충돌 에너지 25 eV, 15000의 해상도의 여 고 30 양의 시간을 스캔 사용 MS ² 조각화 추출 NNC (m/z의 제품 이온에 대 한 정확한 질량 192 m/z 134.04739와 162.07874) 5 ppm의 대량 허용 오차에서.

결과

백인 외의 작업을 기반으로 합니다. ¹⁹, norcotinine 되었고 NNC에 니트로 소화 깔끔하게 높은 수율 (80-92%)에서 생체 외에서 실험에 대 한 표준 생산 하. 성공적인 반응에 대 한 구조적 증거 ¹H NMR, ¹³C NMR, 아늑한, 그리고 부모 질량 [M + H] 확인 HRMS 함께 HSQC (지원 정보)를 포함 하 여 분 광 분석에서 얻은⁺ 의 5 ppm 이내는 이론적...

토론

니트로의 신진 대사를 elucidating 그들의 성에 이해 하는 중요 한 구성 요소입니다. 이기 때문에 관련 된 시 토 크롬 P450s와 다른 대사 효소 다형, 더욱이 지식을 응용 프로그램 식별할 수 있는 잠재적으로 위험이 높은 개인^1,4. 새로운 데이터의 α-hydroxynitrosamines, DNA 바인딩에 관련 된 니트로의 추정된 주요 대사 산물을 더 산화, nitrosamides 하는 것은 가능 합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Norcotinine	AKoS GmbH (Steinen, Germany)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	242845
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	431311
Barium Hydroxide	Sigma-Aldrich	433373
D-Chloroform	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Chloride	Sigma-Aldrich	34856
Sodium Nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit	Life Technologies	PV6140
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	221376
0.5 mL tubes	Fisher	AB0533
100 mL round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z510424
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS4980125
125 mL Separatory Funnel	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman-Coulter
LC vials	ChromTech	CTC–0957–BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Magnetic Stir bar	Sigma-Aldrich	Z127035
NMR tube	Sigma-Aldrich	Z274682
P1000, P200, and P10 pipettes	Eppendorf
Rotary evaporator	Sigma-Aldrich	Z691410
RSLCnano UPLC system	Thermo Scientific
Shaking Water Bath	Fisher	FSSWB15
Stir plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420
PicoFrit Column	New Objective	PF3607515N5
Luna C18, 5 um	Phenomenex	535913-1