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요약

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

초록

비 정식 핵 산 보조 구조 G-quadruplexes (G4) DNA 복제, 전사, RNA 가공, 및 telomere 신장 하 여 다양 한 세포질 프로세스에서 포함 된다. 이 프로세스 동안 다양 한 단백질 바인딩 하 고 그들의 기능을 수행 하도록 G4 구조를 해결 합니다. G 4의 함수는 종종 접힌 구조의 안정성에 따라 달라 집니다, 그것은 G4 바인딩 단백질 g 4의 안정성을 조절 하는 방법을 조사 하는 것이 중요. 이 작품 실시간으로 단일 G4 분자에 G4 바인딩 단백질의 레 귤 레이 션의 연구를 가능 하 게 자석 족집게를 사용 하 여 단일 G4 분자를 조작 하는 메서드를 제공 합니다. 일반적으로이 메서드는 상호 작용 단백질/ligands 및 다양 한 DNA 또는 RNA 이차 구조 규정에 대 한 연구에 응용 프로그램의 넓은 범위에 적합 합니다.

서문

4 가닥 DNA 또는 RNA G4 구조는 많은 중요 한 생물 학적 과정1에서 중요 한 역할을 재생합니다. 많은 단백질 g 4 바인딩 및 telomere 바인딩 단백질 (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)를 포함 한 규제에 관련 된1,2, 녹음 방송 요인 (nucleolin, PARP1)3, RNA 단백질 (hnRNP A1, 처리 A2 hnRNP)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, 그리고 DNA 복제 관련 단백질 (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. 단백질 바인딩 수 안정 또는 불안정 G4 구조; 따라서 후속 생물학적 기능을 규제. G 4의 안정성 자외선 (UV) 또는 원형이 색 성 (CD) 방법7을 사용 하 여 용 해 열 측정 했다. 그러나, 이러한 상태는 생리 관련 바인딩 단백질7의 효과 공부 하 고 적용 하기가 어렵습니다.

단일 분자 조작 기술에 급속 한 발전은 폴딩 및 실시간8나노미터 분해능으로 단일 분자 수준에서 단백질, DNA 등 biomolecule의 전개의 연구를 활성화 하 고. 원자 힘 현미경 (AFM), 광학 족집게 및 자석 족집게는 가장 일반적으로 사용 되는 단일 분자 조작 방법. AFM와 광학 핀셋9에 비해, 자석 족집게 반 드리프트 기술을10,11을 사용 하 여 단일 분자의 폴딩 전개 역학의 안정적인 측정을 일 동안 수 있습니다.

여기, 단백질에 바인딩하여 G4 안정성의 규칙을 공부 자석 족집게를 사용 하 여 단일 분자 조작 플랫폼 보고12,13입니다. 이 작품 샘플 및 흐름 채널 준비, 자석 족집게의 설치 힘 보정 등 기본 접근법을 설명 합니다. 힘 제어 및 안티 드리프트 프로토콜에 설명 된 단계 3으로 일정 한 힘 (힘 클램프) 등의 다양 한 포스 컨트롤에서 긴 시간 측정에 대 한 허용 하 고 상수 로드 (포스-램프), 속도 및 힘-점프 측정. 단계 4에서에서 설명한 힘 교정 프로토콜의 힘 보정 가능 < 넓은 힘에 짧은 밧줄 1 µ m 범위 10% 내에서 상대적인 오류와 함께 최대 100 pN. RNA Helicase의 안정성의 규칙의 예를 들어 RNA G413이 플랫폼 응용 프로그램을 설명 하는 해결에 필수적인 역할을 재생 하는 누구나 풍부한 요소 (RHAU) helicase (별칭 DHX36, G4R1)와 관련 된.

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프로토콜

1. 준비 G4 DNA의 단일 분자 기지개

  1. 준비 5 '-thiol 분류 및 5 '-biotin PCR 5를 사용 하 여 람다 파지 DNA 템플렛에 DDNA 중 합 효소를 사용 하 여 dsDNA 핸들 이라고 표시 된 '-thiol 및 5 '-비오 틴 뇌관 14 ( 그림 1). 두 dsDNA 처리는 높은 GC 내용 (> 60%) DNA를 방지 하기 위해 녹는 때 DNA는 높은 힘에서 또는 DNA 잡아당기고 동안 전환 15.
  2. 정화 PCR 제품 제조 업체에 따르면 BstXI 제한 효소로 다이제스트를 상업적인 정화 키트를 사용 하 여 ' s 프로토콜.
  3. 선 G4 형성 ssDNA, 그리고 측면 ssDNA 및 dsDNA 핸들 제조 업체에 따라 T4 DNA 리가 사용 하 여 ' s 프로토콜. 합자 제품 제조 업체에 따라 상업적인 정화 키트를 사용 하 여 젤 추출 하 여 정화 ' s 프로토콜.

2. 흐름 채널의 준비

  1. Coverslip 청소 및 표면 기능화
    1. 장소 coverslips (#1.5, 22 × 32mm) 및 최고 coverslips (#1.5, 20 m m x 20 m m) (각 병 coverslips의 7 조각을 저장할 수 있는 항아리를 얼룩이 지는 커버 유리로 바닥 볼륨이 ~ 20 mL). 2-5 번 증류수와 함께 항아리에는 coverslips을 린스.
    2. 추가 ~ 각 병, 그리고 30 분에 대 한 초음파 청소 목욕에서 다음 장소에 5-40% 세제 솔루션의 20 mL에 증류수로 씻어 > 세제를 제거 하려면 10 번.
    3. 건조 오븐에서 항아리에 coverslips (~ 150 ° C; 주의 핫), 또는 N 2 가스. 건조 장에서 말린된 최고 coverslips를 저장.
    4. 청소 10 분 동안 항아리에 coverslips를 사용 하 여 플라즈마 (O 2 가스). 10 분 동안 준비의 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (항) 솔루션 메탄올 20 mL (주의 독성/물). 화학 증기 두건 항 메탄올 분해를 사용 하 여.
      참고: 항 솔루션을 저장할 때 습도를 피하십시오. 오래 된 항은 종종 coverslips의 표면 functionalizing에서 문제 발생.
    5. 플라즈마 청소, 직후 항아리에 모두 1% 항 솔루션을 추가 하 고 1 헤 부 1% 항 메탄올에 대 한 특정 폐기물 병으로 폐기물에 대 한 품 어. 가연성 화학 물질에 대 한 증기 두건에서 메탄올 관련 된 단계를 수행 하십시오.
    6. 린스 한번 메탄올과 항아리와 > 10 배와 증류수, 오븐 (~ 150 ° C;에 의해 다음 드라이 주의 뜨거운)입니다. 건조 캐비닛 아닐 경우 최대 2 주 동안 사용 항 코팅 아래쪽 coverslips를 저장.
      참고: 각 하위 단계에서 2.1.1 2.1.4, 후 청소 과정 일시 중지할 수 있습니다 다음 단계 전에.
  2. 어셈블 흐름 채널
    1. 두 준비 " 스페이서 ", 즉, parafilm 또는 더블 사이드 테이프 (~ 4 m m × 20 m m) 각 채널에 대 한. 긴 가장자리를 따라 아래쪽 coverslip에 스페이서의 두 조각을 놓으십시오. 최고 coverslip 형성 흐름 셀 사이 공백에 배치 (~ 10 mm × 20 m m 영역, 그림 2A , B).
    2. 는 Parafilm으로 스페이서를 사용 하는 경우 위 흐름 채널 히터 (60-120 ° C; 주의 뜨거운) 부드럽게 parafilm으로 두 개의 coverslips 함께 붙어 최고 coverslip의 양쪽을 누르고 있는 동안 5-10 s. 결과 흐름 채널의 높이 ~ 100 µ m, 그리고 그로 인하여 채널의 볼륨 ~ 20 µ L.
    3. 누설을 피하기 위해 실리콘 접착제로 채널의 긴 가장자리를 밀봉 하십시오. 실리콘 접착제를 사용 하 여 항목 및 솔루션의 출구로 흐름 채널의 각 열려있는 가장자리에 작은 싱크 같은 구조를 만들기 위해.
      참고: 입구와 출구 만들 수 있습니다 예를 들어, 다른 방법으로 붙는 작은 플라스틱 반지 왁 스를 사용 하 여.
    4. 최대 4 주 동안 건조 캐비닛에 채널 저장.
  3. 흐름 채널의 하단 표면에 밧줄 DNA
    1. 아미노산 코팅 된 폴리스 티 렌 구슬 희석 (직경: 3 µ m) 소 주 1 X 200 X 인산 염 (PBS) 버퍼 버퍼링. 소용돌이 구슬 솔루션 그리고 채널에 다음 흐름. 비드 솔루션에 대 한 채널에서 품 어 ~ 30 분 1 X PBS 버퍼의 200 µ L로 세척 하 여 어떤 떨어진된 구슬을 제거.
    2. 조정 (증가/감소) 50 m m x 50 m m 영역 당 1-5 구슬의 표면 밀도 달성 하기 위해 부 화 시간이. 최대 3 일에 대 한 참조 구슬 입금 채널 저장.
    3. Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) 1 X PBS 솔루션으로 cyclohexane-1-카복실산 (Sulfo SMCC) 분말 (~ 0.5 mg/mL). 소용돌이 솔루션 및 채널에 다음 흐름.
      참고: 사용 하기 전에 신선한 Sulfo SMCC 솔루션을 준비 하 고는 SMCC hydrolyzation 피하기 위해 채널에 그것을 즉시 추가.
    4. 품 SMCC 솔루션 30 분에 대 한 채널에서 다량으로 세척 하 여 SMCC 솔루션 제거 (1 mL, ~ 50 채널 볼륨 X) 1 X PBS 솔루션.
      참고: 초과 SMCC 신중 하 게 씻어. 이 단계는 coverslip에 DNA의 바인딩을 위해 매우 필수적 이다.
      1. DNA tethering 희석의 결과 DNA 농도와 1 X PBS에 DNA 라는 thiol biotin ~ 0.3 nM. 부드럽게 혼합 하는 솔루션, 흐름 DNA 솔루션 SMCC 코팅 채널에 고 실 온에서 30 분 동안 품 어 플라스틱 (~ 23 ° C).
    6. 부드럽게 씻어 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 0.01 %2-Mercaptoethanol 1 X PBS를 포함 하는 솔루션을 차단의 200 µ L와 함께 무료 DNA.
    7. 차단 채널 표면 솔루션 (10 mg/mL BSA, 0.01 %2-Mercaptoethanol) 차단에 채널을 배양 하 여 > h;이 단계 후 2 채널은 실험에 대 한 준비. 준비 된 채널 4 ° C에서 보관 하실 수 있습니다 ~ 1 일.
      참고: 블로킹 단계는 DNA와는 coverslips 자석 구슬의 비 특정 바인딩을 줄이기 위한 중요.

3. 마그네틱 핀셋 설치 및 단일 식별 dsDNA 밧줄

  1. 자석 족집게 설치
    1. 시작 자석 족집게 제어 프로그램. 여기, 자석 족집게에 집을 작성 된 LabVIEW 프로그램에 의해 통제 되었다.
    2. 채널을 탑재 하기 전에 자석 센터를 맞춥니다. 렌즈를 4 X를 사용 하 여 조정는 x-축 및 y 축 현미경의 광 축에 자석의.
    3. 컴퓨터 제어 전동된 조작 기를 사용 하 여 z-방향 ( 그림 2A) 따라 자석 이동 거리 d로 설정을 = 0 (d: 자석 coverslip 사이의 거리)는 자석을 연결 하는 경우 현미경에 coverslip.
    4. 프로그램 (즉, 상수 d) 지속적인 힘을 포함 하 여 힘의 제어를 달성 하기 위해 조작 통해 자석의 움직임 및 F (t)를 강제로 시간 변화 (즉, 시간 변화 d(t )).
    5. 목표 통해 구슬의 다시 흩어져 조명을 위한 밝은 발광 다이오드 (LED) 광원 사용. 여 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라. 100 Hz의 샘플링 레이트에서 구슬 이미지 수집 < /l나 >
  2. 샘플을 설치 하 고 단일 dsDNA 밧줄 식별
    1. 밧줄 형성
      1. 부드럽게 200 X 흐름 분석 솔루션 (100 m m KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4에에서 M-280, 상자성 구슬 희석 )는 채널에. 구슬 thiol 표시 끝 통해 SMCC 코팅 표면에 움직일 biotin 표시 된 DNA 분자에 바인딩할 수 있도록 10 분 동안 품 어. 부드럽게 씻어 표준 반응 솔루션의 200 µ L를 사용 하 여 취소 닿는 구슬.
        참고: M-280 구슬 표시 M-270 같은 다른 상업 자석 구슬을에 비해 표면에 더 낮은 일반적인 바인딩.
    2. 현미경 무대에 채널을 탑재. 기름 침수 목표 X 100을 사용 하 여 바닥 표면에 구슬에 대 한 검색.
    3. 참조 구슬 표면에 및 이동 테더 구슬 선택합니다. 참조 구슬과 다른 defocus 비행기에 닿는 구슬의 초기 이미지 라이브러리 구축.
    4. 구슬 이미지의 보정
      1. 실험 전에 사용 하 여 객관적인 압 전 액츄에이터 참조와 두 개의 별도 비드 이미지로 저장 되는 20-50 nm, 의해 다른 defocus 비행기에 닿는 구슬의 이미지 라이브러리와는 각각 defocus 거리 ( 그림 2D) 색인.
    5. x, y, z 위치 결정
      1. 실험, 동안 구슬 중심에 의해 x-y 평면에서 구슬의 위치를 결정. 라이브러리에 저장 된 현재 구슬 이미지를 비교 하 여 닿는 구슬의 높이 변화를 확인 합니다. 구슬 이미지 16의 푸리에 변환의 파워 스펙트럼의 자동 상관 함수 분석 사용.
    6. 안티 드리프트 피드백 참조 비드를 사용 하 여
      1. 실험 동안에 피를 사용 하 여 " 잠금 " 목표와 낮은 주파수를 통해 라이브러리에 저장 된 특정 참조 구슬 이미지 사이의 거리 피드백 제어, 걸린된 구슬 이미지 ( 그림 2D) 라이브러리에 저장 된 특정 이미지와 가장 상관 관계는.
    7. 는 밧줄을 적용 하 여 단일 dsDNA 분자 인지 확인 ~ 65 pN 포스는 밧줄 전환 17 ,를 잡아당기고 특성 DNA 경우 단일 dsDNA 분자 결정 18 , 19. 단일 dsDNA 밧줄을 찾을 때까지 과정을 반복. (강제로 교정 및 전환 잡아당기고 DNA에 대 한 다음 섹션을 참고 하십시오).

4. 마그네틱 핀셋 강제로 교정

  1. 직접 통해 비드 동요를 사용 하 여 긴 DNA (48,502 bp λ-DNA) 분자 힘 (최대 100 pN) 결정:
    figure-protocol-6141
    , 여기서 k B는 볼츠만 상수, T는 켈빈 규모에서 온도, δ 2 y 구슬 변동 자기장 및 힘에 수직 방향으로 분산 방향입니다. 이 방향에서는, 구슬의 모션 l + r 0, 어디 l DNA의 힘 방향 (확장)에 따라 엔드-투-엔드 거리 이며 r 0의 길이 가진 진 자 변동으로 기술 될 수 있다 구슬 10 ( 그림 3A)의 반지름.
  2. 결정 자석 구슬 거리의 기능으로 힘 F에 대 한 교정 커브 d, 그리고 F (d) 긴 λ-DNA를 사용 하 여 다른 구슬에 대 한. 일반적으로, 자석과 coverslip 사이의 거리는 사용 DNA 밧줄 길이 무시 될 수 있습니다. 맞게 F-이중 지 수 감퇴 기능에 d 커브:
    figure-protocol-6798
    , 어디 피팅 매개 변수 α1, α2, γ1, γ2에 의해 결정 됩니다는 마그네틱 족집게와 매개 변수 C 자석 구슬의 다른 유형의 속성에 의해 결정 됩니다. C, F를 이동 하 여-d 곡선 다른 구슬에서 얻은 겹쳐 10 ( 그림 3B) 될 수 있습니다.
  3. 짧은 DNA에 대 한 개별 자성 구슬에 대 한 매개 변수 C의 교정 실험.
    1. 코너 주파수 보다 높은 주파수에서 구슬 위치 기록 요구는 변동에 따라 힘을 결정:
      figure-protocol-7243
      γ 끌기가, 구슬의 계수입니다. 높은 힘에 짧은 DNA에 대 한 100 Hz 보다 더 빨리 녹음 주파수를 요구 한다, 따라서, 힘 없는 직접 측정 변동에 따라 카메라와 함께. 그러나 C 낮은 것에 힘을 측정 하 여 결정 될 수 있다 매개 변수 범위를 강제 하는, (< 15 pN) 동요를 사용 하 여 및 피팅 데이터 보정 F-d 매개 변수 C 20를 곡선.
    2. 또는 dsDNA 실험, 결정 매개 변수 C의 힘에 과도 잡아당기고 DNA를 사용 하 여 ~ 65 pN ( 그림 3C) 21 , 22 , 23는 dsDNA 보였다 확장 점프 (0.6 X 윤곽선 길이 길이 증가)에서 d 위치를 기록 하 여. 매개 변수 C를 결정 한 후 테더 구슬에 대 한 힘을 산출 하십시오.
  4. F (d)의 역 기능을 통해 자석의 움직임을 프로그래밍 하 여 로딩 속도 제어. 자석 더블 샘플 기 하 급수적으로 접근 해야 합니다.
    참고: 이러한 추정 방법 결정 하는 힘의 상대 오차는 ~ 10%, 구슬 반경이 20에 의해 주로 발생 하는 고.

5. 단일 분자 조작 g 4의 존재와 부재의 바인딩 단백질

  1. 0.2 pN/s 뒤의 로딩 속도에 힘 증가 검색 수행 힘 램프 실험
    1. dsDNA 밧줄을 확인 후에 -0.2에서 강제로 사망 스캔 pN/s. 각 스트레칭 주기 후 30 1 pN에서 DNA 분자를 잡고 G4 refold를 ssDNA 있도록 s.
  2. 포스 점프 실험
    1. 30 54 pN 사이 힘 주기 s는 접힌된 G4 접힌, 수 고는 접힌된 G4-15T refold 수 60 대 1 pN.
  3. 흘러 내린 단백질 해결책
    1. 흐름 단백질 해결책에서 때 ~ 하는 coverslip 구슬의 첨부 파일을 피하기 위해 20 pN 힘. G4 구조에 높은 특이성을 보여주었다, DEAH 상자 RHAU helicase 사용된 24 했다. 초파리 melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase 재조합 대장균에 표현 하 고 앞에서 설명한 25 정화 했다. DmRHAU의 풀기 활동 tetramolecular G4 DNA 기판 13에 분석 되었다 G4.
  4. Matlab 프로그램 14 작성 한 사내를 사용 하 여 전개 힘 분석.

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결과

단일 G4 분자 스트레칭을 위한 실험 설정 그림 4에 표시 됩니다. 두 dsDNA 핸들 사이의 스팬 단일 가닥 G4 형성 시퀀스는 coverslip 상자성 구슬 사이 곁에 했다. 단일 dsDNA 테더 비드를 찾으려면 overstretching 분석 결과 일정 로딩 속도로 힘을 증가 하 여 수행 되었다. 세 가지 유형의 측정 접는 공부 하 고 생체의 전개를 위해 자주 사용 했다: (i) 지속적인 힘 측...

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토론

G4 DNA의 기계적 안정성을 공부 하 고 g 4를 사용 하 여 단백질의 상호 작용을 위한 플랫폼 위에서 설명한 대로 단일 분자 자석 족집게 보고 됩니다. 플랫폼을 동반, G4 DNA 밧줄, 그리고 접는 전개 역학의 측정과 나노미터 특별 한 해상도와 G4 구조의 안정성을 찾는 매우 효율적인 프로토콜 개발 된다. 초점면 잠그기를 통해 g 4 같은 작은 구조 전환이 감지에 대 한 중요 한 매우 안정적인 안티 드리프트 ?...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 원고를 교정에 대 한 멩 팬을 감사 합니다. 이 작품은 지원에 의해 싱가포르 교육부의 교육 학술 연구 기금 계층 3 (MOE2012-T3-1-001) 재; Mechanobiology 연구소 싱가포르 재;를 통해 연구 재단 국립 연구 재단, 총리의 사무실, 싱가포르, 그것의 NRF Investigatorship 프로그램 (NRF Investigatorship 수상. NRF-NRFI2016-03 재; H. y 중앙 대학 (2017KFYXJJ153)에 대 한 근본적인 연구 기금.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA PCR primersIDTDNA preparations
DNA PCR chemicalsNEBDNA preparations
restriction enzyme BstXINEBR0113SDNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)BMH.BIOMEDIA72204flow channel preparation
Decon90Decon Laboratories Limitedflow channel preparation
APTESSigma440140-500MLflow channel preparation
Sulfo-SMCCThermoFisher Scientific22322flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidinThermoFisher Scientific11205Dflow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μmPolysciences, Inc17145-5flow channel preparation
2-MercaptoethanolSigmaM6250-250MLflow channel preparation
Olympus Microscopes IX71OlympusIX71Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721Physik InstrumenteP-721Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100XOlympusMPLAPON-Oil 100XMagnetic tweezers setup
CCD/CMOS cameraAVTPike F-032BMagnetic tweezers setup
Translation linear stagePhysik InstrumenteMoCo DCMagnetic tweezers setup
LEDThorlabsMCWHLMagnetic tweezers setup
Cubic MagnetsSupermagneteMagnetic tweezers setup
LabviewNational InstrumentsMagnetic tweezers setup
OriginPro/MatlabOriginLab/MathWorksData analysis

참고문헌

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