Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

요약

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

초록

호 중구 extracellular 함정 (그물)의 존재를 정의 하는 데 사용 하는 기본 방법 confocal 현미경 검사 법 이다. 우리는 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠) 시각화 설립된 confocal 현미경 검사 법 방법 수정 했습니다. 이러한 extracellular 함정과 립 프로 테아 제, citrullinated 히스톤, peptidyl arginase deiminase (패드) 등 다른 부품의 공동 식 extracellular chromatin의 존재에 의해 정의 됩니다. 메츠의 식은 일반적으로 자극에 노출 후에 측정 하 고 유엔 자극 샘플에 비해. 샘플 배경 및 isotype 제어에 대 한 포함 됩니다. 셀 잘 정의 된 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. Confocal 현미경 검사 법 메츠의 존재를 정의 하는 데 사용할 수 있습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 조직에.

서문

호 중구 extracellular 함정 (그물), Brinkmann 외. 에 의해 처음으로 설명 했다 ¹ 그들은 주로 (특히 박테리아)에 감염에 대 한 응답에서 생산 되 고 호스트 방어^1,2에서 중요 한 역할을 했습니다. 그들은 또한 맥과 반성 루 푸 스 (SLE);를 포함 하 여 비 전염 성 질병에 응답에 설명 되었습니다. 그리고 물질 phorbol 12-myrisate 13-아세테이트 (PMA)^2,3. 그것은 최근에 다른 세포 유형 대 식 세포를 포함 한 extracellular 함정 생산 또한 수 있습니다 인식 하고있다. 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠)는 아직 문학^4,5에서 잘 정의 된 엔터티. 우리는 최근 설립 메츠의 존재를 감지 방법을 생체 외에서 그리고 vivo에서^6,7. 이 문서에서는, 메츠 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정을 설명 합니다.

(Apoptosis⁸) 같은 다른 세포질 통로에서 그것을 구별 하는 NETosis의 주요 특징은 함께에서 chromatin의 압출: 히스톤 (H3Cit)⁹(1) citrullination, (2)과 립 프로 테아 제^{10의 공동 식} , peptidyl 아르기닌의 deiminase (패드) 4의 (3) 참여^11,12. 대 식 세포는 또한 H3Cit과 립 프로 테아 제, 그리고 패드, 표현 하 고 이러한 기능 메츠의 존재를 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메츠는 대 식 세포는 폐 포와 폐의 기도에 있는 지배적인 셀 고 감염/염증 세포 면역 반응을 지시에 초기 역할이 폐, 특히 중요 한 역할을 할 수 있습니다. 또한, 폐의 대부분은 빈 공간 (예를 들어,는 폐 포 내), 메츠 잠재적으로 단단한 장기와 달리 사용 가능한 공간으로 확장 수 있습니다.

그물의 존재를 정의 하는 가장 널리 사용 되는 방법은 confocal 현미경 검사 법입니다. 있다 아직 메츠를 측정 하는 명확 하 게 정의 된 방법. 그물의 측정에 대 한 기술이이 프로토콜에 메츠의 존재를 측정 하는 적응 하고있다. 이 메서드에 대 한 주요 요구 사항 분석 confocal 현미경 검사 법 및 적절 한 이미징 소프트웨어에 액세스할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 승인 하는 실험을 다음과 같이: (1) 윤리 위원회의 모나 쉬 의료 센터, 멜버른 대학교의 윤리 위원회에 의해 (2) 동물에 의해 인간.

1. Bronchoalveolar 게 (BAL) 세포

1. 에 폐 세포를 사용 하 여 발: (1) 인간의 내부 tracheal 포부를 사용 하 여 상계 ⁶, 및 (2) 마우스 과목 ¹³ .
   참고: 대 식 세포의 인수는 일반적으로 이러한 세포의 일부 활성화를 발생합니다. 대 식 세포는 잠재적인 의료 문제를 조사 하는 상계를 필요로 하는 환자에서 얻은 고 모든 과목 (이 각 개별 프로젝트에 대 한 결정을 해야 합니다) 메츠의 분석에 적합 있을 수 있습니다.
   1. 발 솔루션 및 회전 (10 분 동안 500 x g) 감소 형태로 펠 릿, 문화 매체 (로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 5% 태아 종 아리 혈 청 및 1 %L-글루타민), 실내 온도에 두 번 세척 및 다음 셀 문화 메디의 4 mL에 희석 음.
   2. 필요한 경우 요청 정식 차동 수; 세포의 대부분 (일반적으로 > 80%) 대 식 세포 ⁶ 됩니다.
      참고:이 일반적으로 의해 수행 됩니다 다른 세포 유형 ⁶의 morphologic 모양을 사용 하 여 임상 조직학 서비스.
   3. 수행 가능한 대 식 세포 세포 Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 발 솔루션에 셀.
      참고: 발 솔루션 단계 1.1에서에서 설명 했 듯이 인간과 쥐에서 얻은입니다.
   4. 추가 1-4 × 10 ⁵ 대 잘 두고 당 문화 매체의 500 µ L에서 coverslips에 24-잘 접시를 37 ° C에서 하룻밤; 세포는 coverslips를 준수 합니다. 인간의 샘플에 대 한 항생제를 추가 (예: 페니실린, 스, 10 ⁴ U/mL) 세균 오염을 방지 하기 위해.

2. 발 대 식 세포의 면역 형광 검사 레이블/현미경

참고: 위에서 언급 한 세포 coverslips에 준수.

1. 문화 매체를 제거 하 고 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)을 한 번 씻어. 10 분에 대 한 2 %paraformaldehyde / periodate/lysine (PLP) 정착 액 셀 수정
2. PBS, 짧게 셀을 세척 하 고 0.2 %permeabilize에서 다음 20 분에 대 한 PBS에 트윈 20
3. 10%에서 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 30 분에 대 한 PBS에 희석 치킨 세라 블록 셀
4. 품 주 및 isotype 제어 항 체 37에서 1: 100 농도 (자세한 정보는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 실 온에서 1 h에 대 한 ° C.
   참고: 벨 샘플에 대 한 대 식 세포의 특정 마커 일반적으로 필요 하지 않습니다.
5. 기본 항 체의 추가 후 PBS, 셀을 세척 하 고 실 온에서 40 분 동안 해당 보조 항 체와 더 품 어.
6. PBS에 마운트 장착 DAPI 기반 매체 레이저 업무가 647, 561, 488, 405 nm와 40 X (듯이) confocal 현미경을 사용 하는 시각화에 대 한 섹션을 세척, 1.0 나 오일 목표.

3. 폐 조직 샘플

참고: vivo에서 연구의 폐 조직, 관련 노출 후 샘플을 연구 (예를 들어, O에 의해 설명 된 대로 ' 설리반 외. ⁷).이 실험에 대 한 가장 관련성이 높은 노출은 감염 성 미생물, 특히 세균. 이 메서드에 사용할 수 있는 마우스 종자는 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스, 10-12 주 오래 된, 무게 25 ~ 30 g, 및 남성.

Euthanize 쥐, 케 타 민 (400 mg/kg) 및 xylazine (40 mg/kg)의 복 주사를 통해

. 흉 강 열고 폐와 심장 외과 집게와가 위를 사용 하 여 노출 합니다.
1. 따뜻한 PBS 30 혈관에서 피를 우 심 실에 21-게이지 바늘을 사용 하 여 달 이다 s, 다음 30 2 %PLP 정착 액 10 mL를 주입 (우 심 실)에 s.
2. 오픈 흉 게를 따뜻한 PBS (42 ° C)를 사용합니다. 21 게이지 바늘와 0.8 m m 튜브 크기, 컷의 조각 기도 넣어야 하 고 주사 (42 ° C)를 미리 데워의 800 µ L, 3 %agarose 솔루션 포인트 낮은 녹는.
3. 넥타이 꼰 실크 (4.0 USP) 기관에서. 기도, 정의 삽입 지점 바로 아래 주위 스레드 놓고 간단한 overhand 매듭을 통해 그것을 보호 합니다. agarose를 공고히 폐 주위 얼음 처럼 차가운 PBS를 관리 합니다. 가 위 및 무딘 해 부를 사용 하 여 흉 강에서 블록으로 폐 및 심 혼을 제거 합니다. 개별적으로 각 폐를 제거 하 고 다음 16 h 2에 대 한 수정 %PLP 또는 말린 4 ° c.
4. 조직 단면까지 4 ° C에서 PBS에는 표본을 저장합니다. 폐 조직을 얻기 위해 이러한 방법은 앞에서 설명한 ¹³ 되었습니다.
1. 폐 조직 준비 샘플 사용 다음 단계.
2. 10% 천연 버퍼링 말린 실 온에서 24 h에에서 수정 폐 조직 (3.1 단계에서 절제) 조직
   . 75% 에탄올으로 전송 및 12 h 주기, (2.5 h 75 %EtOH, 절대 EtOH 3 h, 내용 제 3B, 그리고 파라핀에 3 h 3.5 h) 조직 프로세서에 넣어.
   1. 소스를 실내 온도에 저장 되는 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 블록을 만드는 표준 파라핀에.
      참고:이 단계에서 그것은 일반적으로 표준 슬라이드 폐 섹션을 잘라 편리한.
   2. FFPE 폐 섹션 4-5 µ m 두께 톰을 사용 하 여 자르고 충전, 코팅된 슬라이드 o 설명 이전에 마운트 ' 설리반 외. ⁷
   3. 슬라이드 마운트, 60 mm x 24 mm coverslips (크기 1.5)에 장착 매체의 3 방울을 넣어, 반전 하는 coverslip에 슬라이드 및 초과 매체 밖으로 밀어. 밀폐 매니큐어와 함께 밀봉 하 고 상 온에서 저장.

4. 폐 조직 샘플의 준비/현미경

1. 드 왁 스 rehydrate, 항 원 검색 솔루션 FFPE 폐 조직 샘플을 pretreat.
   1. 오븐 건조는 FFPE 60 ° c.에서 60 분에 대 한 슬라이드 다음 실 온에서 5 분 동안 70% 에탄올 솔루션 30 분 및 전송 자일 렌 용액에 슬라이드를 넣어. 수돗물에 씻어.
   2. 장소 열 플라스틱 랩에 여기 원 검색 10에서 10 분 압력 밥 솥에 따라 m/mol/L 트리 스, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 분, 로커에 다음 한 번 PBS를 가진 로커에 대 한 수도 물에 두 번 20 분 세척에 대 한 멋진.
   3. 블록 5%에서 10% 닭 혈 청 실 온에서 30 분 동안 BSA/PBS.
2. 조직 얼룩.
   대 식 세포에서 메츠를 정의 1%에 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)을 추가
   1. 1/100 희석 (항 체 금액에 대 한 특정 정보는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 4 ° C에서 16 h BSA/PBS. 로커에 5 분에 대 한 PBS를 가진 두 번 세척.
   2. 해당 보조를 가진 외피에 의해 달성 형광 탐지 항 체 1 %BSA에서 / PBS 실 온에서 40 분. 항 체는: (1) 닭 안티 마우스 488 (녹색), 닭 (2) 항 염소 594 (빨간색), 및 (3) 당나귀 반대로 마우스 647 (빨간색까지).
   3. PBS에 마운트 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 설치 매체 DAPI 포함 된 섹션을 세척.
3. Confocal 레이저 스캐닝 머리는 거꾸로 한 현미경에 부착 된를 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.
4. Excite와 405, 488, 561, 647 준비
   nm의 레이저 라인 연속 클릭 하 여 단일 면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처, 버튼 (2 라인 평균) 20 X 0.1을 사용 하 여 평준화 나 공기와 40 X 1.0 나 석유 목표.
   1. 얻을 각 결과 (즉, 10 고 전력 분야의 보기 (HFOV) 10 자극된 샘플, 등, 각 마우스 컨트롤에 대 한)에 대 한 데이터 및 분석에 대 한 섹션 당 적어도 10 시야.
      참고: 전체 분야의 대표적인 샘플을 얻기 위해 매트릭스 시스템 사용할 수 있습니다 필드 분할 하는로 다른 섹션 같은 매트릭스 보기의 필드를 선택 하는 각 서로 다른 샘플에 대 한 (예를 들어, 필드 9 섹션으로 분할 될 수 있다 그리고 센터 4 모서리에서 두 HFOV 찍힌다).

5. 3 차원 (3 차원) 이미징의 메츠

참고: 메츠는 3 차원 구조, 여러 z-스택 취 함으로써 이미지를 재구성 하는 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다.

1. 1.8 m m와 0.1-0.5의 속도 설정 진폭에는 vibratome를 사용 하 여 200 µ m에서 파라핀 블록에서 폐 표본 섹션 m m/s.
2. 각각 혈 청 (10% 태아 종 아리 혈 청 및 10% 닭 혈 청)의 20%와 폐 조직 차단 하 고 보충 하는 PBS에 3.75 %permeabilize 다음 부드러운 동요에서 실 온에서 7 h에 대 한 Triton X 100.
3. Microcentrifuge 튜브 (항 체 농도 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 200 µ L 볼륨에 관련 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)와 4 ° C에서 16 h에 대 한 섹션을 얼룩.
4. 1 헤에 대 한 실 온에서 관련 2 차 항 체와 함께 배양 하기 전에 10 분 동안 3 번 PBS에 섹션을 씻어
5. PBS에 슬라이드는 현미경 커버 전표를 추가 하기 전에 20 분 동안 솔루션에 폐 섹션 DAPI (1:5, 000)에 대 한 얼룩.
6. 형광 이미지를 거꾸로 confocal 현미경 (40 x 1.3 없음) 405 장비를 사용 하 여 얻을 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm, 그리고 635 nm 레이저.
7. 기록 최적의 z 40 x 1.3 나 오일 목표에 대 한 단면 0.54 µ m 두께의 3 차원 z-스택.
   참고: 사용 하는 소프트웨어는 개별 현미경 따라 달라 집니다. 소프트웨어를 사용 하 여 한 현미경에는 어떻게 예를 들어 보조 파일 1에 제공 됩니다.

6. 분석 이미지

참고: 특정 이미징 분석 소프트웨어의 사용을 필요로 하는 샘플의 분석 및 예제 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 결과의 분석은 사용 하는 특정 프로그램에 따라 달라 집니다, 하는 동안 아래 나열 된 점은 중요 하다.

1. DAPI 위한 파랑 채널을 선택 하 고 셀에 대 한 최소 크기를 지정 하 여 분석의 발 샘플
   1. 정의 대 식 세포의 수 (예를 들어, > 18 µ m 직경에서). 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정 필드 당 세포의 총 수.
   2. 다른 마커 (예를 들어, MMP12, PAD2, 및 H3Cit)의 공동 식 DAPI에서 검색 하는 extracellular chromatin의 존재에 의해 메트로의 기능을가지고 있는 셀의 수를 세.
      참고: 분석 될 수 있는 마커 수 레이저를 사용할 수의 수에 따라 달라 집니다 하지만 이상적으로 DAPI, 뿐만 아니라 다른 마커를 두 개 이상 포함 되어야 합니다. 다른 메트로 식 (예를 들면, extracellular chromatin와 진된 핵 세포의 수)에 대 한 특정 매개 변수를 덜 사용할 수 있습니다.
   3. 발에 메트로 식 비교 (는 제어, 연기, 연기/DNase 처리 그룹 사이), 샘플 분석 샘플 당 100 발 세포의 최소.
   이차 항 체 isotype 측정 하
   4. 형광의 수준을 제어; 그들의 형광에 대 한 각 샘플에서 100 셀의 최소 측정. 각 마커를 (예를 들어, H3Cit)에 대 한 배경 형광의 평균 수준을 측정 표준 소프트웨어를 사용 하 여.
   5. 메트로 식을 정의를 전형적인 형 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9 공동 식 extracellular chromatin)와 셀 그리고 각 메트로 대 한 마커 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9)의 형광의 수준을 측정. 셀 배경 및 isotype 컨트롤 위에 아니었다 그들의 얼룩이 메츠 생산 제외.
   6. 인간의 발 샘플에 대 한 최소 100 셀 하 메츠는 대 식 세포의 비율에 대 한 각 샘플에 대 한 분석. Murine 샘플에 대 한 셀은 작은 고 메츠 힘들어 하 정의 분석 (예를 들어, 200 대) 각 샘플에 대 한 셀 수.
2. 폐 조직 샘플의 분석
   1. 폐 조직에 메츠의 존재를 확인 하려면 F4/80 등 특정 macrophage 마커.
   2. 섹션 6.1에에서 나와 다른 매개 변수와 함께 extracellular chromatin를 표현 하는 셀에서 F4/80의 공동 지역화를 사용 하 여 폐 조직에 메츠의 존재를 정의.
   3. 이차 항 체와 샘플에 배경 형광의 수준과 isotype 컨트롤을 결정합니다. 배경 위에서 하지 않은 분석에서 제외 하는 메츠.

결과

메츠는 발 샘플, 폐 조직 및 3 차원 이미지와 두꺼운 폐 섹션에서에서 구상 될 수 있습니다. 발 샘플 시각 메츠의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 메츠의 형태는의 성숙의 단계에 따라 달라 집니다. 현미경에 첫 번째 감지 기능은 셀의 가장자리에 핵의 운동 이다. 이것은 H3Cit 및과 립 프로 테아 제와 같은 다른 공동 표현된 중재자와 extracellular chromatin 옵니?...

토론

이 리뷰에서 설명 하는 방법을 기반으로 그물¹⁴의 존재를 정의 하는 데 사용 되는. 대 식 세포는 지금까지 발 샘플에서 지배적인 셀 형식이 고 컬렉션의이 방법은 특히 메츠 공부에 대 한 적합 한. 적혈구는 발에 존재 하는 경우이 셀 염화 암모늄을 사용 하 여 lysed 한다. 발 절차 일반적으로 대 식 세포를 활성화 하 고 따라서 메츠 취소 자극 샘플에 있을 것으로 예상 된다. 발 대 식...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12	Novus Biological	NB110-57214	1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9	Novus Biological	AB119906	1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2	Abcam	AB16478	7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE	LifeSpan Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9	Abcam	AF909	10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)	Abcam	AB5103	10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80	In-house (hybridoma)	In house	20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE	Sapphire Bioscience	LS-B4244	25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4	Abcam	AB128086	10.1 ug/ml
Super-frost plus slides	Menzel	S41104A
Dapi-prolong gold	Molecular probes	P36931
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	85111
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	E9434
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/	Life technologies	A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594	Life technologies	A-21442
Chicken anti-goat AF 594	Life technologies	a-21468
Chicken anti-mouse AF488	Life technologies	A-21200
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11018
Chicken anti-mouse AF 647	Life technologies	A-21463
Donkey anti-sheep AF 594	Life technologies	A-11016
Isotype control
Rabbit IgG	In house
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG1	BD Bioscience	550878
Rabbit IgG	In house
Mouse IgG2a	BioLegend	400201
Sheep IgG	In house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software Programs
Imaris	Bitplane
Image J	NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope	Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope	Olympus
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media
RPMI	Sigma-Aldrich	r8758
Fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
Sudan black	Sigma-Aldrich	199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	Sigma-Aldrich	27387
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Ketamine	Sigma-Aldrich	K2753
Natural formalin	Sigma-Aldrich	42904
Paraffin	Sigma-Aldrich	327204
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576
Solvent 3B	Hi-Chem	2026
Coverslips 12 ml	Sigma-Aldrich	S1815
Coverslips 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	C6875
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
c57 black 6	Monash animal research platform (MARP)
BALB/c	MARP