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요약

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

초록

마지막 십 년간에서 Alzheimer의 질병 (광고) 등 파 킨 슨 병 (PD), 신경 장애의 보급은 성장 했다. 이 나이 관련 무질서는이 환자의 두뇌에 있는 fibrillary 구조 단백질의 모양 특징. 일반적으로 수용 성 단백질을 받을 이유는 정확 하 게 집계 프로세스를 제대로 이해 남아 있습니다. 발견 단백질 집계 질병 프로세스에 국한 되지 않습니다 정상적인 노화 과정의 일부 단백질 집계, ectopically를 사용 하지 않고 조절 분자 및 세포 메커니즘의 연구를 활성화 하는 대신 인간의 표현 질병 관련 단백질입니다. 여기는 상호 보완적인 접근 방식을 통해 꼬마 선 충 에서 고유의 단백질 집계를 검토 하는 방법론에 설명 합니다. 첫째, 우리 세 동물을 얻을 나이 동기화 C. 선 충 의 많은 성장 하는 방법을 검토 하 고 우리는 매우 불용 성-큰 집계 분리 하 생 화 확 적인 절차를 제시. 대상된 유전 최저와 함께, 그것은 홍보 또는 양이 많은 질량 분석 어느 포괄적인 분석을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 방지에 관심사의 유전자의 역할을 해 부 수 또는 후보-기반 항 체와 분석입니다. 이러한 결과 다음 형광 태그 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물 vivo에서 분석에 의해 확인 됩니다. 이러한 메서드는 특정 단백질은 나 이와 함께 집계 및 궁극적으로 완전 한 기능이 단백질을 유지 하는 방법 하는 경향이 이유를 명확히 하는 데 도움이 됩니다.

서문

단백질 misfolding 및 집계 AD, PD, 루 경화 증 (ALS), frontotemporal 치 매 (FTD), 그리고 많은 다른 같은 여러 신경 퇴행 성 질환의 특징으로 인식 됩니다. 예를 들어, 녹말 체 소에 α-synuclein 어셈블리는 악화 모터 신경에 있는 양식 세포질 집계에 ALS 환자 TDP-43 또는 FUS misfold에 PD 환자의 substantia nigra에 특히 Lewy 몸으로 축적. 각 이러한 신경 퇴행 성 질환, 단백질 항상성 또는 proteostasis를 유지 하는 메커니즘 질병에 따라서 선도 misfolded 단백질의 축적을 방지 하기 위해 실패 합니다.

Proteostasis 세포 기능을 보장 하기 위해 중요 한 이며, 정상적인 조건 하에서 이러한 규제 메커니즘 단단히 단백질 합성, 접는, 그리고 성능 저하의 속도 제어 합니다. 여러 연구 결과 입증 노화, 수 많은 세포와 장기의 단백질 항상성 유지가 점차적으로 손상 된과 나이 proteostasis 네트워크의 생리 적 저하는에 대 한 중요 한 악화 요인 신경 퇴행 성 질병 (참조1,2,3검토). 사실 단백질 품질 관리 및 펼친된 단백질 스트레스 세포 응답 나이 손상 단백질 misfolding 및 집계 노화의 일반적인 결과 수 제안 합니다. 사실, 우리와 다른 증명 단백질 집계는 질병을 제한 하 고 대신는 프로테옴의 일부 세 동물4,,56,7 세제 불용 성 높게 된다 ,8,,910. 계산 그리고 vivo에서 분석 이러한 생리 연령 관련 집계 여러 측면5질병 집계 닮은 밝혔다. 내 인 성, 연령에 따라 단백질 집단의 발견 우리 ectopically 표현된 인간의 질병 관련 단백질을 사용 하지 않고 단백질 집계, 조절 분자 및 세포 메커니즘을 해 부를 기회를 제공 합니다. 현재, 제한 된 정보만 광범위 한 단백질 용해성의 규칙에 대 한 고 생물의 건강에이 dysregulation의 효과 대 한 존재합니다.

선 충 C. 선 충 이 동물 상대적으로 짧은 수명이 있고 더 높은 유기 체에서 관찰 된 많은 특성 에이징 기능을 표시 조사를 노화에서 가장 광범위 하 게 연구 모형 유기 체 중 하나입니다. 용해성 단백질에 노화의 효과 추출 질병 집계 neurodegeneration 연구11의 분야에서 널리 이용 되는 차동 용 해도에 따라 순차 생 화 확 적인 분류에 의해 C. 선 충 에서 연구 . 양이 많은 질량 분석에 의해 몇 백 단백질 집계-경향이 된다 C. 선 충 에 질병5의 부재를 보였다. 여기 우리가 자세히 설명 액체 문화와 서쪽 오 점 하 여 질량 분석 및 분석 하 여 정량화에 대 한 집계 된 단백질을 순차 추출에 벌레의 많은 수를 성장 하는 프로토콜. 집계 하기 쉬운 단백질을 misfolded 세에 축적 하기 때문에 다른 체세포 조직5,,1213에 선 충 C. 생식 선 및 마스크 변경, 우리를 사용 하 여 생식이 돌연변이 단백질 분석 초점 비 생식 조직에 용해성입니다. 제시 하는 방법에는 0.5 %SDS 불용 성 및 상대적으로 낮은 원심 속도 의해 수송과 매우 불용 성, 큰 집계 분석 수 있습니다. 또한 작고 더 녹는 집계 수집 하 덜 엄격한 추출 프로토콜 또는 되었습니다 다른 곳에서10출판. 또한, 집계에서 vivo에서 C. 선 충에 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

전반적으로, RNA 간섭 (RNAi)와 함께에서 이러한 메서드는 연령에 따라 단백질 집계 변조에 관심사의 유전자의 역할을 평가할 수 있다. 이 대 한 우리와 RNAi를 사용 하 여 관심사의 특정 단백질의 분해 없이 젊고 세 벌레에서 추출의 분석을 설명 합니다. 이러한 메서드는 단백질 용해성을 조절 하는 proteostasis 네트워크의 구성 요소를 결정 하는 강력한 도구 이어야 한다. 여러 중재와 같은 감소 인슐린/인슐린 같은 성장 인자 (IGF)을 극적으로 선 충 C. 노화14지연 표시 1 신호 (IIS). 장 수 경로 종종 단백질 품질 관리 메커니즘을 유발 하 고 따라서 이러한 경로 수 적극적으로 영향을 미치는 수 단백질 집단의 속도. 예를 들어, IIS 경로7의 억제에 따라 수명이 긴 동물에 감소 고유의 단백질 집합을 설명합니다.

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프로토콜

참고: 절차의 더 나은 이해에 대 한 워크플로 (그림 1)의 회로도 연결 됩니다.

1. 영의 큰 숫자와 세 C. 선 충 의 성장 대상이 RNAi를 대상으로 관심의 유전자

참고: 사용 C. 선 충 살 균 온도 유도 gon-2(q388) 돌연변이 (CF2253) 큰 세 동기화 인구를. 모든 단계는 화로와 반 메 마른 조건 하에서 작동 하 고 아무 오염 균 류 또는 박테리아) (예를 들어와 있는지 확인이 중요 하다. 온도 설명 되지 않은 경우에 실 온에서 (또한 centrifugations) 단계를 수행 합니다.

  1. 생식이 동물을 얻기 위해 C. 선 충 gon-2(-) 돌연변이 체의 준비
    참고: 무 균 동물 생식 선 부족을 얻으려면, 손실의 기능 돌연변이 해야 합니다 유도 될 부모 동물에 마지막 애벌레 단계 (L4)이 이동 하 여 25 ° C에 모성 기여를 피하기 위하여.
    1. 온도 변화에 대 한 부모의 세대 수집 gon-2(-) 동물의 첫 번째 확장
      1. 행진 대장균 OP50 Lysogeny 국물 (파운드) 접시에 변형 하 고 37 ° c.에 그것을 밤새 품 어
      2. 다음날 200 mL LB 매체 1 OP50 클론으로 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 그것을 품 어
      3. 다음 날 씨 15 높은 성장 (HG) 중간 접시 (직경 9 cm) 0.5 mL OP50와 함께 주걱으로 OP50를 배포. 이틀 동안 실내 온도에 번호판을 유지.
      4. Gon-2(-) 동물 (하지 지난 2 세대에 대 한 굶 어) OP50으로 시드 15 HG 중간 접시에 청크 고 판 성인 confluent 일부 OP50는 계속 사용할 수까지 20 ° C에서 그들을 유지 합니다.
      5. 한편, 씨 60 HG 중간 접시 OP50에 설명 된 대로 1.1.1.3 단계와 실내 온도에 번호판을 유지. 조심: 시드 판 하지 지켜져야 한다 1 주일 이상으로 한 실 온에서 균열 것입니다.
      6. 대부분의 성인으로 앞에서 설명한15알을 낳 기 시작 confluent 번호판을 표 백제. 두 개의 15 mL 튜브에 계란을 수집 하 고 20 ° c.에 하룻밤 nutating 믹서에
      7. 다음 날 씻어 M9 버퍼 (85 m m NaCl, 42 m m 나2HPO4·7H2O, 22 mM KH2포4) L1s를 부 화: 30 s, 폐기 상쾌한, 그리고 M9와 15 mL 마크까지 채우기 위한 3000 x g에서 원심 분리기. 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 1.1.1.6 단계를 반복 합니다. M 9와 15 mL 마크까지 결과 벌레 알 약으로 튜브를 채우십시오.
      8. 시드 비 한 접시에 2 µ L 상품에 L1s를 계산 하 여 해 부 현미경으로 L1s의 총 수를 평가 합니다. 적어도 9 개의 방울에서 얻은 숫자를 평균.
      9. L4 단계까지 20 ° C에 시드 HG 접시 고 벌레 성장 당 6500 L1s를 추가 합니다.
    2. 생식이 동물 실험에 대 한 얻으려면 gon-2(-) 동물의 두 번째 확장
      1. 그들은 알을 낳 기 시작 하 고 L1s는 부 화 될 때까지 L4 단계에서 단계 1.1.1.9 25 ° C에서에서 벌레를 이동 합니다.
      2. 침전에 의해 계란과 L1s의 컬렉션
        참고: 후에 25 ° C에 온도 변화, 그것은 부드러운 기법으로 침전을 사용 하 여 성인에서 깨지기 쉬운 계란과 L1s를 분리 하는 것이 바람직.
        1. 5 접시 당 5 mL m 9를 사용 하 여 M9 가진 격판덮개를 세척 하십시오. 50 mL 튜브에 벌레를 전송 합니다.
        2. 모든 튜브와 M9 45 mL 마크를 위로 채우십시오, 약 10 분 동안 성인 퇴적 하 게 50 mL 튜브에 각 상쾌한을 수집 하 고 펠 릿으로이 단계를 반복. 1 분 동안 3000 x g에서 계란 및 L1s를 포함 하는 상쾌한 원심, 약 10 분, L1s 앙금 시키고는 상쾌한 15 mL 남아 때까지 제거.
          참고:이 중요 한 단계입니다. 가능한 많은 L1s 수집을 너무 일찍 상쾌한을 제거 하지 마십시오.
        3. 25 ° c.에 하룻밤 nutating 믹서에 계란과 L1s를 포함 하는 튜브를 배치
  2. 관심사의 유전자를 대상으로 RNAi를 받게 하는 젊고 나이 든 동물 수집에 생식이 동물의 액체 문화
    참고: 일부 유전자의 RNAi 응답 온도 앞에서 설명한16으로 종속 될 수 있습니다. RNAi 대신, 돌연변이 유전자 gon-2(-) 배경으로 통합 될 수 있습니다.
    1. 액체 문화에 대 한 박테리아의 준비
      1. 4 파운드 매체의 각각 세균성 문화 12 mL와 함께 접종 하 여 OP50 및 RNAi 세균 (박테리아 원하는 dsRNA와 제어로 빈 벡터와 박테리아 생산) 준비 (추가 50 µ g/mL carbenicillin와 1mm IPTG의 최종 농도 RNAi를 세균성 문화) 37 ° C 180 rpm에서 하룻밤 사이에 그들을 품 어 고.
      2. 다음 날 수확 4 ° c.에서 10 분 동안 6700 x g에서 문화 supernatants 제거 하 고 60 mL 차가운 S 기저 미디어 (100 m m NaCl, 50 mM 칼륨 인산 염 pH 6, 얼음에 보관) 각 펠 릿 resuspend. 3 resuspended 펠 릿을 유지 (OP50, RNAi 박테리아, 및 관심사의 유전자에 대 한 RNAi 박테리아) 1.2.2 이나 1.2.3 단계까지 4 ° C에서.
        참고: 웜 성장 될 수 있다 RNAi에 L1 단계에서 (단계 1.2.3 참조) 또는 마지막 애벌레 단계 L4에서에서 발달 결함을 피하기 위해 (1.2.2 단계 참조).
    2. RNAi 시작 애벌레 단계 L4에서 마지막으로 치료에 대 한 액체 문화
      1. Fernbach 문화 플라스 크에 200 mL S 기저 미디어 추가 (용량 2800 mL). 300 mL의 최종 문화 볼륨 (1.2.2.4 참조), 추가 10 mM 칼륨 구 연산 염, pH 6, 3 mL 추적 금속 솔루션 (5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 2.5 m m FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0.1 m m CuSO4) 3mm MgSO4 , 3 m m CaCl2, 100 ng/mL carbendazim, 및 5 µ g/mL 콜레스테롤). 막 나사 모자와 함께 플라스 크를 닫습니다. 버퍼 조리법 표 1 을 참조 하십시오.
      2. 25 ° C (단계 1.1.2.2.3)에서 L1s를가지고 고 15 mL 튜브에 그들을 전송. 3 분 동안 1900 x g에서 centrifuge, 상쾌한, 제거 하 고 단계 1.1.1.8에서 2 µ L 당 L1s를 계산. 이전 단계에서 준비 Fernbach 문화 플라스 크에 500000 L1s를 추가 합니다.
      3. 벌레의 수에 비례 (1.2.1 단계)에서 OP50를 추가 합니다. 예를 들어 500000 벌레에 대 한 60 mL OP50를 추가 합니다.
      4. 300 ml 전체 볼륨을가지고 기초 s 완전 한 벌레 문화. 150 rpm으로 떨고 인큐베이터에서 25 ° C에서 L4 단계까지 벌레 문화를 품 어.
      5. 다음 날, 벌레 야생-타입 L4s의 크기 이어야 한다. OP50에서 RNAi 박테리아를 변경 하려면 6 50 mL 튜브에 동물을 수집 하 고 그들에 게 침전 물 제거는 상쾌한. 잔여 OP50 박테리아를 제거 하는 m 9와 L4s 세척: 3 분 1900 x g에서 원심은 상쾌한을 제거 하 고 한 50 mL 튜브에 모든 L4s를 전송. 5 µ L 당 L4s (적어도 9 시간)를 계산 합니다. 두 번 50000 L4s 젊은 웜 컬렉션에 대 한 필요 하 고 두 번 100000 L4s 세 웜 컬렉션에 필요한.
      6. 1.2.2.1에 설명 된 대로 4 개의 Fernbach 문화 flasks을 준비 합니다. 또한 각 플라스 크에 50 µ g/mL Carbenicillin와 1mm IPTG의 최종 농도 추가 합니다.
      7. 추가 제어 RNAi 박테리아와 벌레의 수에 비례 (1.2.1 단계)에서 관심사의 유전자에 대 한 RNAi 박테리아: 젊은 벌레에 대 한 플라스 크 당 각각 박테리아의 7 mL 및 세 벌레에 대 한 플라스 크 당 14 mL을 추가.
      8. 젊은 웜 컬렉션에 대 한 플라스 크 당 50000 웜 및 세 웜 컬렉션에 대 한 플라스 크 당 100000 벌레를 추가 하 고 최대 300 mL를 채우기 위해 기저 S로 문화를 완료. 25 ° C 및 150 rpm에서 웜 문화 (총에서 4 개)를 품 어.
    3. L1 단계에서 시작 하는 RNAi와 치료에 대 한 액체 문화
      1. 1.2.2.1에 설명 된 대로 4 개의 Fernbach 문화 flasks을 준비 하 고 50 µ g/mL carbenicillin와 1mm IPTG의 최종 농도 추가.
      2. 1.2.2.2에 설명 된 대로 L1s의 준비와 함께 계속. 총에서 300000 벌레는 4 개의 플라스 크에 분할 필요 합니다.
      3. 추가 제어 RNAi 박테리아와 벌레에 설명 된 대로의 수에 비례 (1.2.1 단계)에서 관심사의 유전자에 대 한 RNAi 박테리아 1.2.2.7 단계와 L1 및 L4 단계 사이 성장 단계를 또한 고려 하십시오: 13 mL 플라스 크 젊은 w 당 각각 박테리아의 추가 orm 그리고 26 mL 플라스 크 세 벌레에 대 한 당.
      4. 1.2.2.8 단계에서 설명한 대로 계속.
    4. C. 선 충 액체 문화의 유지 보수
      1. 주기적으로 각 액체 문화 및 장소에서 유리 슬라이드에는 약 수를 수집 (또는 한 천 배지에서) 아무 오염 확인 합니다. 해 부 현미경을 사용 하 여, 성장 단계 동안 특히 문화에 세균성 음식 수준을 확인 합니다. 제어 RNAi의 2 L 문화를 사전에 준비 단계 1.2.1에서에서 설명한 대로 관심사의 유전자에 대 한 RNAi 박테리아 및 박테리아. 필요한 경우 이러한 선 충 C. 액체 문화를 추가 하 고 나머지 4 ° c.에 유지
      2. 정기적으로 동물 살 균 되는지 확인 합니다. 동물의 대다수는 생식을 없을 것 이다. 곤 2 돌연변이의 penetrance, 따라 일부 gonadal 구조를 중단 할 수 있습니다 하지만 계란 없는 동물을 관찰 해야 합니다.
  3. 액체 문화에서 RNAi를 받게 하는 젊고 나이 든 벌레의 컬렉션
    참고: 다음 단계를 모두 한 액체 문화 플라스 크에 대 한 하지만 관심사의 유전자에 대 한 제어 및 RNAi 박테리아와 같은 나이의 두 문화를 함께 처리 한다.
    1. 주 2 또는 하루 3 단백질 용해성의 기초 수준 측정을 젊은 벌레를 수집 합니다. 인구의 절반이 사망 했다 때 세 웜 (에서 최신) 수집 해야 합니다. 이 확인 하려면 죽은 살아있는 벌레 몇 방울의 액체 문화에 한 천 배지에서 계산 됩니다. 비율 적어도 9 방울 이상의 평균 있습니다.
    2. 다음 시 약 준비: 1 L M9, 1 L M9 0.01 %Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), 그리고 40 mL 60% 자당 ddH2오 계속 얼음에 시 약.
    3. 분리 깔때기로 한 플라스 크에서 벌레를 부 어 하 고 실 온에서 10 분 동안 벌레 앙금. 자 지를 열고 한 50 mL 튜브에 벌레를 똑.
    4. 두 개의 15 mL 튜브 웜 펠 릿을 분할 하 고 실 온에서 5 분 동안 1900 x g에서 원심. 벌레를 세척 하는 상쾌한을 제거 하 고 M9 15 mL를 채우십시오. 원심 분리를 반복 합니다. 마지막으로 두 50 mL 튜브에 벌레를 전송 하 고 차가운 M9 20 mL 전체 볼륨을 채워.
    5. 제거 하려면 박테리아와 죽은 벌레, 추가 2 50 mL 튜브에 두 20 mL 희석 웜 펠 릿 20 mL 차가운 60% 자당으로 가득. 신속 하 게 실내 온도, 9 가속과 감속 7에서 5 분 동안 2700 x g에서 원심. 조심 스럽게 큰 피펫으로 (25 mL)와 최고 벌레 레이어 제거. 최대 15 mL (걸리지만 경우 덜 분명 죽은 벌레 많이 있습니다). 이 직접 넣어 M9 + Octoxynol-9 37 mL (3 관 자당 튜브 당) 준비 얼음에. 9와 7 감속 가속, 실내 온도에 3 분 동안 2700 x g에서 원심.
      참고: 둘 다 해야 얼음; 그렇지 않으면 분리 작동 하지 않습니다. 혼합 하지 마십시오! 자당은 벌레에 독성이 있기 때문에 다음 단계에 대 한 빠른 것 중요 하다.
    6. 4 15 mL 튜브에 펠 릿을 분할 하 고 씻어 두 번와 함께 차가운 M9 + Octoxynol-9: 실 온에서 1 분에 1900 x g에서 원심 분리기. 상쾌한 제거, 얼음 처럼 차가운 M9 + Octoxynol-9와 반복 절차 15 mL 마크에 기입.
    7. 얼음 처럼 차가운 M9로 한번 세척 하 고 2 개의 관을 4 개의 튜브를 결합. 15 mL 튜브 4 mL의 총 볼륨을 실 온에서 M9와 채우기 고 40 분 동안 25 ° C에서 nutating 믹서에 회전.
      참고:이 벌레에에서 모든 잔여 박테리아를 소화를 돕는다. 없는 죽은 것 들 보고 현미경 벌레를 확인 하십시오.
    8. 1.3.5에 설명 된 대로 두 번 차가운 M9 + Octoxynol-9와 함께 벌레를 씻어. M9로 두 번 세척 하 고 1 개의 관에 벌레를 전송.
    9. 억제제 (0.1 m M 4-morpholineethanesulfonic 산 (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic 산 (EGTA), 0.1 mM EDTA, 0.5 m m MgSO4, 0.75 M NaCl 0.02 M 나트륨 불 화물 (NaF)) 없이 리어셈블리 (랩) 높은 소금 추출 버퍼에 벌레를 한 번 씻어 전에 컬렉션입니다. 제거는 상쾌한 웜 펠 릿 위에 아무 액체 때까지.
      참고:이 단계와 다음 행해져야 한다 급속 하 게 높은 소금 농도 버퍼에 의해 발생 하는 벌레에 유물을 피하기 위해.
    10. 웜 펠 릿의 양을 견적 하 고 억제제 (프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 2)와 랩의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 벌레를 인출 하 고 천천히 절반 드라이 아이스에 액체 질소로 채워진 50 mL 튜브에 똑. 액체 질소를 증발 처리까지-80 ° C에서 냉동된 벌레를 저장 하자.
      주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도; 적절 한 보호를 착용 하십시오.

2. 관심사의 유전자를 대상으로 RNAi를 받게 하는 젊고 나이 든 동물과 불용 성 단백질 추출

  1. 1.3 단계에서 수집 하는 동물의
    참고: 어떤 웜 샘플의 해빙을 피하기 위해 중요 하다. 액체 질소로 박격포 아래로 냉각 하 고 드라이 아이스에서 완전 한 절차를 수행 합니다.
    주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도; 적절 한 보호를 착용 하십시오.
    1. 사전 냉각된 박격포를 고정된 웜 전송 및 2.5 분에 대 한 갈기.
      참고: 연 삭 하는 동안 조심: 처음부터, 냉동된 벌레에 작은 총알 있고 그들을 잃게 하기 쉽습니다.
    2. 다시 그것을 진정 하 고 현미경 벌레 시체 깨집니다 다른 2.5 분 확인에 대 한 갈기를 분말에 액체 질소 (약 100ml)를 추가 합니다. 2 mL 튜브에 분말을 전송 하 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
  2. 서쪽 오 점 분석에 대 한 빠른 불용 성 단백질 추출
    참고: RNAi의 유전자를 대상으로 하지 않고 다른 일 사이 총 단백질 콘텐츠 및 불용 성 단백질 수준 비교를이 메서드를 사용 합니다. 2.2.3 얼음에 단계까지 모든 단계를 수행!
    1. 150 2.1 단계에서 땅 벌레의 50 밀리 그램을 solubilize µ L Radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼 (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 0.5% 나트륨 deoxycholate (SDO), 1 %nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 소 (PMSF), 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1). 균질 (27 G x ½", 0.4 m m x 13 m m); 회색 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 정지 10 번 정지를 그립니다.
    2. 4 ° c.에 20 분 동안 18,400 x g에서 원심 분리기 상쾌한을 수집 합니다.
    3. 4 ° c.에 20 분 동안 18,400 x g에서 100 µ L RIPA 버퍼와 원심 분리기에서 펠 릿 resuspend 삭제는 상쾌한, 곧, 회전 하 고 남은 표면에 뜨는 제거 조심.
    4. 매우 불용 성 단백질을 solubilize 75 µ L 요소/SDS 버퍼 (8 M 요소, 2 %SDS, 50 m m dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8)에 펠 릿을 resuspend 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
    5. 총 단백질 콘텐츠를 분석 하려면 단계 2.2.2에서에서 표면에 뜨는 첫 번째 RIPA와 우 레 아/SDS 펠 릿 물의 resuspension 결합. 추출에 사용 된 볼륨에 대 한 계정, 표면에 뜨는 RIPA의 2/3와 1/3 요소/SDS 펠 릿 분수의 총 분수 포함 되어야 합니다. 작은 4-12% 그라데이션 젤에는 우 레 아/SDS 분수의 9 µ L을 로드 하 여 불용 성 단백질 및 4 µ L 총 결합된 단백질의 수준을 확인 합니다. 단백질 수준을 모니터링 하는 총 단백질 얼룩 얼룩을 수행 합니다. 서쪽으로 blotting 특정 항 체를 사용 하 여 변경 사항을 확인 개별 단백질 질량 분석에 의해 계량에 대 한 용해성에 (섹션 3 참조).
  3. 질량 분석에 대 한 SDS 불용 성 단백질을 불용 성 단백질 추출
    참고: 얼음에 모든 단계를 수행 합니다.
    1. 드라이 아이스에 2 개 무게 350 mg 지상 웜 시간 포인트 및 RNAi 박테리아 (젊고 세 웜 제어 RNAi 박테리아, 및 관심사의 유전자에 대 한 RNAi 박테리아) 2 mL 튜브에 시간.
    2. 높은-소금 용 해 단백질을 제거 하려면 억제제, 1 밀리미터 PMSF, 200 U/mL DNase I, 100 µ g/mL RNase A 각 튜브 및 얼음에 분말을 solubilize와 무게 (700 µ L) 당 랩의 두 개의 볼륨을 추가 합니다. 정지를 1 mL 주사기 (회색 바늘, 27 G x ½", 0.4 m m x 13 m m)으로 15 배 그리고 18,400 x g 4 ° c.에 20 분에서 10 분 원심 분리기에 대 한 얼음에 그것을 품 어 지방 층을 통해 이동한 상태 (총에서 4 개의 관) 당 하나의 2 mL 튜브에 높은 소금 용 해 단백질을 포함 하는 상쾌한 수집 합니다. 지방 질을 제거 하 고 그것을 폐기. Aliquot 높은 소금 녹는 단백질-80 ° c.에 동결을
    3. 지질을 버리고, 1 M 자당 포함 된 억제제와 700 µ L 랩으로 펠 릿을 solubilize (DNase 없이 어 RNase A). 현 탁 액을 주사기로 10 시간 그리고 5 분 원심 분리기 18,400 x g 4 ° c.에 20 분에 대 한 얼음에 그것을 품 어 모든 상쾌한 및 지질을 제거 하 고 그들을 삭제 하려면 주의 해야 합니다.
    4. SDS 수용 성 단백질을 제거 하려면 700 µ L RIPA 버퍼와 펠 릿을 solubilize. 현 탁 액을 주사기로 10 배 그리고 얼음에 10 분 동안 품 어. 4 ° c.에 20 분 동안 18,400 x g에서 원심 분리기 SDS 수용 성 단백질과 약 수-80 ° c.에 동결에 대 한 포함 된 상쾌한 수집
    5. 500 µ L RIPA 버퍼 각 펠 릿 solubilizing 후 각 조건 함께 두 개의 샘플을 풀. 그릴 현 탁 액을 주사기로 10 번. 4 ° c.에 20 분 동안 18,400 x g에서 원심 분리기 조심 모든 상쾌한을 제거 하 고 그것을 삭제 합니다.
      참고: 추출의 목표에서 불용 성 단백질 용 해 단백질을 분리 하는. 따라서, 그것은 다음 단계에서 포 름 산을 추가 하기 전에 표면에 뜨는 모든 잔여 RIPA를 제거 하는 것이 중요입니다.
    6. 400 µ L 70% 개미 산으로 매우 불용 성 단백질을 포함 하는 마지막 펠 릿을 solubilize 고 20 번 주사기에 정지를 그립니다. 얼음에 20 분 동안 품 어. 4 ° C, 3 가속과 감속 5, 벌레 표 피 파편 제거 하에서 20 분 50000 x g에서 원심. 매우 불용 성 단백질을 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고-80 ° c.에 그것을 동결합니다
    7. 질량 분석에 대 한 불용 성 단백질 분수의 투 석
      참고: 4 ° c.에 Dialyze
      1. 8 L 투 버퍼 (50 mM Tris, 1mm DTT, 0.1 m m PMSF, pH 7.5)를 준비 하 고 8 1 리터 비 커에 그것을 나눕니다. 장소 3 막 (멤브레인 필터 = 0.025 µ M) 각 1l 비이 커에 대 한 버퍼 표면에.
      2. 막, 당 신중 하 게 단계 2.3.6에서에서 얻은 포 름 산에서 solubilized 불용 성 단백질의 65 µ L 로드. 각 조건은 6 막에 나뉘어져 있습니다.
      3. 5 µ L을 제거 하 고 산도 스트립에 추가 하 여 한 샘플의 pH를 확인 합니다. 경우는 pH 7과 8 사이 (약 2 시간) 후, 부드럽게 위아래로 pipetting으로 샘플을 수집 합니다. 마지막으로, 10 µ L 투 버퍼를 사용 하 여 각 막에서 침전을 씻어. -80 ° c.에 샘플을 동결

3. 포괄적인 식별 및 정량화의 변화 나이 관심사의 유전자를 대상으로 RNAi에 의해 유도 된 단백질 용해성

  1. 질량 분석 분석을 위한 준비
    1. 알려진된 농도의 참조 샘플 함께 4-12% 그라데이션 젤에 약 수를 로드 하 여 dialyzed 샘플에 불용 성 단백질의 양을 평가 합니다. 총 단백질 젤 얼룩을 수행 하 고 이미지 분석 소프트웨어와 단백질 양을 계량. 이 단계는 트립 신 소화 (3.1.4 단계)에 필요한 금액을 추정 하는 데 필요한.
    2. 원심 증발 기를 사용 하 여 샘플을 집중 하 고 8m 우 레 아의 최종 농도에 불용 성 단백질을 solubilize.
    3. 알와 감소
      1. 추가 Tris(2-carboxyethyl) 샘플에 4mm의 최종 농도에 phosphine 염 (TCEP). 57 ° C 300 rpm에서 1 h에 품 어. 실내 온도에 샘플을 넣어.
      2. 8.4 m m의 최종 농도에 iodoacetamide를 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 그것을 (수 있습니다 알을 품 2 h) 45 분 동안 품 어.
      3. 최종 2 M 우 레 아 농도를 150 m m 염화 중 탄산염에서 샘플을 희석.
    4. 다이제스트 단백질 5 %w / w 37 ° C 및 400 rpm에서 하룻밤 트립 신 수정.
    5. 에 12 %SDS 젤 소화 단백질의 샘플을 로드 하 고 소화 했다면 분석 하는 총 단백질 젤 얼룩을 수행 합니다. 만약 아직도 일부 밴드 현재, 3.1.4 및 3.1.5 반복 단계.
    6. 젊고 세 제어 및 치료 RNAi C. 선 충 에서 펩 티 드 대 한 제조업체의 지침에 따라 상대 및 절대 정량 isobaric 태그로 레이블이 지정 됩니다.
      참고: 또는, 펩 티 드 또는 단백질을 라벨에 대 한 다른 방법 사용 될 수 탠덤 질량 태그 등 정량화에 대 한.
      참고: 질량 분석 분석: 샘플 복잡성을 줄이기 위해, 펩 티 드 해야 될 구분 하 여 강한 양이온 교환 크로마토그래피 질량 분석 분석5다른 조각으로. 여러 질량 분석기는 상대 및 절대 정량 분석 isobaric 태그17설명 되어 있는 대로 할 수 있다. 가져온 데이터는 적절 한 소프트웨어와 함께 처리 한다. 전반적으로이 분석의 매우 불용 성 단백질 그들의 나이 그리고 proteostasis 변조 식별 수 있습니다.

4. Vivo에서 평가 집계 패턴에 관심사의 유전자의 영향의 노화 중

  1. 제 3의 질량 분석 분석에서 RNAi 대상 동물에서 다른 정도로 축적 연령에 따라 집계 하기 쉬운 단백질을 선택 합니다. 생성 하는 유전자 변형 C. 선 충 이 단백질을 표현 하는 라인 태그 형광 단백질와 각각의 발기인 또는 조직의 특정 발기인의 통제 (적절 한 발기인의 선택에 대 한 논의 참조). OP50와 시드 선 충 류 성장 (NG) 접시에 표준 기술로 15 ° C에서 긴장을 유지 합니다. 예를 들어 polyadenylate-바인딩 단백질 (PAB-1)에 N-tagRFP 인 두 근육 promotor의 통제를 융합 표현 웜 변형 선택 pmyo-2.
  2. Vivo에서 유전자의 억제 시 나이의 집합에 변화의 평가
    1. 1 ~ 2 일 전에, 준비 NG/carbenicillin (수화물) IPTG (빈 RNAi 벡터 L4440) 컨트롤 플레이트 / 박테리아와 RNAi 박테리아의 유전자를 억제 하기 위해. ( C. 선 충 에 RNAi에 대 한 자세한 프로토콜에 대 한 정돈 과학 교육 데이터베이스를 참조 하십시오. 기초 생물학 1: 효 모, 초파리 그리고 C. 선 충. C. 선 충에 RNAi입니다. 정돈, 캠브리지, 메사추세츠, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. L 1에서 RNAi 치료를 위해 몇몇에 장소 계란-누워 웜 분리 제어 RNAi와 20 ° c.에 관심사의 유전자에 대 한 RNAi 박테리아 시드 작은 NG/수화물/IPTG (6cm 직경) 접시 2 h, 20 ° c.에 자손을 유지 후 성인을 제거 발달의 결함을 피하기 위해, RNAi 치료 L4 애벌레 단계 후 시작할 수 있습니다.
    3. 자손에는 L4 애벌레 단계에 도달 하면, 일단 전송 제어 RNAi와 RNAi 박테리아의 유전자에 대 한 시드 새로운 NG/수화물/IPTG 접시에 이러한 L4s. 15 제 닉 각각 두 조건에 대 한 9 개의 접시를 설정 하 고 20 ° c.에서 그들을 유지합니다 노화 웜 전송 그들의 자손에서 새로운 번호판을 두 번째 매일 그들의 생식 기간의 끝까지 그들의 자손에서 그들을 구별할 수 있이 필요가 있다.
    4. 성인, 하루 동안 24 x 확대와 함께 형광 스테레오 현미경 형광 태그로 표시 된 집계 하기 쉬운 단백질의 분포에 변화를 평가 합니다.
      참고: 밝은 puncta에서 집계 하기 쉬운 단백질의 연령에 따라 축적 한 읽기로 집계 사용 됩니다. 이러한 puncta 집계로 특징을 매우 움직이지 구조 이어야 한다. 이 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 photobleaching (FRAP) 후 형광 복구에 의해 결정 되어야 합니다. 집계 된 단백질에 대 한 아무 복구 4 분5,18후 표백된 지역에서 관찰 한다. 나 이와 함께 변화를 계량, 우리 하루 2, 5, 일과 제 7 일 다음으로 성인 기의에서 PAB-1 overexpressing 나이 동기화 웜 배포 패턴 득점: 낮은 집계 수준 (후부 인 두 전구에서 0-10 tagRFP::PAB-1 puncta), 중간 집계 수준 (후부 인 두 전구에서 10 개 이상의 puncta), 그리고 높은 집계 수준 (10 이상 puncta 앞쪽 인 두 전구에).

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결과

우리가 사용 하는 방법 여기 어떻게 수명이 긴 동물을 평가 하 여 감소 IIS 변조 연령에 따라 단백질 집계. 서쪽으로 오 점 (단계를 참조 하십시오 2.2, 빨리 서쪽 오 점 분석에 대 한 불용 성 단백질 추출), 우리는 총 영 (성년의 날 3)의 불용 성 단백질 함량을 분석 (성년의 날 18) 웜 제어 RNAi와 RNAi는 인슐린을 대상으로 세 / IGF-1-같은 수용 체 daf-2. RNAi 조건 (

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토론

여기 우리는 매우 불용 성 단백질 질량 분석 및 서쪽 blotting에 의해 분석을 위한 RNAi를 받게 되는 선 충 C. 노화에서 집계를 분리 하는 방법을 보고 합니다. 우리는 그 연령에 따라 단백질 집계 방지 proteostasis IIS를 크게 줄임으로써 향상을 보여줍니다. 특정 집계 경향이 단백질 C. 선 충에서 overexpress을 선택 하 여 추가 고유의 단백질 집계를 변조 하는 메커니즘을 해 부 수는.

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 DZNE와 마리 퀴리 국제 재통합 그랜트 (D.C.D.에 322120)에서 기금에 의해 지원 되었다

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

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