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요약

이 프로토콜에 복사 번호 유사의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비, 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 식물입니다.

초록

돌연변이 유전자 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원 이다. 돌연변이 컬렉션을 생성 하려면 세 가지 유형의 mutagens 활용할 수 있습니다, T DNA 또는 transposon 등 생물, 에틸 methanesulfonate (EMS), 같은 화학 또는 이온화 방사선 같은 물리를 포함 하 여. 돌연변이 관찰의 유형에 돌연 사용에 따라 다릅니다. 이온화 방사선 유발 돌연변이, 돌연변이 또는 삭제, 복제, 또는 재배치 포함. T-DNA 또는 transposon-기반 mutagenesis는 변환에 취약 종으로 제한, 화학 또는 물리적 mutagenesis 종의 광범위 한 범위에 적용할 수 있습니다. 그러나, 전통적으로 화학 또는 물리적 mutagenesis에서 파생 하는 돌연변이의 특성 지도 기반 복제 방식을, 노동 집중과 시간이 소모 되는 사용 합니다. 자, 우리 감지 하 여 효율적으로 복사 번호 유사 (CNVs) 돌연변이에 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis에서 파생 된 특성 고밀도 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (aCGH) 플랫폼을 적용할 수 있음을 보여합니다 개자리속 truncatula, 콩과 식물 종입니다. 전체 게놈 시퀀스 분석 50000 개 이상의 유전자 나 유전자 모델 M. truncatula에서 보여줍니다. M. truncatula 에서 현재, FNB 유발 돌연변이에서 150000 이상 m 1 라인을 대표 하는 게놈에 있는 유전자의 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원에서 파생 됩니다. 여기에 설명 된 aCGH 플랫폼 FNB 유발 돌연변이 M. truncatula에 특성화를 위한 효율적인 도구입니다.

서문

콩 (Fabaceae) 콩 (최대 글리신), 알 팔 파 (개자리속 sativa) 등 많은 경제적으로 중요 한 종 가진 꽃 식물의 3 번째로 큰 가족입니다. 콩과 식물 질소 담합 토양 박테리아, 일반적으로 Rhizobia 있는 대기 이질소 호스트 식물에 의해 사용 하기 위해 암모니아로 감소 된다 뿌리 혹을 개발 하 라는 작용할 수 있습니다. 이와 같이, 콩과 식물 작물의 재배는 질소 비료의 작은 입력 요구 하 고 따라서 지속 가능한 농업에 기여. 콩과 식물 작물 생산 나뭇잎과 씨앗 높은 단백질 콘텐츠, 우수한 사료 및 곡물 작물으로 봉사. 그러나, 재배 콩과 식물 종에는 일반적으로 복잡 한 게놈 구조, 성가신 콩과 식물-특정 프로세스에 핵심 역할을 하는 유전자의 기능 연구를 만드는 있다. 개자리속 truncatula 널리 채택 되었습니다 콩과 식물 연구에 대 한 모델 종으로 주로 하기 때문에 (1)는 상대적으로 작은 단일 게놈 크기 (550 ~ Mbp); 2 중 게놈 (2) 식물 유전자 기능 연구; 대 한 안정적으로 변형 될 수 있다 그리고 (3)은 밀접 하 게 관련 된 알 팔 파 (M. sativa로 구나), 사료의 여왕 및 변환 연구에 대 한 다른 많은 경제적으로 중요 한 작물. 최근, 게놈 시퀀스 M. truncatula cv의 Jemalong A17 발표1,2되었습니다. 게놈 주석 50000 개 이상의 예측된 유전자 나 게놈에 있는 유전자 모델을 보여 줍니다. M. truncatula 에 유전자의 대부분의 기능을 확인 하려면 게놈은 어려운 작업입니다. 유전자의 기능 연구를 촉진 하기 위해1 라인의 범위에서 돌연변이의 포괄적인 컬렉션 생성 된 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis M. truncatula 이력서에 사용 하 여 Jemalong A173 4. 빠른 중성자, 고 에너지 이온화 돌연 애기5,6, 쌀 (Oryza sativa)7, 토마토 (푸른 풀밭을 포함 하 여 많은 식물 종에 돌연변이 생성에 사용 되었습니다. lycopersicum), 콩 (글리신 soja; 최대 G.)8,9, 보 리 (Hordeum vulgare), 그리고 로터스 나무10. FNB mutagenesis에서 파생 된 변이의 큰 부분 DNA 삭제 메가 기본적인 쌍9,11몇 가지 기본적인 쌍 크기에서 범위는 한다. 많은 표현 형 관련 유전자 성공적으로 되었습니다 식별 및 특징4,12,13,,1415,16, 17 , 18 , 19. 이전, 지도 기반 접근 시간이 소모 하 고 분자 수준에서 특징을 돌연변이의 수를 제한에 의존 FNB 돌연변이에서 기본 유전자의 분자 클로닝. 최근에, 몇 가지 무료 방법을 사본 기반 메서드를 포함 하 여, 게놈 DNA 복사 번호 유사 검색, 및 전체 게놈 시퀀싱, 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 기와 고용 촉진 하는 동물과 식물20,21,22,23,,2425을 포함 한 다양 한 유기 체에서 삭제 돌연변이의 특성 26,,2728,29,30,31.

M. truncatula는 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH)에서 FNB 돌연변이의 특성화를 촉진 하기 위하여 플랫폼 개발 되어과 검증. 동물 시스템에 보고, CGH 배열 기반 플랫폼 M. truncatula FNB 돌연변이에 전체 게놈 수준에서 복사 번호 유사 (CNVs)의 탐지를 허용 한다. 또한, 병 변 PCR에 의해 확인 될 수 있습니다 및 삭제 테두리 시퀀싱에 의해 확인 될 수 있다. 전반적으로, 배열 CGH 플랫폼 M. truncatula FNB 돌연변이에 병 변 식별에 효율적이 고 효과적인 도구입니다. 여기, 배열 CGH 절차 및 PCR 특성화 M. truncatula FNB 돌연변이에 삭제 테두리의 그림은.

다음 프로토콜 복사 번호의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 유사 식물에서. 예를 들어, 개자리속 truncatula FN6191 돌연변이 삭제 지역과 후보 유전자 돌연변이 고기와 관련 된 식별 하 사용 되었다. M. truncatula FN6191 돌연변이, 빠른 중성자 사격 유도 삭제 돌연변이 컬렉션32 에서 원래 고립 된 토양 접종 후 하이퍼 nodulation 표현 형을 전시 하는 ( 테이블의 자료참조) 박테리아, 야생 유형 식물 달리 Sihorhizobium meliloti Sm1021

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프로토콜

참고: 그림 1 배열 CGH 프로토콜에 대 한 5 단계를 보여 줍니다. 그들은: 1); 식물 재료의 준비 2) 격리의 고품질 DNA 샘플; 3) 레이블 및 정화의 DNA 샘플; 4) 교 잡, 세척, 그리고 검색의 전체 게놈 배열; 그리고 5) CGH 데이터 분석. M. truncatula 전체 게놈 타일링 어레이 50000 개 이상의 유전자 나 게놈 (참조 자료의 테이블)에 유전자 모델을 대상으로 하는 971,041 독특한 올리고 프로브의 총 포함 되어 있습니다. 고유의 프로브 간격 약 모든 150의 기본적인 쌍 (bp) exonic 지역 및 261에 M. truncatula 게놈의 intronic 지역에서 bp.

1. 식물 재료의 준비

  1. Scarify 야생 타입 (WT; M. truncatula cv Jemalong A17)와 8 분에 대 한 집중된 한 황산을 가진 FN6191 돌연변이 씨앗 (재료의 표 참조). 제거 하 고 액체 폐기물 컨테이너에 황산 삭제.
  2. 린스 씨앗 압력가 이온을 제거 된 물으로 세 번.
  3. 표면 소독 씨앗 10 분에 대 한 20% 표 백제 솔루션
  4. 린스 씨앗 압력가 이온을 제거 된 물으로 세 번.
  5. 3 일 동안 4 ° C에 저장 씨앗. Vernalization, 후 전송 및 성장 챔버와 16/8 h에에서 1 주일 명암 주기 및 150 µE/m 2 /s 빛 강도 대 한 토양에 씨앗을 발 아.
  6. 1 갤런 냄비에 묘 종을 이식 하 고 16 h/8 h 명암 주기, 3 ~ 4 주에 대 한 150 µE/m 2 /s 빛 강도 가진 온실에서 성장. DNA 분리에 대 한 식물에서 젊은 잎 샘플을 수집.

2. 높은 품질 DNA 샘플의 절연

  1. 단일 공장에서 젊은 잎 조직 1 g 하 고 액체 질소에 즉시 동결.
  2. 박격포와 유 봉 미세 분말을 액체 질소에서 냉동된 잎 조직이 갈기.
  3. DNA 분리와 게놈 DNA 분리 키트 (재료의 표 참조).
  4. Resuspend 정화 DNA 샘플 압력가 이중 이온된 H 2 O의 50 µ L (ddH 2 O) 또는 TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0) x 1.
  5. 측정 DNA 농도 분 광 광도 계와 (재료의 표 참조).
  6. 평가 260 nm/280 nm와 DNA 샘플의 260 nm/230 nm 비율.
    참고: 고품질 DNA 샘플 260 nm/280 nm 비율 있어야 ≥ 1.8와 260 nm/230 nm 비율 ≥ 2.0.
  7. 추가 agarose 젤 1%에서 그들을 실행 하 여 DNA 샘플 평가.
    참고: 고품질 DNA 샘플 높은 분자 무게 있고 RNA에 의해 오염 되지 해야 합니다. 이상적으로, DNA 샘플의 최종 농도 ~ 150 ng / µ L 되어야 합니다.

3. DNA 라벨 및 정화

  1. ddH 2 O 500 µ L 원심 분리기 튜브에서 20 µ L의 최종 볼륨을 희석 1 µ g의 genomic DNA 샘플.
  2. 임의의 뇌관의 추가 5 µ L (재료의 표 참조) 관.
  3. 소용돌이 짧게 튜브로 품 어 10 분에 98 ° C에서 DNA를 변성 하 thermocycler
  4. thermocycler에서 튜브를가지고 고 5 분에 대 한 진정 얼음 물에 바로 넣어
  5. 표 1과 같이 믹스 준비 2 라벨.
  6. 믹스 1과 2 참조 DNA와 DNA 샘플에 라벨의 추가 25 µ L 튜브, 각각.
  7. 세 번 pipetting으로 라벨 믹스와 DNA를 혼합 하 고 튜브를 짧게 회전.
  8. 그리고 20 분 엑 소 Klenow 효소 비활성화 65 ° C에서 37 ° C 2 h에서 품 어 하 thermocycler로 튜브를 넣어 (재료의 표 참조).
  9. 테 버퍼 각 튜브를 x 1의 추가 430 µ L.
  10. 내용을 혼합 하 고 튜브를 짧게 회전.
  11. 전송 솔루션 2 mL 컬렉션 정화 열에 관에서 관 (재료의 표 참조).
  12. 분리기 14000 x g 10 분에 대 한 정화 열
  13. 솔루션을 통해 패스 삭제.
  14. 추가 480 x 각 열으로 TE 버퍼 1 µ L.
  15. 분리기 14000 x g 10 분에 다시 열
  16. 통과 솔루션 삭제.
  17. 새 원심 분리기 튜브에 열에의 하단 부분에 남아 있는 레이블이 DNA 샘플을 전송.
  18. 는 피 펫을 사용 하 여 레이블이 지정 된 DNA 샘플의 볼륨을 측정 하 고 x TE 버퍼 1 80 µ L를 최종 볼륨을가지고.
  19. 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 레이블이 DNA 샘플의 농도 측정 (재료의 표 참조).
  20. 레이블된 샘플 DNA의 동일한 금액을 혼합 하 고 DNA를 참조 테 버퍼 x 1와 160 µ L를 최종 볼륨을가지고.
  21. 교 잡 버퍼, 인간 침대 1 DNA의 50 µ L 10 × aCGH 차단 에이전트의 50 µ L x 2 µ L 추가 256 (재료의 표 참조) 3 번 pipetting으로 잘 섞는다.
  22. 짧게 튜브를 회전 하 고 10 분에 98 ° C에 품 어 하 thermocycler에 넣어
  23. 20 분 동안 37 ° C에서 튜브를 품 어

4. 교 잡, 세척, 그리고 게놈 배열의 검색

  1. 미리 따뜻한 교 잡 시작 하기 전에 67 ° C 이상 4 h 교 잡 오븐.
  2. 교 잡 챔버의 기지에 가스 켓 슬라이드 배치.
  3. 가스 켓 슬라이드에 단계 3.23에서 교 잡 솔루션의 부하 490 µ L.
  4. 개자리속 truncatula 게놈 microarray 칩 교 잡 챔버를 가스 켓 슬라이드 커버.
  5. 교 잡 챔버 커버에 넣고 클램프와 챔버를 단단히 조입니다.
  6. 조립된 교 잡 실 교 잡 오븐에 넣고 40-48 h. 67 ° C에서 품 어
  7. 설거지 준비 3 슬라이드: 나 실 온에서 보관 하는 두 버퍼를 세척 하는 250 mL와 버퍼 II 세척 한 37에서 보관 ° c.
  8. 항아리 세척 준비 2 슬라이드: 70 mL 이기와 70 mL 안정화와 건조 솔루션 하나, 모두 유지 실내 온도에서 증기 두건에서 (재료의 표 참조).
  9. 교 잡 챔버 오븐에서 제거 하 고 챔버 클램프 및 덮개 제거.
  10. Microarray 칩 및 가스 켓 나 워시 버퍼와 슬라이드 세척 접시를 슬라이드와 커버 슬라이드에서 칩을 분리 이동.
  11. 두 번째 슬라이드 세척 하는 microarray 칩 이동 나 워시 버퍼와 접시와 부드럽게 순환 5 분에 대 한 실 온에서 자기 저 어 접시에 볶음 바 솔루션
  12. 전송에 microarray 칩을 미리 데워 세척 버퍼 II와 접시 세척 세 번째 슬라이드 1 분 37 ° C에서 자기 저 어 접시에 볶음 bar로 부드럽게 씻어
  13. Microarray 칩 세척 증기 두건에서 이기와 단지 슬라이드를 전송과 30 씻고 s.
  14. Microarray 칩 슬라이드 안정화와 함께 항아리를 세척 하 고 건조 솔루션에 전송 하 고 30 씻어 s.
  15. 칩 밖으로 천천히 하 고 1 분에 대 한 그것을 건조합니다
  16. 검색 microarray 칩 스캐너를 사용 하 여 참조 테이블의 자료 2 µ m 해상도. 여러 개의 이미지를 저장 하 고 전체 검사를 슬라이드에 대 한 매개 변수를 설정 합니다. 채널 1과 2 이익 100% 설정 하 고 자동 이득 취소.

5. CGH 데이터 분석

  1. 추출 Cy3와 Cy5 형광 검색 소프트웨어를 사용 하 여 배열에서 각 프로브에 대 한 농도 (재료의 표 참조).
  2. 세분화 분석 샘플 DNA 사이의 참조 DNA 복사 번호 유사 (CNVs)를 감지 하는 소프트웨어의 사용. CNVs를 결정 하기 위한 세그먼트 의미 로그 2 샘플/참조 비율 ± 2.5 표준 편차의 임계값을 사용 하 여.
  3. 신호 매핑 소프트웨어를 사용 하 여 전체 게놈에서 로그 2 샘플/참조 비율의 분포를 검사 (재료의 표 참조).

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결과

그림 2 는 전체 게놈에서 돌연변이 WT 신호 대의 표준화 된 로그2 비율의 분포를 보여준다. CGH 데이터의 분석 공개 대략적인 전체 SUNN 유전자33 와 몇 가지 다른 염색체 4에 22 kb 삭제 주석 FN6191 돌연변이 (그림 2, 그림 3)에서 유전자. 후보자 삭제 된 지역 평균 정규화 된 로그

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토론

어레이 기반 CGH 플랫폼 검색 및 빠른 중성자 사격 (FNB)의 특성에 대 한 개발 했습니다-cv. M. truncatula Jemalong A17에에서 돌연변이 유도. 배열 CGH 메서드 유전자 돌연변이 검출에서 사용을 보여 우리는 돌연변이 FN6191 S. meliloti Sm1021와함께 접종 때 야생 유형 식물, 달리 하이퍼 nodulation 형 전시의 aCGH 분석을 수행. 세분화 분석을 위해 세그먼트 로그2 비율의 의미는 세그먼트 내의 프?...

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공개

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 말

이 작품의 자금에서 제공 됩니다 일부 권한을 부여 하 여 NSF 식물 게놈 연구 (IOS-1127155).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant)In houseFN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference)In houseA17
Sulfuric acidSigma-Aldrich320501
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104
Nanodrop SpectrophotometerThermo Scientific1000D
SureTag DNA Labeling KitAgilent5190-3400
Random primerAgilent5190-3399
AcetonitrileSigma-Aldrich271004-1L
ThermocyclerMJ researchPTC-200
CentrifugeLabnet international IncSpectrafuge 24D
Stabilization and Drying SolutionAgilent5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization KitAgilent5188-5380
Hybridization Chamber gasket slidesAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2Agilent5188-5221
Hybridization Chamber, stainlessAgilentG2534A
Hybridization ovenAgilentG2545A
Purification ColumnsAgilent5190-3391
Laser scannerRocheMS200
NimbleScan 2.6Roche Nimblegen5225035001
Signal Map 1.9Roche NimblegenSignalmap1.9

참고문헌

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