혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

요약

이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.

초록

혈 청 및 혈장 세포 무료 DNA (cfDNA)은 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항의 예측에 대 한 생체의 유익한 정보, 비-침략 적 원본으로 표시 되었습니다. 전이성 거세 저항 전립선 암 (mCRPC)에서 자주 이벤트는 안 드로 겐 수용 체 (AR) 유전자 사본 번호 (CN) 얻을 가설에서 출발, 잠재적인 예측 biomarker로 cfDNA에서이 이벤트를 분석을 제안 한다.

우리가 2 다른 실시간 PCR 분석 실험 및 2 참조 유전자 (RNaseP 및 전1)를 사용 하 여 cfDNA에 아칸소 CN 평가. DNA 양의 60 ng 각 분석 결과 조합에 대해 사용 되었다. AR CN 이득 디지털 PCR를 사용 하 여 보다 정확한 방법으로 확인 됐다. CN 변형 분석 이미 치료 저항 mCRPC의 설정에서의 예측을 위한 유익 입증 되었습니다 하지만 그것은 도움이 될 수 있습니다 또한 다른 환자의 설정에서 다른 목적을 위해. CfDNA에 CN 분석에는 여러 이점이 있다: 그것은 비 침략 적, 신속 하 고 쉽게 수행 하 고 혈 청 또는 플라스마 소재의 작은 볼륨에서 시작.

서문

순환 하는 혈액에서 세포 무료 DNA (cfDNA) 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항^1,2의 예측에 대 한 생체의 최적의 원본 증명 되었습니다. 많은 연구 DNA 변경 (돌연변이, 복사 번호 유사 조직에 epigenetic 수정)와 해당 플라즈마 샘플¹, 순환 종양 DNA (ctDNA)는 확인 그 사이 좋은 색인 기본 및 전이성 종양 조직 변경³에 대 한 유익한. CtDNA의 가능성은 따라서 게놈 재배열 및 특정 oncogenes⁴, 잠재적으로 전이성 클론와 subclonal 셀 식별에 복사 번호 유사 (CNVs)의 재건에 대 한 수 있습니다. CtDNA 임상 암 치료 모니터링으로 특정 돌연변이 관련 특정 표적으로 한 치료^5,6, CNVs 항구에 특히 유용한 것으로 표시 되었습니다. 그것은 또한 조직 생 검에 대 한 필요를 극복 하 고 결과 비-침략 적 방식으로 특정 암 치료 기간 동안 서로 다른 시간에 얻을 수 있습니다.

전립선 암, 순환 셀 무료 안 드로 겐 사이의 중요 한 상관 관계에 관해서는 수용 체 (아칸소) CNVs 및 치료 응답 abiraterone와 enzalutamide로 표시 되었습니다, 나타내는 AR 유전자 복사 번호 (CN) cfDNA에 있을 수 있습니다는 치료 저항^7,,89,10,11예측 가능한 유망 바이오 마커. CtDNA에 특정 유전자의 CNVs 다른 감도, 비용 및 속도으로 다른 접근을 사용 하 여 평가할 수 있다 (예. 실시간, 디지털 PCR, 및 다음 세대 시퀀싱).

여기는 실시간 PCR 기술, 혈 청 및 혈장 샘플^7,8cfDNA에 아칸소 CN을 평가 하기 위한 이중 분석에 따라 간단 하 고 빠른 방법에 설명 합니다. 전립선 암 (RNaseP, 일반 복사 번호 상태에 있는 것으로 알려져 내부 표준 기준 유전자로 intron 5 아칸소 (Xq12)의 다른 두 유전자 내에서 두 개의 다른 게놈 지역에 설계 된 두 개의 다른 PCR 분석 실험을 고려 14q11;에 전1, 1에 위치한 p 34). 우리는 정밀도 결과의 감도 증가 한 실행 하는 것이 아니라 두 기준 유전자 선택. 60의 DNA 양을 ng 각 분석 결과 조합 (결합 된 분석 결과 대 한 아칸소-assay_1 + RNaseP와 아칸소-assay_2+ AGO1)에 대 한 증폭 되었다. 건강 한 남성에서 3 개의 혈 청 또는 플라스마 DNA 샘플 풀링 되었고는 교정기로 사용. 우리 고려의 차단 > 아칸소 이득에 대 한 1.5와 < 삭제 0.5. 이 방법의 주요 장점 중 하나입니다 그것은 유연 하 고는 다른 유전자 또한 평가 될 수 있다, 변화 하는 표준 내부 기준 유전자 종양 유형 및 특성에 근거 하 여.

프로토콜

복사 번호 분석을 위한 실시간 PCR을 수행 하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플에서 DNA의 격리 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. DNA 추출, DNA 수량 제어 (분 광 광도 계)와 특정 대상에 대 한 실시간 PCR 수행 했다. 그림 1, 절차 및 타임 라인의 요약 보고 합니다.

프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 혈 청 수집 및 처리

1. 약 5 mL의 전 혈 혈 청을 얻기 위해 응고 제 없이 혈 청 튜브에 수집 합니다. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.
2. 4 ° c.에 15 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기 튜브
3. 조심 스럽게 2 mL 튜브에 혈 청을 전송 합니다.
4. 수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.

2. 플라즈마 수집 및 처리

1. 플라즈마를 EDTA와 플라즈마 튜브에서 약 10 mL 전 혈을 수집 합니다. 튜브를 완전히 작성 하 고 8 시간 그것을 반전. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.
2. 튜브는 원심 분리기에 없는 브레이크 설정 실 온에서 15 분 동안 1800 x g에서 원심
3. 조심 스럽게 2 mL 튜브에는 플라즈마의 위쪽 부분을 전송 합니다. 화이트 셀 레이어 위에 상쾌한의 적어도 1 mL을 떠나는 전송을 반복 합니다.
   참고: 셀 또는 셀 파편 오염 위험 감소는 상쾌한의 위쪽 부분을 전송.
4. 수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.

3. DNA 분리 혈 청 또는 혈장에서

주: 혈 청 또는 플라스마에서 DNA의 분리 수행 되어야 한다 상업 프로토콜 다음 단계에서 수정을 사용 하 여.

1. (0.5에서 2 mL에 포함 되는) 하는 한 약 수 혈 청 또는 플라스마 실 온에서 녹여
2. 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 명확한 1.5 mL 튜브에 혈 청 또는 혈장 0.5 mL를 전송. -80 ° c.에 재료의 나머지를 고정
3. 샘플에 직접 가수분해 k (20 mg/mL)의 50 µ L를 추가 합니다.
4. 샘플에 0.5 mL의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 pipetting으로 잘 혼합.
5. 튜브를 닫고 열 블록에 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품 어.
6. 제조업체의 지침에 표시 된 대로 표시 된 양의 100% 에탄올 워시 버퍼 1과 2에 추가 합니다.
7. 실내 온도에 다시 샘플을 가져올 하 고 절대 에탄올의 0.5 mL을 추가 pipetting으로 잘 혼합.
8. 3.7 분리 및 6000 x g에서 원심 분리기는 1 분 동안에 단계에서 얻은 혼합물의 650 µ L를 추가 합니다.
9. 통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브에 열을 놓습니다. 3.8 및 3.9 단계 한 번 더 반복 합니다.
10. 습윤 열과 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 1, 500 µ L를 추가 합니다.
11. 통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.
12. 습윤 십 분 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 2, 500 µ L를 추가 합니다.
13. 통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.
14. 최고 속도로 (20000 x g) 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 3 분 원심.
15. 장소는 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 열. 차입 버퍼의 150 µ L을 추가 하 고 해당 버퍼 늦으면 열 수 있도록 7 분을 기다립니다.
16. 1 분 동안 8000 x g에서 원심.
17. DNA의 최대 복구를 보장 하기 위해 1 분 동안 다시 같은 열과 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기에 단계의 3.16 elute 플라스틱

4. DNA 정량화 및 희석

1. 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 정량화를 수행 합니다. 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 제조 업체의 지시 당 벤치 정상 분 광 광도 계에.
   참고: 경우 DNA 수량 실시간 PCR를 계속 충분 하지 않습니다 (적어도 120 ng), 새로운 DNA 분리 과정을 수행.
2. 마지막 볼륨 (약 50 µ L) 모든 실시간 PCR를 위한 충분 한 2.5 ng / µ L를 혈 청 또는 플라스마에서 DNA를 희석.

5. 실시간 PCR

1. Thaw 복사 번호 분석 실험, 참조 유전자 분석 결과, 희석 DNA 샘플 및 교정기 얼음에 풀링된. 실 온에서 4 ° c.에 저장 된 마스터 믹스 equilibrate
2. 각 샘플의 풀링된 교정기 3 복제에 대 한 대상 분석 결과의 참조 유전자 분석 결과, 1 µ L, 믹스 마스터의 10 µ L의 1 µ L의 혼합을 준비 합니다. 혼합 부정적인 제어 (물) 및 2 추가 샘플을 준비 합니다.
3. 96 잘 접시, 각 우물에 혼합의 aliquot 12 µ L에서. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다.
4. 각 DNA 샘플의 각 음에 풀링된 교정기 8 µ L (2.5 ng / µ L의 농도)를 추가 합니다. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다. 각 잘에 대 한 팁을 변경 합니다.
   참고: 30 DNA 샘플 96 잘 접시를 사용 하 여 각 실시간 실험에 대 한 처리 수: 30 x 3 샘플 + 1 x 3 교정기 풀링된 + 부정 제어 = 94.
5. 짧게 1000 x g에서 접시를 회전 합니다.
6. 다음 프로토콜을 사용 하 여 접시를 실행: 15 95 ° C에서 40 주기를 10 분 동안 95 ° C에 단계 개최 s, 그리고 1 분 동안 60 ° C.

6. 데이터 분석 및 해석

1. 증폭 플롯 결과 아래에 "옵션" 섹션에서 첫 번째 대상 유전자 분석에 대 한 0.2에서 Ct 임계값을 설정 합니다. 각 대상 또는 참조 유전자에 대 한 집합을 반복 합니다. .Txt 확장명에 실시간 PCR 파일을 내보내려면, 도구 모음에 "내보내기"를 누릅니다. 플래그 "결과"만 선택 → 내보낼 데이터 선택 파일 형식으로는 확장명.txt → 언론 "수출 시작" → 가까이 내보내기 도구.
2. 분석 소프트웨어를 열고 가져올 파일.txt (도구 모음 → 가져오기).
3. 분석 하 고 도구 모음 (재생 기호)에 의해 분석 설정을 선택 파일 이름을 선택 합니다.
4. 보정 샘플 및 대상 ( AR 유전자에 대 한 복사예를 들어, 1)의 사본의 알려진된 수를 지정 합니다. 보도 자료 "적용 됩니다."
5. 각 샘플에 대 한 다른 우물에 비해 다른 델타 Ct (ΔCt) 한 음을 생략 합니다.
6. 실험 (언론 플레이 기호) 분석
7. 바 작 또는 테이블 복사본 수로 결과 평가 합니다.
   참고: 결과 테이블 자신감, Z-점수, 및 결과 해석에 대 한 도움이 될 수 있는 분석 복제 같은 여러 매개 변수를 포함 합니다.

결과

총 cfDNA 농도 모든 샘플 분석, 6.12 ng / µ L의 중간값을 보여주는 분 광 광도 법으로 정량 (범위: 2.00-23.71 ng / µ L) 혈 청 샘플 및 3.21 ng / µ L의 중간값 (범위: 2.31-8.49 ng / µ L) 플라즈마 샘플. 우리는 실시간 PCR 실험에 의해 총 115 샘플의 분석.

테스트 감도 복사 번호 분석에 대 한 보정 샘플으로도 사용 되는 건강 한 기증자 로부터 ...

토론

AR 혈 청 및 혈장 샘플에서 CN 분석 거세 저항 전립선 암 (CRPC) 환자의 계층에 대 한 새로운, 비-침략 적 접근 방식을 나타냅니다. 그것은 최근 증명 되었습니다 아칸소 CN CRPC 환자 화학 요법^7,8,,910전후 abiraterone와 enzalutamide, 치료 결과 예측 수 있다.

우리의 접근 방법의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
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BD Vacutainer EDTA Tubes	Becton Dickinson	366643	whole blood tube for plasma
Ethanol absolute	VWR		the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay	Thermo Fisher Scientific	4400291	Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates	Thermo Fisher Scientific	N8010560	plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	-	the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystem	-	the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	Software for copy number analysis