살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

요약

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

초록

살 모 넬 라 typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria S. 의 침공 후 typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 소포 저하 될 하기 위해 phagosomes로 알려진에 포함 된. 미 의 격리 typhimurium-포함 phagosomes 널리 사용 되었습니다 공부 어떻게 미 typhimurium 감염 세균 저하를 방지 하기 위해 phagosome 성숙의 과정을 변경 합니다. 고아 하 게, 포함 하는 박테리아의 격리 phagosomes 자당 기온 변화도 원심 분리에 의해 수행 되었습니다. 그러나,이 과정은 시간이 많이 걸리는, 이며 전문된 장비와 어느 정도의 손 재주. 여기에 설명 된은 미 의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 typhimurium-자석 구슬 biotin streptavidin 활용 된 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하. Phagosomes이이 방법으로 얻은 분석 실험, 단백질, 대사 산물, 및 지질 분석 등의 광범위 한 범위에 대 한 격리 된 phagosomes의 사용을 허용 하는 선택의 어떤 버퍼에 중단 될 수 있습니다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes 포함 된 특정, 효율, 빠른, 최소 장비를 요구 이며 자당 기온 변화도-ultracentrifugation 격리의 고전적인 방법 보다 더 다양 한.

서문

대 식 세포는 검색 하 고, 아마, 어떤 이물질 침입 박테리아 등 미생물까지 apoptotic 세포에서 주변 조직에 저하 전문된 phagocytic 세포 순환 하 고 있다. 병원 체 특정 마커 미생물 (병원 체 관련 된 분자 패턴 또는 PAMPs 라고도 함)의 표면에 일반적으로 존재의 표면 수용 체-중재 인식, 시 세포에서 세포 막의 복잡 한 개편 시작 서라운드 및 병원 체¹phagocytize 순서입니다.

몸부림치 병원 체 라고 phagosome 세포내 소포에서 대 식 세포에 의해 다음 포함 되어 있습니다. 일련의 융해 및 분열 이벤트 endosomes 리소좀 등 다른 소포를 통해 병원 체 포함 phagosome phagosomal 콘텐츠 제거에 필요한 단백질의 집합을 가져옵니다. 따라서,는 phagosome의 효소 구성 phagosome 성숙²로 알려진이 프로세스 과정에서 매우 변수입니다.

식 균 작용, 복잡 한 vacuolar ATPase (v-ATPase) phagosome 막 endosomes³융합에 의해 통합 됩니다 multimeric 직후 이 복잡 한 phagosome⁴의 루멘에 cytosol에서 펌프 양성자에 ATP를 사용합니다. 산성화는 phagosome의 다른 소포⁵ 퓨전 이벤트와 pH-종속 degradative 효소⁶의 큰 숫자의 활성화를 위해 필수적 이다. 또 다른 multimeric 효소 복잡 한 phagosome 멤브레인에 신속 하 게 조립 하는 NADPH 산화 효소 (NOX) 복잡 한이입니다. NOX 복잡 한 반응성 산소 종 (선생님)을 phagosome 루멘으로 은닉 되 고 몸부림치 미생물⁷의 살인에 크게 기여를 생성 하기 위하여 NADPH 산화 한다.

성숙의 초기 단계 동안 phagosomes Rab5 등 각각⁸v ATPase V₀ 소 단위와 함께 초기 및 늦은 endosomes의 Rab7 일반적으로 마커를 제시. Phagosomes 늦은 endosomes와 리소좀의 융합 결과 cathepsin 프로 테아 제, lipases, β-galactosidase⁹등 가수분해 효소의 다양 한 phagocytized 병원 체의 노출. 루멘의 산성화는 또한이 효소의 활성화를 위해 필요 합니다. 예를 들어 활성 약식 생산 cathepsin D의 분열 pH 의존¹⁰입니다. 이 효소는 병원 체를 저하 하 고 병원 체 파생 짧은 펩 티 드의 macrophage 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 클래스 II 분자 T 세포는 적합 한 면역 반응¹¹하에서 제공 하는 생산을 중재.

따라서 phagosome 성숙은 타고 난 면역 반응에 대 한 중요 하 고 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 팔. 그것은 전혀 놀라운 병원 체 phagosome 성숙의 위 설명 된 과정을 통해 세포에 의해 제거 극복 하는 전략을 진화 했다. 예를 들어 결핵균 , 레지오 넬 라 pneumophila 세포내 박테리아 방지 억제 v ATPase 어셈블리 및 필연적인 루멘 산성화^{12,13 phagosome 성숙} . 다른 박테리아, Listeria monocytogenes 등 Shigella flexneri cytosol^14,15로 탈출 phagosome 막에서 기 공 형성 유도. 다른 한편, 살 모 넬 라 enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) ¹⁶의 복제 대 한 적당 한 위치에 그것을 변환 하는 공포에서 phagosome의 속성을 수정할 수 있다. 이 능력은 미 typhimurium phagosome 성숙의 병원 체 중재 간섭 공부에 매우 흥미로운 모델.

S. typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria, 미 의 침공 후 Typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 phagosomes¹⁷내 포함. 일부 보고서는 그 미 를 앞에서 설명한 typhimurium-포함 phagosomes 제시 endosomes와 리소좀¹⁸, 제조 업체 및 다른 연구 phagosome 리소좀 퓨전 S. 시 방해 발견 Typhimurium 감염¹⁹.

처음, phagosome 성숙 미 시 typhimurium 감염 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 조사 했다. 포함 하는 박테리아의 고립에 대 한 기술의 개발 phagosomes endosome와 리소좀 마커 점에서 phagosome 내용의 더 정확한 연구를 활성화. 날짜, 포함 하는 박테리아의 절연에 사용 되는 주요 방법 phagosomes 자당 단계 그라디언트^18,20subcellular 분류입니다. 그러나,이 방법은 여러 원심 분리 단계를 phagosomes 기계적 손상 될 수 있습니다, phagosomal 구성 요소 (단백질, 지질)의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 시간이 소요 됩니다 필요 합니다. 또한, 그것 요구는 ultracentrifuge의 사용: 모든 실험실에 대 한 액세스할 수 있는 특수 장비의 한 조각.

최근, 새로운 접근 포함 하는 박테리아의 고립에 적용 된 phagosomes, biotinylated lipopetide (Lipobiotin)와 나중 세균성 병원 체는 분류는 streptavidin 활용 자석 구슬^{21 사용 하 여 추출} . 우리는 streptavidin 활용 자석 구슬 이어서 세균성 표면 아민 함유 고분자 NHS-비오 틴의 라벨 다른 보완적인 방법을 제안 합니다. Phagosomes이 메서드에서 얻은 endosome와 리소좀 표식에 풍성 하 게 높은 고 분석 실험, omics 분석 단백질 분석에서의 광범위 한 범위에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 ultracentrifuges 같은 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 원심 분리 단계를 제거 함으로써 phagosomes에 기계적 손상 및 고용 시간을 상당히 줄일 수 있습니다. 이 메서드는 phagosomes 포함 하는 다른 박테리아는 그람 양성 포도 상 구 균,이 원고에 포함 등의 절연에 대 한 쉽게 적응 될 수 있다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 단순 하 고, 비용 효율적인, 그리고 자당에 의해 클래식 격리 보다 소비 하는 시간이 적은 그라데이션-ultracentrifugation, 높은 렌더링 농축 박테리아 포함 된 phagosomes.

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프로토콜

병원 성 미의 사용을 포함 하는 모든 단계 typhimurium BSL-2 또는 더 높은 생물 학적 보안 수준의 시설에서 실시 해야 합니다. 문화와 미의 코팅 골 수 유래 세포 (BMDMs)의 감염 뿐 아니라 Typhimurium, 오염을 방지 하기 위해 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. 미의 격리 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 어떤 BSL-2 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다.

대 식 세포로의 분화에 대 한 쥐에서 골의 추출에 동물 복지 기관 지침에 따라 수행 되었고 자연, 북쪽 라인 강 Westphalian 국가 기관에 의해 승인 환경 및 소비자 보호 [Landesamt 위한 Natur, Umwelt 및 Verbraucherschutz (LANUV) 노르 트 베스트 팔 렌; 파일 번호: 84-02.05.40.14.082와 84-02.04.2015.A443]와 쾰른 대학.

1. Culturing S. typhimurium

Inoculate S.

typhimurium (SL1344 스트레인) 세균성 루프를 사용 하 여 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물의 5 mL로 단일 세균성 식민지에서.
1. 떨고와 하룻밤 37 ° C에서 인큐베이터에서 세균성 정지를 품 어.
2. 다음 날, 세균 현 탁 액의 1 mL 원뿔 플라스 크에서 BHI 국물의 19 mL로 하 고 떨고와 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어.
3. 모니터링 미 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 typhimurium 성장 nm (OD ₆₀₀)는 분 광 광도 계. 측정 30 분 마다 약을 복용 해야
4. 때 세 ₆₀₀ 1.0에 도달할 때, 인큐베이터 및 50 mL 튜브에 전송에서 세균 현 탁 액을 제거 합니다. 4에서 15 분 동안 5400 x g에서 박테리아를 원심 ° c.
5. 상쾌한을 제거 하 고 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 resuspend.
6. 4 ° c.에 15 분 동안 5400 x g에서 원심 분리기
7. 는 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS의 4.9 mL에 박테리아 resuspend.

2. S. typhimurium NHS-비오 틴/Streptavidin-활용 자석 구슬의 코팅

1. 10 mg/mL의 추가 100 µ L biotin 연결 솔루션 (NHS-비오 틴 디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 용 해) 갓 준비, 세균 현 탁 액 이전 단계에서 준비. 예를 들어 메 마른 DMSO의 0.5 mL에 NHS-비오 틴의 5 mg을 희석. 제대로 몇 번 위아래로 pipetting으로 믹스.
2. 5 1.5 mL 튜브에 믹스를 분할.
3. 350 rpm에서 일정 한 동요와 함께 실 온 (RT)는 thermoblock에에서 2 h에 대 한 품.
4. 튜브 RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 및 삭제는 상쾌한.
5. 살 균 PBS, RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 분리기의 1 mL에 resuspend 및 삭제는 상쾌한.
6. 솔루션 연결 초과 biotin을 완전히 제거 하려면 단계 2.5 두 번 더 반복.
7. 마지막 세척 후 살 균 PBS의 1 mL에 펠 릿 resuspend.
8. 1.5 mL 튜브에 10 mg/mL streptavidin 활용 자석 구슬 솔루션의 100 µ L를 전송 하 고 5 분에 대 한 자석 선반에 두고
9. 는 피 펫과 용 매를 제거, 자기 선반에서 streptavidin-활용 자석 구슬 솔루션 고 biotin 코팅 세균 현 탁 액 단계 2.7에서에서 준비의 1 mL와 함께 그것을 resuspend.
10. 350 rpm에서 일정 한 동요와 thermoblock에 RT에 1 시간에 대 한 품.
11. 솔루션에 자석 랙; 5 분 기다려 놓고 다음 벽에 고착 하지 않았다 박테리아는 피 펫으로 제거 (튜브로 계속 " 비 코팅 박테리아 "). 자석 접촉 튜브의 벽에 준수 하는 분수는 비오 틴/streptavidin 입히는 박테리아.
12. 자석 선반에서 레이블이 박테리아를 포함 하는 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 resuspend.
13. 자석 선반에 그것을 다시 배치, 5 분 대기 고는 피 펫을 사용 하 여 PBS를 제거.
14. 는 streptavidin 활용 자석 구슬에 입힌 모든 박테리아를 제거 하 2.13, 2.14 단계 두 번 더 반복.
15. 마지막 세척 후 코팅-박테리아 살 균 PBS의 500 µ L에 resuspend 하 고로 튜브 라벨 " 박테리아 코팅 ".
16. 계산 콜로 니 형성 단위 (cfu) 둘 다의 " 비 코팅 박테리아 " 및 " 박테리아 코팅 " BHI 한 천 배지에서 직렬 희석 도금 솔루션. 대략 2 x 10 ⁸ cfu/mL 코팅-박테리아의 1.0의 OD ₆₀₀와 초기 세균 현 탁 액의 20 mL에서 얻을 수 있습니다. 코팅-박테리아 정지 대 식 세포를 감염 하는 다음 날에 사용 될 4 ° C에서 유지.

3. BDMDs의 감염

1. 완전히 접시 때 박테리아 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 코팅은 같은 날 6 cm 요리 접시 당 5 x 10 ⁶ 세포의 밀도에서 차별화 된 BMDMs ²².
2. 다음 날, 4에 5 분 동안 15000 x g 코팅-박테리아 정지 원심 ° c.
3. 는 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에서 10 x 10 ⁶ cfu/mL의 농도에서 resuspend.
4. 10, 감염 (MOI)의 다양성에 대 식 세포를 감염 하는 BMDMs에서 매체를 제거 하 고 코팅-박테리아 정지 준비의 5 mL을 추가. 최적의 나 모든 셀 또는 격리 된 phagosomes의 실험 목적에 대 한 평가 수 있습니다.
5. 먹어서 동기화 10 분 RT에서 품.
6. 품 먹어서 시작 30 분 5% CO ₂ 배양 기에서 37 ° C에서. 다른 세포 유형 다른 보육 시간 박테리아의 국제화를 위해 필요할 수 있습니다.
7. 요리에서 박테리아를 포함 하는 매체를 제거 하 고 비 내 면 박테리아를 제거 하 RPMI 셀 세 번 세척.
8. 마지막으로 어떤 비 phagocytized 박테리아를 죽 일 10 %FBS 및 50 µ g/mL gentamycin 포함 된 RPMI의 10 mL을 추가.
9. 원하는 시간 까지는 5% CO ₂와 37 ° C에서 감염 된 BMDMs를 품 어. 원하는 시간 포인트 박테리아 및 셀 형식 사용 및 분석의 목적에 따라 실험적으로 결정 되어야 합니다. 미에서 초기 phagosome endosome 퓨전 이벤트의 연구에 대 한 Typhimurium 감염 BMDMs 30 분 부 화는 것이 좋습니다. 나중에 이벤트의 분석을 위한 phagosomes 2 h 또는 외피의 4 h 후 추출할 수 있습니다. 미와 대 식 세포의 장기 배양 24 시간 넘어 Typhimurium 대 식 세포의 죽음에서 발생합니다. 확장 세포내 감염 전에 phagosome 추출 아마 비오 틴 분자의 저하로 이어질 수 있습니다. 그러나, 우리가 않았다 관찰 하지 코팅-박테리아에 biotin의 손실까지 24 h.

4. 미의 격리 typhimurium-Phagosomes 포함 된

1. 준비 필요한 phagosome 볼륨 절연 버퍼는 (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl ₂, 5mm EGTA) 1 m m, Cytochalasin B는 최종의 최종 농도를 dithiothreitol (DTT)을 추가 하 여 제조업체에서 권장 하는 대로 10 µ M, 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 농도.
   참고: DTT와 Cytochalasin B에 추가 되어야 합니다 phagosome 절연 버퍼는 사용 전에 항상 즉시. Cytochalasin B 방해 세포 골격, 세포 막의 파열을 촉진.
2. 원하는 시간에 포인트, 감염 된 세포에서 매체를 제거 하 고 실시간에 따뜻하게 살 균 PBS로 세척
3. Phagosom의 추가 750 µ Le 절연 접시 당 A를 버퍼링 하 고 얼음에 20 분을 품 어. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 A의 볼륨 비례적으로 조정 되어야 합니다.
4. 추가 250 µ L phagosome 절연 버퍼 B (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl ₂, 5mm EGTA, 220 mM 마 니 톨, 및 68 mM 자당). 버퍼는 접시의 전체 표면에 도달 되도록 접시 바위. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 B 양의 비례적으로 조정 되어야 합니다.
5. 고무 경찰관을 사용 하 여 부드럽게 된다고 하 여 접시에서 셀을 제거 하 고 미리 냉장된 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.
6. 세포 현 탁 액 26 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 적어도 15 번 (한 포부와 한 번으로는 셀 서 스 펜 션의 한 방출) 통과. 이것은 BMDMs의 cytosolic 콘텐츠 공개 충분 하다. 바늘을 통해 전달 수 모든 세포 유형에 대 한 최적화 해야 합니다.
7. 자석 선반에 세포 현 탁 액을 배치 하 고 5 분을 기다립니다. 자석에 부착 된 입자는 포함 하는 코팅-미 phagosomes Typhimurium입니다. 세포 구성 성분의 나머지를 포함 하는 정지.
8. 정지로 1.5 mL 튜브에 전송 " cytosol ".
9. 자석 선반에서 분리 된 phagosomes와 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 그들을 resuspend.
10. Phagosome 정지 자석 선반에, 5 분 대기 장소와 PBS를 제거.
11. 4.9-4.10 격리 미를 씻어 반복 단계 typhimurium-포함 하는 phagosomes.
12. 는 마지막으로 PBS를 제거 하 고 필요한 버퍼; 예를 들어 단백질 분석에 대 한 radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼는 phagosomes resuspend. 단백질의 약 50-200 µ g 샘플 셀의 초기 금액 및 감염의 나에 따라,이 프로토콜에 따라 당 얻은 것입니다.

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결과

포함 하는 박테리아의 고립이이 프로토콜에 의해 phagosomes 필요한 첫 번째 단계는 박테리아의 biotinylation. 우리는 그러므로 미 의 효과 평가 BMDMs biotinylated 감염의 confocal 현미경 분석에 의해 typhimurium biotinylation mCherry-S. typhimurium Cy5 Streptavidin 표시입니다. 간단히, BMDMs mCherry-S와 함께이 프로토콜에서 설명 된 대로 감염 되었다. typhimurium ...

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토론

미 의 격리에 대 한 새로운 방법 typhimurium-여기 설명 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 박테리아를 코팅 하 여 phagosomes를 포함 하. 부드러운 파괴 후 세포 막의, 포함 하는 박테리아 phagosomes 추출할 수 있습니다 쉽게 자기 선반을 사용 하 여. 우리는 박테리아의 라벨 염증을 유발 하는 병원 체의 용량을 유지 하 고 호스트 세포의 phagocytic 속성을 변경 하지 않습니다 보여줍니다. 중요 한 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Link NHS Biotin	Thermo Fisher Scientific	20217
FluidMag Streptavidin	Chemicell	4205
PIPES	Carl Roth	9156.2
MgCl2	Carl Roth	A537.4
EGTA	Carl Roth	3054.3
Sucrose	Carl Roth	4621.1
Mannitol	Carl Roth	4175.1
DTT	Sigma	43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail	Thermo Fisher Scientific	1861280
Cytochalasin B	Sigma	C6762
DYNAL or DynaMag Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2501
Bacterial loop (10µl)	Sarstedt	86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344	Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI	Biochrom	FG1415
PBS	Biochrom	L1825
Cy5-streptavidin	Invitrogen	SA1011
anti-beta-actin antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778
anti-mCherry antibody	Thermo Fisher Scientific	PA5-34974
anti-Rab5 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-46692
anti-Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-20943
anti-cathepsin D antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-6486
anti-Tomm20 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-17764
anti-calnexin antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-46669
anti-GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-20357