위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

요약

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

초록

3D 침입 분석을 개발 하 고, 그들의 microenvironment의 무결성을 영향을 주지 않고 세포를 연구 하는 도전 남아 있다. 전통적인 3D Boyden 챔버 필요한 셀은 원래 문화 위치에서 전치 하 고 새로운 환경에 이동와 같은 분석 실험. 뿐만 아니라이 microenvironment, 내부는 세포질 과정을 방해 하지만 그것은 종종 세포의 손실에 결과. 이러한 문제는 드문, 또는 그들의 microenvironment에 매우 민감한 세포와 거래 할 때 특히 도전. 여기, 우리 둘 다 문제를 방지 하는 3 차원 침공 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 이 분석 결과에서 세포는 잘 작은 내 도금 고는 ECM 매트릭스는 chemoattractant를 포함 하는 셀 위에. 이 없는 셀 변위를 요구 하 고 행렬에 위쪽으로 침략을 셀 수 있습니다. 이 분석 결과에서 셀 침공으로 세포 형태 콜라겐 젤 내 평가 될 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 희귀 하 고 민감한 세포;의 침략 적 용량 특징 유방암 세포 MCF7 고 엽/multipotent 사이의 융합에서 발생 하는 하이브리드 세포 줄기/기질 세포 (MSCs).

서문

세포 운동 성 세포의 정상적인 발달 및 생리 적 과정 이다. 그러나, 변화 패턴 및를 침공 하는 세포의 능력에 염증 성 질환 및 암 전이^1,2,3를 포함 하 여 병 적인 상태와 연결 됩니다. 전이 암에 가장 저조한 이해 측면. 전이, 암 세포 해야 합니다 여분의 세포 매트릭스 (ECM)을 저하를 현지 조직 및 intravasate를 침략. 혈액 순환, 암 세포는 먼 사이트에 유포 됩니다, 일단 extravasate 하 고 2 차 종양을 형성 한다. 따라서, 능력 저하는 ECM 셀, 마이그레이션, 침략 하 고 관련이 그들의 전이성 잠재력. 다른 방법은 분석 하 고 세포의 이동과 침략 기능 척도 개발 되었습니다. 가장 많이 사용 되는 접근 분석 결과, 시간 경과 현미경 검사 법, 그리고 Boyden 챔버 분석 결과 치유 하는 상처를 포함 한다. 상처 치유 분석 결과⁴ 와 시간 경과 현미경 검사 법은 간단 하 고 편리한 분석 셀 마이그레이션에 예비 통찰력을 줄 것 이라고. 그러나, 둘 다는 세포 생체 내에존재 하는 3D 환경을 반영 하지 않는 2D 분석 실험입니다. 연구 결과 세포 2D 한^5,6에 비해 3D 환경에 다르게 반응으로 나타났습니다. 또한, 상처 치유 분석 실험은 재현 하 고 양적 결과^7,,89를 어렵습니다. 셀 제외 영역 분석 결과, 분석 결과 치유 하는 상처의 3D 수정 이면 더 순수 관련 분석 결과 이지만 하이브리드 셀 셀 퓨전 이벤트^{10,11 인 등 수에 낮은 셀에 적합 하지 않습니다.} .

Boyden 챔버 분석 결과 세포 연구에 대 한 관련 microenvironments를 제공 하는 3 차원 분석 결과가 이다. 그러나, 그것은 그들의 원래 microenvironment에서 제거 하 고 예금 Boyden 분석 결과 시스템 마이그레이션 및 chemoattractant 포함 매체를 향해 아래쪽으로 침략의 위 상공으로 셀 필요 합니다. 이 3D 접근 취약 그들의 microenvironment 또는 제한 번호^10,,1112셀의 마이그레이션 및 침략 기능 분석에 적합 하지 않다. 셀 마이그레이션 및 침략을 분석 하는 새로운 접근은 미세 그라데이션 챔버 시험¹³. 적합 하 고 마이그레이션 및 침략에 신뢰할 수 있는, 비록이 분석 결과 더 비싼 이며 전형적인 실험실에 대 한 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기 그들의 microenvironment에 민감한 세포를 포함 한 많은 세포 종류와 호환은 숫자에 제한 된 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 후 퍼 그 외 여러분 에 의해 제안 된 프로토콜에서 적응 시켰다 ¹⁴.이 분석 결과에서 셀 그들의 원래 microenvironment 및 그들의 이동에 남아 있고 chemoattractant¹¹를 포함 하는 콜라겐 젤에서 위쪽으로 이동 침입 모니터링. 이 분석 결과 재현성 및 최적화 되었으며 35 m m 문화 접시에. 그것은 다른 세포 문화 크기, 다른 행렬 또는 접착, 및 다른 chemoattractants의 강도 포함 하 여 다른 시험 조건에 적응 시킬 수 있었다. 이 분석 결과 약 발견 과정에서 초기 심사를 위한 생체 외에서 플랫폼으로 될 수 있습니다.

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프로토콜

참고:이 프로토콜은 McArdle 외 에 설명 ¹¹. 시간 표시 막대를 그림 1에 제공 됩니다.

1입니다. 문화 접시의 준비

1. 유리 아래쪽의 hydrophobicity 낮은 15 분 1 mL의 1 M 염 산 (HCl)와 10 m m 유리 바닥을 포함 하는 35 m m 문화 접시 세척.
2. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 모든 HCl을 제거의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.
3. 70% 에탄올의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.
4. 셀 특정 문화 매체의 1 mL와 함께 문화 접시 린스 (여기, 사용 α-MEM 10% 열 보충 비활성화 FBS와 1% 비 본질적인 아미노산).
   참고: 대우 문화 접시 문화 매체를 포함 하는 다음 날까지 37 ° C에서 가습기와 CO₂ 인큐베이터에 저장할 수 있습니다.
5. 35 m m 문화 접시의 잘 처리 유리 하단에 100 %confluency 세포 (MSCs 및 MCF-7 공동 문화)를 성장. 공동 문화 35000 MSC 세포와 24 h MCF7 셀 75000.

2입니다. 콜라겐 젤의 준비

1. 접촉 시 콜라겐의 중 합을 방지 하기 위해 냉동 실에 콜라겐 젤 pipetting 사용 micropipette 팁을 저장 합니다.
   참고: 이것은 가장 중요 한 단계 이다.
2. 볼륨을 확인 사용 되 나 콜라겐의 농도에 따라 쥐 꼬리 콜라겐의. 이 분석 결과 대 한 콜라겐 젤 100 µ L를 준비 합니다.
   참고: 쥐 꼬리 콜라겐 나 재고의 높은 농도 더 작동 합니다. 10 배 따라 콜라겐을 희석 하는 데 사용할 Dulbecco의 수정이 글의 중간의 볼륨을 결정 합니다.
3. 난 (3.8 µ g/mL 증권), 10 x Dulbecco의 수정 독수리의 매체 및 1 x 세포 배양 매체 2% 태아 둔감 한 혈 청 및 2.4 mg/mL의 콜라겐의 최종 농도에 적절 한 chemoattractant 보충 얼음 쥐 꼬리 콜라겐에 결합.
4. 나트륨 중 탄산염 해결책 콜라겐 젤 중화의 혼합물 4.5%를 추가 합니다.
   참고: 나트륨 중 탄산염 솔루션 추가의 볼륨은 다른 시 약의 정확한 pH에 따라 달라질 수 있습니다. 이 pH 중립 해결책을 보장 하거나 산도 표시기를 사용 하 여 문화 매체에 스트립으로 혼합물을 테스트 하려면 좋습니다.
5. 바닥에 유리-잘 접시의 바닥 문화 내의 셀 콜라겐 혼합물의 80 µ L.
6. 37 ° c.에서 가습기와 CO₂ 배양 기에서 30 분 동안 유해를 콜라겐 젤 허용
7. 감소 된 혈 청 (2%)와 세포 매체의 2 mL와 함께 콜라겐 젤 커버 하 고 37 ° c 24, 48 또는 72 h에 대 한 가습기와 CO₂ 인큐베이터에서 세포를 품 어.
   주의: 접시는 콜라겐 젤 유리 바닥에서 분리 하지 않도록 주의 처리 되어야 합니다.

3. 콜라겐의 준비의 예 젤 3.8 µ g /mL의 쥐 꼬리 콜라겐 재고를 사용 하 여

1. 얼음, 쥐 꼬리 콜라겐의 114.5 µ L, DMEM, x 10의 16.6 µ L, 문화 매체를 포함 하는 chemoattractant의 33.1 µ L를 결합 한다.
2. 나트륨 중 탄산염의 14.0 µ L로 콜라겐 혼합을 무력화.
3. 2.5 단계에서 계속 합니다.

4. 셀의 이미징

1. 부드럽게 요리에서 미디어를 제거 합니다.
2. 부드럽게 1 mL의 PBS로 젤 린스.
3. 15 분 동안 4 %paraformaldehyde 1 mL와 함께 셀을 수정 합니다.
4. 두 번 1 mL의 PBS로 세포 세척.
5. DAPI 솔루션 (100 ng/mL) 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 얼룩.
6. Confocal 현미경을 사용 하 여 다른 위치에서 400 µ m z-스택 이미지를 16 µ m 단계에서 각 위치의 셀을 이미지. 사용 하는 현미경 confocal 영상 하얀 빛, 아크 여기 소스를 사용 하 여 수 있도록 단위 스캔 디스크가 있다. 0.75의 숫자 조리개와 활용 20 X 렌즈를 사용 합니다.
7. 이미지 reconstitute
   1. 주어진된 젤 (약 25 이미지)에 대 한 이미지를 열고 이미지 스택 스택 이미지 → 스택 → 이미지를 클릭 하 여 만듭니다. 첫 번째 이미지는 젤 아래쪽에 대응 (z = 0 µ m), 두 번째 이미지는 z 방향에서 첫 번째 단계에 대응 (z = 16 µ m), 세 번째 이미지는 z 방향에서 두 번째 단계에 대응 (z = 32 µ m). 각 이미지 깊이에 각 핵을 평가 하 고 있는 핵 했다 날카로운 초점에 해당 특정 셀에 대 한 침입 깊이 깊이 지정.

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결과

우리 유리 아래쪽와 쥐 꼬리 콜라겐 35 m m 문화 접시 사용 개발 하 고 생체 외에서 3D 침공 최적화 나 프로토콜을 분석. 우리는 유 방 암 세포 MCF7 및 MSC 보였다이 분석 결과 사용 하 여 셀 48 h 후 각각 0.04 ± 1.8 µ m 및 41.3 ± 76.0 µ m의 평균 거리에 콜라겐 젤으로 침략 수 때 IGF1 (18.6 ng/mL) chemoattractant (그림 2)로 사용 되었다. 더 중요 한 것은, 우리는 ?...

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토론

여기, 희귀 및 그들의 microenvironment에 의존 하는 셀을 포함 하 여 세포 유형의 다양 한 편리한 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 3D 침공 분석 결과에서 세포는 그들의 원래 microenvironment에 남아 하 고 콜라겐 젤 포함 하는 chemoattractant에 의해 보호 됩니다. 세포 이동 그리고 콜라겐에 침공. 이 분석 결과에서 셀 스테인드 고 쉽게 젤 내 모니터링 될 수 있습니다. 단순 하 고이 분석 결?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective