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요약

유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.

초록

간 암, 재생, 염증, 섬유 증의 연구 모델에서 vivo에서 유전자 발현 및 침묵에 대 한 유연한 시스템은 매우 유용 합니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 transposon 기반 구문 성인 쥐 hepatocytes의 유전자 조작에 대 한 효율적인 방법입니다. 제정 transgene 식 이외에 유전자 돌연변이 유도 하는 CRISPR/Cas9 시스템 또는 유도할 수 있는 시스템의 shRNA 중재 유전자 노크 다운, 의미 같은 고급 응용 프로그램에 대 한이 시스템을 사용할 수 있습니다. 여기는 transgene의 유도할 수 있는 표정과 함께 제정 있다 식의 조합 또는 선택의 미르 shRNA이 기술의 예로 제공 됩니다. 우리는 잠자는 미녀의준비에서 시작 하는 다단계 절차를 커버-transposon, 주입 및 마우스의 처리 및 분석에 대 한 간 조직 준비 하 여 구성 immunostaining. 제시 하는 시스템은 hepatocytes에서 복잡 한 유전자 조작을 달성 하기 위해 안정적이 고 효율적인 접근 이다. 그것은 Cre/loxP 기반 마우스 종자와 함께에서 특히 유용 하 고 다양 한 간 질환의 연구에서 모델에 적용할 수 있습니다.

서문

만성 간 질환 주요 건강 부담 전세계1를 선물 한다. 동물 연구 모델 간 질환의 연구에 필수적인 도구 이며, 간 재생, 간 염증, steatosis 뿐만 아니라 간 암2에 복잡 한 질문에 대답 하는 데 도움이. 이러한 동물 모델의 상당수는 간 세포의 유전 수정에 의존합니다. 따라서, hepatocytes에 유전자 발현을 조작 하는 효율적인 도구는 도움이3. 유전자 조작된 마우스 종자의 번 식 또는 hepatocyte 감염에 대 한 바이러스 성 벡터의 생성 등 설립된 방법 중 시간이 걸리고, 항구 안전 우려, 또는 vivo에서 hepatocytes에서 가난한 transgene 식 양보 4 , 5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입 (HTVI) 간에서 유전자 기능, 빠른, 쉽고 비용 효율적인 심문 허용 hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 대체 방법입니다. HTVI에 대 한 원하는 DNA 시퀀스를 들고 벡터 주입 된 동물의 몸 무게의 10%에 해당 하는 염 분의 볼륨에 녹입니다. 솔루션은 다음 5-10의6이내 꼬리 정 맥에 주입 됩니다. 심장 출력을 초과, 고 염 분에서에서 흐름 열 등 한 베 나 정 맥 간 확장 및 hepatocytes7의 유체역학 transfection 간 정 맥으로. 안정적인 게놈 통합을 달성 하기 위해 메서드 자 아름다움-transposon 시스템 등 transposon 기반 벡터와 결합 하고있다. 이 시스템 게놈 재결합 사이트 자 아름다움-transposase8,9에 의해 촉매와 대상 벡터의 재결합을 중재 한다. 간 섬유 증 또는 발암 모델, 그것은 종종 overexpress 또는 침묵 유전자 질병 모델의 특정 시간 지점에서 하는 것이 좋습니다. 이 목적에 대 한 Cre/LoxP 시스템 등 항생물질을 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 도구 (Tet에서) 사용된10될 수 있습니다.

여기, 우리가 잠자는 미녀 transposon-기반 시스템의 HTVI를 사용 하 여 murine hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 제정 tamoxifen 종속 Cre recombinase (크리스챤) 식으로 결합 하는 고급 벡터 시스템을 설명 하는 간 전용 모터의 제어 transgene의 안정적이 고 구성 적인 표현 위한 프로토콜 이외에 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 예측에 관한 적응 shRNA (미르-shRNA), pTC 라는 TET 시스템11. 이 벡터 시스템에서 유도할 수 있는 transgenes 또는 항생물질 종속 식 미르-shRNAs recombinational 복제 시스템, 새로운 벡터12의 신속 하 고 쉽게 생성 수 있도록 백본 벡터에 복제 됩니다. 이 비디오 기반 가이드 유도할 수 있는 transgene/미르-shRNA 식 달성에 적합 한 벡터, 주입 및 쥐의 치료의 준비 그리고 마지막으로 간 조직 분석에 대 한 준비를 다루고 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 식과 Cre/loxP 중재 마우스 시스템의 조합 또는 간 질환의 연구에 널리 적용 가능한 시스템을 만드는 선택의 어떤 유전자의 노크 다운 수 있도록 설계 되었습니다.

프로토콜

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행 하 고 (Regierung 폰 오베르 바이 엠, 뮌헨, 독일 및 스탠포드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 책임 당국에 의해 승인 했다 스탠포드, 캘리포니아, 미국)입니다. (단계 1-4) 복제에 대 한 모든 플라스 미드의 목록이 보충 테이블 s 1에에서 제공 됩니다.

1. 제정 유전자 발현에 있는 Transgene의 복제

  1. 디자인 transgene 증폭13,14를 위한 뇌관.
  2. PacI (TTAATTAA)에 대 한 앞으로 뇌관의 5' 끝에 금지 사이트를 추가 합니다. 반전 뇌관의 5' 끝에 AscI (GGCGCGCC) 또는 FseI (GGCCGGCC)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다.
  3. Transgene 원하는 transgene14에 최적화 된 조건을 사용 하 여 PCR에 의해 증폭. 상업적으로 이용 가능한 DNA 정제 키트를 사용 하 여 정화.
    참고: 시간을 어 닐 링 단계 1.1에서에서 설계 뇌관에 따라 달라 집니다., 신장 시간 구성의 길이에 따라 달라 집니다. 예: 신장 시간 1000 bp 길이 사용 60 s의 생성 합니다.
  4. 밤새 소화 transgene 및 제정 진 식15 각각 금지 nucleases (단계 1.2 참조)와 37 ° C에서 50 µ L의 전체 볼륨에 버퍼에 대 한 벡터. 예를 들어 소화 5 단위 PacI 구문 5 단위 FseI 적절 한 경우 (단계 1.2 참조).
  5. 젤 정화 소화 벡터 및 제조업체의 지침에 따라 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 삽입. 100 벡터의 ng와 65 ° C에서 10 분 동안 400 U t 4 리가 14 ° C 16 헤 열에서 비활성화를 사용 하 여 삽입의 100-1000 ng의 표준 결 찰을 수행 합니다.
  6. 유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.
  7. Agar에 접시 접시 포함 100 µ g/mL 암 피 실린. 24 h 30 ° C에서 품 어.
  8. 단일 식민지를 선택 하 고, 제조업체의 지침에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 생어 시퀀싱17 에 의해 순서를 확인 (시퀀싱 뇌관: 5' 3' TGCTGGAGTTCTTCGCC).
  9. 긍정적인 식민지 맥시에 대 한 플라스 미드 DNA의 증폭을 조정 하 고 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 준비 키트18 를 사용 하 여 정화를 사용 합니다.
  10. 구문 주입에 대 한 준비가 되어, 따라서 5 단계를 계속.

2. 복제는 Transgene의 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한

  1. 디자인 transgene 증폭13,14를 위한 뇌관.
  2. 앞으로 뇌관의 5' 끝에 SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT), 또는 KpnI (GGTACC)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다. 반전 뇌관의 5' 끝에 노트 (GCGGCCGC) 또는 XhoI (CTCGAG)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다.
  3. Transgene 원하는 transgene14에 최적화 된 조건을 사용 하 여 PCR에 의해 증폭. 상업적인 DNA 정제 키트를 사용 하 여 정화.
  4. 순화 transgene 항목 벡터의 4 µ g를 소화 (pEN_TTmcs-벡터, 재료의 표참조) 적절 한 제한 nucleases (단계 2.2 참조)와 하룻밤에 37 ° C에서 50 µ L의 전체 볼륨에 버퍼 별도로19 .
  5. 젤 정화 소화 벡터 및 제조업체의 지침에 따라 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 삽입. 100 벡터의 ng와 65 ° C에서 10 분 동안 400 U t 4 리가 14 ° C 16 헤 열에서 비활성화를 사용 하 여 삽입의 100-1000 ng 표준 결 찰을 수행 합니다.
  6. 유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.
  7. Agar에 접시 포함 15 µ g/mL gentamicin 접시. 16 h 37 ° C에서 품 어.
  8. 단일 식민지를 선택 하 고, 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 시퀀싱17 pCEP 앞으로 뇌관을 사용 하 여 삽입을 확인: 5' 3' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG.
    참고: 단일 식민지에 PCR 뇌관 pCEP 앞으로와 이전 정화 없이 수행할 수 있습니다 그리고 pCEP 리버스 (5' 아가 아 그 CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). 이 단계는 긍정적인 식민지의 사전 선택에 대 한 유용한 할 수 있다.
  9. 4 단계로 진행 합니다.

3. 복제 미르 shRNA 유도할 수 있는 유전자 때 려 눕에 대 한의

  1. 복제 프로토콜19pSLIK에 따르면 미르 shRNA oligonucleotides 디자인. Anneal oligonucleotides 정화 하 고 희석 ddH2오 1시 20분
  2. 3 h 50 ° C에서 5 U BfuAI 항목 벡터의 다이제스트 3 µ g 다음 20 분 동안 65 ° C에서 반응 비활성화.
    참고: 녹색 형광 단백질 (GFP)의 공동 식 바란다면 그렇지 않으면 사용 pEN_TTmiRc219, 항목 벡터로 pEN_TTGmiRc19 을 사용 합니다.
  3. 젤 정화 단계 2.5에서 소화 벡터. 100의 표준 결 찰 수행 벡터의 ng와 1 µ L의 정화 및 희석 shRNA oligonucleotides (3.1 단계) 400 U t 4를 사용 하 여 리가 1 헤 열에 대 한 실 온에서 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화.
  4. 유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.
  5. Agar에 접시 포함 15 µ g/mL gentamicin 접시. 16 h 37 ° C에서 품 어.
  6. 선택 단일 식민지, 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 생어 시퀀싱17 에 의해 삽입을 확인 (시퀀싱 뇌관: 5' 3' TAGTCGACTAGGGATAACAG).
  7. 4 단계로 진행 합니다.

4. recombinational 복제 준비에 대 한 주입 클론을 생성 하

  1. (2 단계 또는 3 단계)에서 입력 벡터의 믹스 150 ng, 150 pTC의 ng TET 벡터20.
  2. TE 버퍼 8 µ L의 총 볼륨을 추가 (pH = 8).
  3. LR clonase 효소 혼합 II ( 재료의 표참조), 얼음에 품 어 2 분 소용돌이 대 한 두 번 전송 합니다.
  4. 반응에 LR clonase 효소 혼합 II 2 µ L을 추가 하 고 1 시간에 25 ° C에서 품 어.
  5. 가수분해 K-솔루션의 1 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  6. 유능한 박테리아 recombinational 복제의 2 µ L 혼합16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 Stbl3를 변환.
  7. Agar에 접시 접시 포함 100 µ g/mL 암 피 실린. 24 h 30 ° C에서 품 어.
  8. 선택 단일 식민지, 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 준비 키트18 를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 벡터 무결성 생어 시퀀싱17 (시퀀싱 뇌관 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3')입니다.
  9. 구조는 주입에 대 한 준비, 5 단계를 계속.

5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입에 대 한 솔루션을 준비합니다.

참고: 제정 및 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 구문의 준비 단계 1, 2, 3, 및 4에에서 설명 되어 있습니다.

  1. 살 균 0.9% 식 염 수 주입에 대 한 준비 (사용 PBS 하지 않습니다). 마우스 몸 무게의 약 10%에 해당 하는 볼륨을 사용 합니다. 예: 마우스 무게 20 g, 2 mL 솔루션의 준비.
  2. (각각 1.8 또는 4.8, 단계 참조)도 무료 플라스 미드 정화 키트18 을 사용 하 여 정화 된 주입 경로 준비 합니다.
  3. 10 µ g 또는 잠자는 미녀 도 무료 벡터 구문의 15 µ g 추가 (단계 1 사용 10 µ g에서에서 단계 4 사용 15 µ g, 각각)와 무료 pc-HSB521 살 균 염 분의 mL 당 1 µ g.
  4. 최대 4 h 4 ° c.에 대 한 저장소 솔루션 고정 하지 마십시오.

6. 수행 유체역학 꼬리 정 맥 주입

  1. restrainer를 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입 (상업적 또는 구멍 호흡 및 꼬리 50 mL 원뿔 튜브에서 준비). 휴지로 튜브의 하단을 채우십시오.
  2. 주입, 20-25 g의 무게와 나이의 약 8-10 주의 마우스를 사용 합니다.
  3. 주입 하기 전에 마우스 무게와 몸 무게에 따라 주입 볼륨 준비 (몸 무게의 10%를 해당 단계 5.1 참조). 27 G-바늘으로 살 균 3 mL 주사기 주입 및 필요한 볼륨을 채우기 위한 준비.
  4. restrainer에 마우스를 놓습니다. 휴지의 양을 조절 (단계 6.1 참조) 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있지만 운동에 대 한 최소한의 공간을 두고.
  5. 마우스 정기적으로 호흡을 확인 합니다.
  6. 따뜻한 신중 하 게 30-60 미에 대 한 적외선 램프를 사용 하 여 꼬리의 과열 징후에 대 한 감시.
  7. 꼬리는 알코올 면봉으로 청소 합니다.
  8. 거의 수평으로 꼬리의 기지에 가까운 두 측면 꼬리 정 맥 중 하나에 바늘을 삽입 합니다.
    참고: 성공적으로 배치, 바늘의 콘에 다시 혈액의 작은 양의 흐름 수 있습니다. 그것은 적극적으로 발음으로 바늘의 어떤 추가적인 움직임의 변위 및 정 맥의 상해에 발생할 수 있습니다 권장 하지 않습니다.
  9. 총 볼륨 8-10 s 내 꼬리 정 맥에 주사.
  10. 즉시는 restrainer에서 마우스를 제거 합니다. 적어도 30에 대 한 상처는 사출 압축 s 또는 출혈이 라 앉 다 때까지.
  11. 별도 감 금 소에 마우스를 놓습니다. 마우스는 절차 (약 30-60 분)에서 회복 하 고, 일단 마우스 다시 전송 그것의 원래 감 금. 정기적으로 다음 24 h에 대 한 마우스에 확인 하십시오.
    참고: 마우스의 온화한 진정은 정기적으로 관찰 2 h까지 주입 후.
  12. (즉, 7 단계) 추가 실험을 계속 하기 전에 통합 되지 않은 벡터의 10-15 일을 기다립니다.

7입니다. Tamoxifen Transfected 크리스챤의 유도

주의: Tamoxifen은 유해한, 수 암 또는 다 산을 손상. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.

  1. 3 일에 복 tamoxifen 주사를 계획 한다.
  2. 1 일, 40 µ L 에탄올에 tamoxifen의 10 mg을 디졸브. 품 어 55 ° C 10 분 소용돌이에서 여러 번은 tamoxifen 해산 했다 때까지.
  3. 960 µ L 옥수수 오일을 추가 합니다. 55 ° c.에 5 분 동안 품 어 소용돌이 명확한 솔루션을 여러 번.
  4. 27 G 바늘 1 mL 인슐린 주사기에 솔루션을 준비 합니다.
  5. 아저씨 엄지와 두 번째 손가락으로 신중 하 게 마우스의 목 잡아서 마우스 손 기지와 넷째와 다섯째 손가락 사이 꼬리를 고정.
  6. 솔루션의 0.1 mL (= tamoxifen의 1mg) 주사 intraperitoneally 복 부의 왼쪽된 하단 사분면에.
  7. 2-3 일에 주사를 반복 합니다.

8. 항생물질 종속 유전자 또는 shRNA 식의 유도

주의: Doxycycline 해로울 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.

참고: 형식 실험의 기간에 따라, doxycycline 공급 될 수 있다 식용 수 (8.1 단계) 또는 차 (8.2 단계)

  1. 짧은 기간 실험 (< 10 일) 다음 프로토콜을 사용 하 여 식 수를 통해 doxycycline 관리.
    1. 수도 물 100 mL에 5 g 자당 분해. 오토 클레이 브.
    2. 100mg doxycycline-hyclate 15 mL 원뿔 튜브에 자당 솔루션 (단계 8.1.1) 5 mL에 용 해.
    3. 살 균 필터 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션 10 mL 주사기를 사용 하 여. 8.1.1 단계에서 준비 된 자당 솔루션에 추가 합니다.
    4. 마우스에 식용 수로 doxycycline 자당 솔루션을 제공 합니다. 솔루션 세균성 무성 (늦어도 3 일 후 바꾸기 명확한 솔루션)을 나타내는 흐린 때 매일 및 대체를 확인 합니다.
  2. 장기 실험에 대 한 (> 10 일) 또는 실험 신진 대사 변화에 민감한 상업 doxycycline-차 우 사용 (예를 들어, Doxycycline Hyclate 차 우 0.625 g/kg) 탈수 또는 치료 동물의 간에서 자당 유도 된 변화를 피하기 위해.

9. Immunostaining 분석에 대 한 마우스 간의 준비

주의: Paraformaldehyde 해로울 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.

참고: 마우스를 분석할 것 이다 때 timepoint 실험에 따라 달라 집니다. 3 일 이상 transgene 또는 shRNA 식의 충분 한 유도 되도록 doxycycline 치료 후 간 조직을 분석 하는 것이 좋습니다.

  1. 4 %paraformaldehyde 솔루션 (PFA)의 1 mL를 27g 바늘 1 mL 주사기를 준비 합니다.
  2. 승인 된 동물 프로토콜에 따라 적절 한 방법으로 마우스를 안락사.
    참고: 안락사의 적절 한 방법에 대 한 지침 교육 기관에 따라 달라질 수 있습니다.
  3. 해가 위와 집게를 해 부 사용, 신중 하 게 노출 간 중간 개복 술과 복 부 구멍을 열어. 소장 포털 정 맥와 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)를 오른쪽으로 이동 합니다.
  4. 준비 된 주사기의 바늘을 삽입 (단계 9.1 참조)는 IVC와 포털 정 맥으로. 간 조직 perfuse (바람직한 수행 됩니다 immunofluorescent 얼룩 경우) 자동 형광 적혈구를 제거 하 IVC로 PFA의 1 mL를 천천히 주사.
  5. 간을 제거 합니다. 물에 헹 구 고 4 %PFA 솔루션의 5-10 mL을 전송.
  6. 파라핀 섹션, 36-48 h. 조직에 대 한 수정 조직 탈수 및 파라핀 포함에 대 한 준비입니다.
  7. 냉동된 섹션에 대 한 수정 조직 4%에서 PFA 1 h.
    1. Cryoprotection에 대 한 10% 자당 해결책에 전송 합니다. 60 분을 품 어.
    2. 20% 자당 해결책을 전송. 60 분을 품 어.
    3. 30% 자당 해결책에 전송 합니다. 12-16 h. 소스 포함에 냉동된 섹션에 대 한 복합 incubate 고-20 ° c.에 동결

결과

유체 꼬리 정 맥 주입 하 여 transfection 효능: Hydrodynamically 단일 주사로 페는 murine hepatocytes의 비율 변수 이며 여러 매개 변수 주입 량, 주입 시간, 주입 된 DNA의 양과 주입된 구성6,의 크기에 따라 달라 집니다. 22,23. 또한, transfection 효율 큰 정현파 지역 뿐만 아니라 더 큰 혈관 직경 전체 압력?...

토론

유체역학 꼬리 정 맥 주사로 hepatocytes의 transfection 되고있다 설립된 방법 그것의 소개부터 15 년 이상 전6. 주입 된 볼륨 심장 출력을 초과 하 고 간7, 어떤 경우에 약 10-20%의 transfection hepatocytes25,26의 40%까지 이어지는의 사인으로 열 등 한 베 나 정 맥에서 흐른다. 예언자는 성공적인 transfection 주입된 시간22<...

공개

저자 공개할 게 없다

감사의 말

이 작품은 독일 Krebshilfe, 독일 (부여 번호 111289 UE), 어린이 건강 (어니스트와 아멜리아 Gallo 부여 박사 원정대-CTSA 보조금 번호 UL1 RR025744 UE)의 루 패 커드 재단에 의해 지원 되었다. 우리는 벡터 구문에 대 한 박사 마크 A. 케이 감사 하 고 실험 조언과 박사 줄리앙 세이 지 마우스이 고 실험적인 지원.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583embedding of cryo-sections
Biozym LE AgaroseBiozym840004
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-SaccharoseCarl Roth4621.1For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium SaltAppliChemA0839,0010For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Broth (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. MediumThermo Fischer15544034
Gentamicin sulfateAppliChemA1492,0001For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 %Fa. RothP087.6para-formaldehyde solution
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen/ThermoFisher11791-020contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent CellsThermo Fisher11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo FisherC737303
NameCompanyCatalog NumberComments
Restriction Enzymes
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean UpMacherey & Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Nagel740571Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo FisherF530S
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 mlBraun9166017VFor intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 mlBraun4616025VFor intravenous injection
Sterican Cannula 24GBraun4657675
Sterican Cannula 27GBraun4657705
TamoxifenSigma-AldrichT5648-1GFor CreER activation
Corn oilSigma-AldrichC8267-500MLCarrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclateAppliChemA2951,0025Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml SyringeBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001For filtration of doxycycline
NaCl 0,9%Braun3200905Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50mlCorning Life Science352095
Infrared LampN/AN/AFor warming of mouse tail
IVISPerkin Elmer124262In vivo imaging system
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTCn/aVector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcsAddgene #25755Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

참고문헌

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

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