Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

요약

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

초록

단백질 단백질 상호 작용은 릴레이 신호 변환 가장 세포질 과정;에 대 한 기본 메커니즘 그러므로, 소설 단백질-단백질 상호 작용 쌍 및 단백질 상호 작용 역동성을 모니터링 드러내는 식물 환경 요인 및 발달 신호에 응답 하는 방법에 대 한 특별 한 관심의 이다. 접근의 과다 단백질 단백질 상호 작용, 체 외에서 또는 vivo에서검토 개발 되었습니다. 그 중 최근에 설립 된 luciferase 보완성 (협회) 이미징 분석 결과가 이다 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용 위한 간단 하 고 빠른 방법. 이 분석 결과에서 단백질 또는 단백질 B는 융합 luciferase의 아미노 맨끝 또는 carboxyl 터미널 반 각각. 단백질 단백질 B로 할 때, luciferase의 두 반쪽 기능과 활성 luciferase 효소를 형성 하는 재구성 된다 것입니다. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 기록할 수 있습니다. 다른 방식에 비해, 질적 및 양적 협회 분석 결과 단백질 단백질 상호 작용을 보여줍니다. Nicotiana benthamiana 잎에서 Agrobacterium 침투 과도 단백질 표정에 대 한 널리 사용된 시스템입니다. 협회 및 과도 식의 조합으로, 이러한 접근 COP1와 SPA1 간의 실제 상호 작용 jasmonate 치료 후 서서히 감소 되었다 보여줍니다.

서문

환경과 성장 조정 하려면 식물 감각, transduce, 신호 신호에 응답 하는 우아한 신호 경로 진화해왔다. 릴레이 경주에서 주자 처럼 단백질은 식물 신호 변환에 필요한 선수. 그것은 널리 인정 되었습니다 단백질 단백질 상호 작용 (PPI) 셀룰러 통신에 대 한 주요 역할을 한다. 단백질 인 산화, acetylation, 및 저하 모두 대상 단백질 및 그것의 수정 효소 간의 실제 상호 작용에 따라 달라 집니다. 예를 들어 Jasmonate ZIM 도메인 단백질 (JAZ) 가족 단백질 녹음 방송 요인 MYC2와 상호 작용 하 고는 transcriptional 활동^1,2를 억제. PPI의 중요성을 감안할 때 대규모 단백질 interactomes 식물에 되었습니다 탐험 최근^3,,45. 이러한 위하여 결과 더 다양 한 세포 기능을 조정 하는 복잡 한 규제 네트워크 공개.

PPI를 모니터링 하기 위한 몇 가지 설립된 접근이 있다. 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 PPI 탐지에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법입니다. Y2H를 수행 하기 쉽고 단백질 상호 작용을 검사 하는 빠른 테스트를 위해 적당 한 이다. Y2H는 관심의 특정 단백질에 대 한 알 수 없는 상호 파트너 심사 또한 널리 이용 된다. 그러나, Y2H은 효 모에 전적으로 실시 하기 때문에 그것은 수 없습니다 반영 공장에서 실제 시나리오 세포 높은 거짓 긍정적인 요금을 가져온다. 또 다른 유사한 전략은 풀 다운 분석 결과 이다. 일반적으로, 두 단백질은 표현 및 대장균 세포에서 정화와 혼합 그리고 단백질 상호 작용 검출을 위한 움직일 수 있습니다. 이 방법은 시간이 오래 걸릴 하지 않습니다, 비록 그것은 얻을 수 없습니다 vivo에서 상호 작용 결과 중 하나. 목적을 위해 비보에 상호 작용, 공동-immunoprecipitation (공동-IP) 고품질 immunoprecipitate 관심의 단백질에 항 체를 요구 하 고 간접 PPIs의 가능성을 제외 수는 가장 인기 있는 분석 결과 이다. 또한, 공동-IP에 복잡 한 실험 절차 때문 결과 일반적으로 개별 전문성을 갖춘 다.

기자 기반으로 재구성 분석 실험은 크게 vivo에서 PPI의 탐지 사전. 이러한 방법에는 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)⁶, 분자 형광 보완성 (BiFC)⁷및 이미징 (협회) 분석 결과⁸반딧불 luciferase 보완성 포함 됩니다. 있지만 이러한 세 가지 방법 공동 IP 보다는 직접 vivo에 맞게 PPI, 무서 워, BiFC 특정 현미경 형광 신호 필요와 쉽게 상호 작용 강도 정할 수 없습니다. 반면, 협회의 기판 소 반응 후 놀 것 이다 반딧불 luciferase의 활용. 더 중요 한 것은, PPI 강도 luciferase 활동의 값에서 확인할 수 있습니다. 따라서, 협회는 뿐만 아니라 두 단백질 상호 작용, 하지만 또한 치료 시 상호 작용 역동성에 정보를 제공 합니다 여부를 나타냅니다. 비록 몇 가지 설정된 방법이 상호 역학 (표면 플라스몬 공명 또는 온도 안정성 교대 기준)^9,10, 모니터링을 위한 섬세 한 악기 또는 특정 라벨이 방법 필요 합니다. 반면, 협회 수행 하 고 검색 하기가 쉽습니다.

국제 협회에 대 한 원리는 아미노 터미널과 carboxyl 터미널 반쪽 luciferase (라는 N-뤽 또는 C-뤽, 각각)의 A와 B, 단백질과 단백질 식물 세포에 동시에 표현 했다이 두 퓨전으로 융합 했다. 단백질 A, 단백질 B와 상호 작용 하는 경우 다음 luciferase의 두 반쪽 됩니다 수 재구성 된다 될 활성 luciferase 효소. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 감지할 수 있습니다. 그것은 협회;에 대 한 안정 된 transformants를 얻을 필요가 없습니다. 과도 식 고급 상호 작용 결과 얻기에 충분 하다.

링 타입 E3 유비퀴틴 리가 제정 photomorphogenic 1 (COP1) 녹음 방송 요인의 무수 한와 상호 작용 하 고 26S 프로테아좀¹¹그들의 저하를 촉진 합니다. 이러한 COP1 대상 녹음 방송 요인 중 일부는 photomorphogenesis에 대 한 긍정적인 레 귤 레이 터입니다. 어둠 속에서 COP1 phytochrome A-105 1 (SPA1), COP1 E3 활동⁸향상의 억압으로 작용 합니다. 빛의 지 각, 후 대뇌 COP1 활동을 억제 하 고 COP1 기판^12,,1314다음 안정화 COP1-SPA1 상호 작용을 파기 됩니다. 이 예제에서는 PPI를 공부 하 고 PPI 역학 생물 학적 의미를 보여 줍니다.

프로토콜

1. 식물 (8 주)의 준비

1. 5% NaClO 0.1% 트라이 톤 X-100 (V/V) 솔루션 및 두고 씨앗 소독을 5 분의 1 mL를 포함 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 50 Nicotiana benthamiana 씨앗을 넣어.
2. 5 번 살 균 물으로 종자를 헹 굴 하 고 살 균 물 200 µ L에서 씨앗을 일시 중단.
3. 신중 하 게 장소 개별 씨앗 MS-한 천 매체 (1 l: 重 & Skoog 소금 10 g 자당, pH 5.8 x 1 (코), 1 %agar) 좋은 팁 및 발 아 동기화를 3 일 동안 4 ° C에 게 중간 접시의 표면에.
   참고: 미생물 오염을 방지 하려면 클린 벤치에이 단계를 수행 합니다. 살 균 동안 튜브를 흔들 필요는 없습니다.
4. 10 일 동안, 정상적인 성장 조건 (22 ° C, 80-90 µmolm^-2의-1 흰 빛의 강도)에서 중간 접시 놓고 토양으로 세균된 묘를 전송 합니다.
   참고: 토양에 모 종 뿌리를 삽입 하 고 뿌리를 손상 하지 마십시오. 투명 한 플라스틱 커버와 하룻밤 습도 유지 하기 위해 트레이 커버.
5. 16 h/8 h 명암 주기 및 70% 습도에 제어 성장 방에 식물을 성장 한다. 7 주 된 명. benthamiana 식물 Agrobacteriumtumefaciens 침투 (그림 1A)에 대 한 준비가 되었습니다.
   참고: 식물을 급수 하 고 식물의 건강을 유지 하는 데 필요한 해충을 제어.

2. 과도 식 명 Benthamiana 잎 (7-10 일)

1. 플라스 미드의 배달 150 ng (pEGAD-하-뤽 제어 플라스 미드, 빈 벡터 및 국제 협회에 대 한 생성 된 플라스 미드 분석 결과,이 경우에 우리가 사용 pCAMBIA1300 Nluc 및 pCAMBIA1300 Cluc 플라스 미드 건설) A. tumefaciens 유능한 세포로 변형으로 GV3101는 표준 electroporation 방법입니다.
2. Luria Bertani (파운드) 한 천 매체 (1 l: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, 10 g tryptone 1.5 %agar) 포함 50 µ g/mL 대와 4 일 동안 28 ° C에서 리 팜 피신의 50 µ g/mL에 문화 A. tumefaciens
   참고: 벡터 및 사용 A. tumefaciens 변형에 따라 항생제의 선택 합니다.
3. 접종 한 파운드 50 µ g/mL 대과 리 팜 피신의 50 µ g/mL를 포함 하는 액체 매체의 3 mL에 각 접시에서 A. tumefaciens 식민지를 단일 및 24 h 셀 문화 전파를 위한 28 ° C에서 220 rpm에 흔들.
4. 15 mL 신선한 파운드 액체 매체 포함 된 50 µ g/mL 대과 리 팜 피신, 200 배 희석의 50 µ g/mL로 75 µ L 세균성 문화를 전송 합니다. OD₆₀₀ 0.5에서 1.0 사이 때까지 약 8 시간, 30 ° C에서 220 rpm에서 박테리아를 문화.
5. A. tumefaciens 액체 문화 15 mL 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 4000 x g와 15 분 삭제는 상쾌한 4 ° C 원심 펠 릿을 세척 하 변환 솔루션의 15 mL에 펠 릿을 중단.
6. 4000 x g와 15 분 동안 4 ° C 튜브를 회전 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 한 번 세척 단계를 반복 합니다.
7. 변환 솔루션의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 실 온에서 2 h 동안 유지. OD₆₀₀ 의 최종 농도 0.5, 또는 테스트 쌍을 이루는 단백질 상호 작용에 대 한 동등한 양으로 혼합 두 샘플까지 변환 솔루션 A. tumefaciens 펠 릿 셀의 밀도 조정 합니다.
8. 7 4^번째 에 침투 중단 셀^일 단풍 1 mL needleless 주사 통 (그림 1B-C). 침투 후 검은색 플라스틱 커버와 함께 즉시 식물을 커버 하 고 12 h에 대 한 어둠 속에서 트레이 놓습니다. 그 후, 평소 뤽 활동을 검출 하기 전에 2 ~ 4 일에 대 한 식물을 성장.
   참고: 비슷한 크기의 건강 한 잎을 선택 합니다. 한 잎에 4 개의 다른 영역의 침투는 괜 찮 아 요.

3. 감지 Luciferase 활동 (1 일)

참고: luciferase 활동을 모니터링 하는 두 가지 방법이 있다. 하나는 이미징, 기반 그리고 다른 양적 luciferase 활동을 측정 하는 것입니다.

1. 이미징 방법
   1. 침투 잎을 분리 하 고 MS-한 천 매체에 전체 전단지를 넣어.
   2. 스프레이 50 mL 스프레이 용기와 표면에 잎 adaxial 소 작업 버퍼입니다. 엽록소 자동 형광 담금질 하기 위해 5 분 동안 어둠 속에서 자료를 유지.
   3. 이미지 (그림 2)를 (-30 ° C에 냉각) 장치 이미징 낮은 조명 냉각된 CCD를 사용 합니다. 빛에 신청 노출 시간이 50 밀리초 이며 발광 검출 시간은 1 분입니다.
      참고: 컴퓨터 매뉴얼에 따라 매개 변수를 조정 합니다. 낮은 온도 이미지 품질을 향상 시키기 위해 신호-잡음 비율을 강화할 것 이다.
2. 또는, 상업적인 루미 노와 직접 발광을 측정 합니다.
   1. 조심 스럽게 명. benthamiana 잎의 침투 지역에서 (약 0.25 cm²) 잎 조각을 잘라 고 잎 디스크 100 µ L 96 잘 흰 접시 (그림 3)에서 이온 물에 담가.
   2. 소 작업 버퍼의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 둡니다. 그런 다음 특정 치료 단백질 상호 작용 역학 연구를 수행 합니다.
      참고: 특정 치료에서 단백질 단백질 상호 작용의 활동을 나타내는 luciferase 활동 역학을 얻을 다른 시간 지점에서 루미 노와 발광을 감지 합니다. 이 메서드는 동시에 많은 수의 단백질 쌍을 테스트에 대 한 이점이 있다. 서쪽 오 점 여 luciferase 단백질 나타났는데 검사 그 상업 루미 노 하지 않고, 따라서 뤽 활동 quantitively를 참조 하십시오. 빛이 반드시 필요한 경우 단지는 루미 노에 접시를 유지 하 고 다른 시간 지점에서 발광을 측정. 그렇지 않으면 검출 간격 동안 성장 챔버에 접시를 이동 합니다. 적어도 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 통계적으로 유의 한 결과 얻을. 루크 활동 다른 침투 영역에서 달라 지기는 하지만 그들의 변화 패턴 일치 하는 정규화 후입니다.

결과

세 가지 주요 단계 단백질 단백질 상호 작용에서 vivo에서, 식물 성장, luciferase 분석 결과, 담배 침투 등 공부에 대 한이 luciferase 보완성 프로토콜에 점찍어 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 액체 A. tumefaciens 명. benthamiana 잎 (그림 1)에 침투 하는 것은.

여기에 jasmonate CO...

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 간단 하 고 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용, 공부에 대 한 재현 고 외 인 치료에서 단백질 상호 작용 역동성을 감지 하는 데 특히 적합. 이 분석 결과 주요 단계 명. benthamiana 침투입니다. 성공을 보장 하기 위해 침투, 식물 매우 건강 해야 합니다. 또 다른 중요 한 요인은 침투 후 luciferase 활동을 확인 하는 시기입니다. 이 질문에 대 한 정확한 대답이 있다. ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transformation solution
10 mM Morpholineethanesulfonic acid	VETEC	V900336
27.8 mM Glucose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5.7
Luciferin working buffer
5 mM Luciferin potassium salt	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml