Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

요약

이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

초록

Candida albicans 인간의 병원 획득 패 혈 증 경우의 약 15%를 일으키는 가장 일반적인 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans 의 주요 독성 특성은 그것의 양식 biofilms 능력, biotic 및 abiotic 표면에 연결 된 세포의 구조적된 커뮤니티. C. albicans biofilms 호스트 조직, 점 막 층, 같은 카 테 터, 심장, 의치, 공동 prostheses 등 의료 기기에 형성할 수 있다. 그들은 물리적, 화학적 물결에 높게 저항 하기 때문에 씨앗에 저수지 전파 감염으로 작동할 수 있다 Biofilms 중요 한 임상 도전 포즈. 분석 실험 체 외에 다양 한 C. albicans biofilm 형성, 결정 플레이트 분석 실험, 건조 중량 측정, 세포 생존 능력 분석 실험, confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 등 공부를 이용 되어 있다. 이 분석 실험의 모두 단일 끝점 분석 실험, biofilm 형성 특정 시간에 평가 됩니다. 여기, 우리 층 흐름 조건 하에서 자동된 미세 장치를 사용 하 여 실시간에 biofilm 형성 연구 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 biofilm 혈관 카 테 터에서 발생 하는 등 호스트의 모방 하는 사용자 지정 조건을 사용 하 여 시간이 지남에 개발로 biofilm 형성의 관찰에 대 한 수 있습니다. 유전 돌연변이의 biofilm 결함 뿐만 아니라 실시간으로 biofilm 개발에 항균 성 대리인의 억제 효과 평가 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

서문

그러나 그것은 또한는 기회 주의 병원 체, 표면 하 고 심한 곰 팡이 감염^1,2를 일으키는 능력이 candida albicans 인간의 microbiota의 공생 회원입니다. C. albicans 의 주요 독성 특성 양식 복구 하는 기능 이며, 약물 내성 biofilms, 세포의 표면에 준수 고 기질 소재^1,3에. C. albicans biofilms는 고도로 구조화, 포함 하는 여러 종류의 세포 여러 레이어 (신진 효 모-양식 라운드 셀, 타원형 pseudohyphal 셀 및 관 hyphal 셀)⁴. C. albicans biofilm 개발 표면에,이 세포의 확산에 의해 따라 (에서 biofilm 시드), 표면에 둥근 효 모 형태의 세포의 부착으로 시작 하 고 다음 미 숙 biofilm의 성숙으로 구조를 완벽 하 게 형성 된 biofilm 기질 소재⁴에 의해 둘러싸여. 성숙한 biofilm biofilm⁴건축 안정성을 제공 밀도 연결 네트워크를 형성 하는 길쭉한 hyphal 세포 주로 구성 됩니다. Biofilm 라이프 사이클에 걸쳐 신진 효 모 라운드 세포 성숙 biofilm에서 분산 하 고 전파 감염 시키거나 다른 사이트^4,5에서 새로운 biofilms 씨앗 몸의 다른 지역에 여행 수 있습니다. C. albicans 는 biotic 표면, 점 막 표면에와 같은 및 호스트 조직, 전체에 카 테 터, 심장, 틀니, 인공 관절 등의 비 생물 적인 표면에 biofilms를 형성할 수 있다. Biofilms의 고집 불통 속성으로 인해 그들은 매우 어려운 근절, 그리고 많은 경우에서 유일 하 게 효과적인 치료 전략은 감염 된 장치⁴의 제거. 따라서 조사 임상 설정에서 관찰 된 것과 유사한 조건 하에서 biofilm 형성에 결정적 이다.

몇 가지 중요 한 vivo에서 동물 모델이 C. albicans biofilm 형성^6,,78; 공부 하는 데 사용 그러나, 이러한 연구 비용, 시간이 소요 될 수 있으며 긴장 및 한 번에 테스트할 수 있는 항균 성 대리인의 수에 의해 제한 됩니다. 생체 외에서 biofilm 분석 실험, 다른 한편으로, 항진균 성 화합물 및 돌연변이 체 긴장의 급속 한, 높은 처리량 평가 대 한 허용 하 고 훨씬 더 비용 효율적이 고 윤리적인 biofilm 분석 실시 보다는 동물에서 모델^{9, 10,,1112,,1314}. 여기는 생체 외에서 분석 결과 우리가 개발 하 고 사용자 지정 가능한 미세 장치^14,15를 사용 하 여 층 류에서 일시적으로 biofilm 형성을 관찰 하도록 최적화에 대해 설명 합니다. 분석 결과 시각화 biofilm 형성, 초기 부착 단계, 세포 증식, biofilm 성숙, 세포 분산 등의 각 단계에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 시각화는 biofilm의 개발을 통해 세포 형태학 변화에도 유용 합니다.

일반적으로 체 외에서 biofilm 분석 실험, 높은 처리량을 동안에 대 한 활용 결정 접시 제어 흐름 조건에 대 한 허용 하지 않습니다. 전통적인 층 흐름 전지 시스템 제어 흐름 조건에서 biofilm 형성의 지속적인 평가 대 한 허용 하지만 이러한 시간이 소요를 설정 하 고 동적 범위 컨트롤 및 처리량 제한 하는 경향이 많습니다. 여기 활용 미세 장치 내장 층 류 챔버와 높은 처리량 판 (48 웰 스 포함)를 결합 하 여 이러한 한계를 극복 하 고 매우 재현 하 고 다재 다능 한, 사용자 정의.

우리가 야생-타입 C. albicans 의 biofilm 형성 평가를 상업적으로 사용할 수 있는 자동화 미세 장치 사용에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기, 스트레인, biofilm, biofilm의 개발에 알려진 항진균 제의 효과 두 돌연변이 체 긴장 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ) 이전 biofilm를 보고 된에서 대형 생체 외에서 그리고 vivo에서^16,,1718결함. Biofilm의 개발을 통해 biofilm 형성 억제에 항균 성 대리인의 효능을 테스트 하 고 돌연변이 라이브러리를 검사 하 여 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하는 설명된 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 곰 팡이 세포 문화 준비

참고: 행위 세포 배양 작업 (즉, 극저온 주식, 셀 문화 관, 관과 플라스 크 여) biosafety 내각 내에서. 캐비닛의 자외선 (UV) 살 균 램프 적어도 1 h 작업, 캐비닛에 적극적으로 노력 하는 동안 UV 램프 해제 이전 설정. 장갑, 안전 안경, 그리고 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 벤치와 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 펫의 표면 오염을 제거 하 다하고. 살 균 필터 팁과 기본 무 균 미생물 기술 가진 친밀의 사용이 권장 됩니다.

1. 효 모에 연속 C. albicans 긴장 (야생-타입, bcr1 Δ/Δ, 및 efg1 Δ/Δ) 추출 펩 포도 당 (YPD) 매체 (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, pH 6.8) 한 천 배지. 48 h 30 ° C에서 품 어, 표준 미생물 사례¹⁹.
2. 하나의 고립 된 식민지 YPD 액체 매체 (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, pH 6.8)의 4 mL에 접종 하 고 12-15 h, 다음 표준 미생물 윤리적 인큐베이터 떨고 표준에 225 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 품 어 접시에서 선택 tices¹⁹.
3. 문화의 셀 밀도 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 결정 한 베트 (1 mL, 1 cm 경로 길이), 표준 미생물에 nm 사례¹⁹.
4. 0.5, 2 x 10⁷ 셀/mL, 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI)-1640 매체에 동일의 최종 세₆₀₀ 세포 배양 희석 (165 m m 3-morpholinopropane-1-sulfonic 산 (MOPS), L-글루타민를 포함 하 고 나트륨 없이 중 탄산염, pH 7.0) 또는 거미 매체 (1% 영양 국물, 마 니 톨 1%, 0.4% K₂HPO₄, pH 7.2).
   참고: 대체 미디어 관심의 긴장의 특정 성장을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다.
   참고: 사전에 너무 멀리 셀 희석을 하지 않습니다. 희석 단계 3.3 (아래 설명 참조) 셀 보기 채널에 시드 되 고 이전 균 형성의 개시를 방지 하기 위해 후 시작 하는 것이 좋습니다.

2. 미세 판의 미세 채널의 준비

참고: 미세 시스템의 사용자 설명서를 참조 하십시오 (재료의 표 참조) 접시 및 장비 설정에 대 한 정보.

1. 37 ° c.에 인큐베이터에 미세 실험, 따뜻한 RPMI 1640 미디어 나 거미 미디어 20 mL를 실행 하기 전에 추가 미디어 볼륨 단계 2.8에서에서 계산에 따라 필요할 수 있습니다. 전 지구 온난화 미디어 실험 기간 동안 기포의 형성을 방지합니다.
2. 컨트롤러, 2 개의 전원 공급 장치, 현미경, 카메라, 그리고 컴퓨터 시스템에 연결을 포함 하는 마이크로 시스템을 켭니다. 오픈 시스템을 제어 하는 소프트웨어 (재료의 표 참조) 컴퓨터에서 프로그램 메뉴에서. 프로그램이 열리면 두 개의 창이 표시 됩니다.
3. 사용에서 접시의 바코드 번호를 찾아서는 소프트웨어에 의해 메시지가 표시 되 면 번호를 입력 합니다. 두 개의 창에 소프트웨어를 두 개의 별도 컴퓨터 화면을 사용 합니다. 한 창 (제어 모듈) 접시에 대 한 컨트롤을 포함 하 고 두 번째 창 (몽타주, 이미징 모듈) 현미경과 카메라에 대 한 컨트롤이 포함 되어 있습니다.
4. 컨트롤러에서 히터 전원 버튼에 전환 하 고는 마이크로 시스템 온도 37 ° C 온도 컨트롤러에서 화살표 단추를 사용 하 여를 설정 합니다.
5. 청소 살 균 수를 사용 하 여 다음과 같이 인터페이스 플레이트 (그림 1). 살 균 물으로 접시의 바닥을 살포 하 고 흙/먼지 제거 렌즈 종이 사용 합니다. 건조 한 공기를 깨끗 한 렌즈 종이에 인터페이스 플레이트 뒤집어를 놓습니다. 70% 소 프로 파 놀과 렌즈 종이 사용 하 여 인터페이스 플레이트의 상단을 청소 하십시오.
   참고: 인터페이스 플레이트 셀 및 미디어를 포함 하는 접시를 미세 시스템을 연결 합니다. 아무 액체 유지 모든 섬유 및 먼지 제거 됩니다 확인 하십시오. 낮은 품질의 이미지 및 비디오에 발생할 수 있습니다 부적 절 한 청소.
6. 인터페이스에 튜브에서 응축을 제거 합니다.
   1. 렌즈 종이 뒤집어 접시를 남겨 주세요. 컨트롤에서 모듈 창 접시 수동 모드에서 클릭 합니다. 기울이기 컨트롤 메뉴 섹션에서 1-4 및 5-8, 열 유체 선택을 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 37 ° C를 선택 합니다. 기울이기 컨트롤 섹션에서 상수를 흐름 모드를 설정 하 고 최대 전단 2 다 인/c m² 로 설정 (0.2 Pa) (그림 2A).
   2. 입구 우물 인터페이스 플레이트 튜브 응축 제거를 통해 살 균 공기의 흐름을 시작을 클릭 합니다. 5 분 후 잘 플레이트 제어 섹션 (그림 2A)에서 정지 버튼을 클릭 합니다. 모든 응축 제거 되었습니다 확인 하려면 인터페이스 플레이트에서 튜브를 관찰 합니다. 방울 여전히 표시 되는 경우 위에서 언급 한, 또 다른 5 분에 대 한 살 균 공기의 흐름을 반복.
      참고: 유입 튜브만 살 균 공기 마이크로 시스템에 도입 되도록 0.22 미크론 필터에 연결 됩니다. 흐름 제어 모듈 창에서 화면에 이벤트 로그에서 모니터링할 수 있습니다.
7. 현미경 단계에 48-잘 0-20 다 인 미세 접시를 놓습니다.

3. 미세 시스템에서 candida albicans Biofilm 형성

1. Biofilm 형성을 기록, 입구 웰 스 (플레이트 레이아웃 그림 1 참조)를 미리 데워 RPMI 1640 매체 또는 거미 매체의 600 µ L를 추가 합니다. 각 실험 조건에 대 한 두 개의 복제 있다.
   1. C. albicans 의 biofilm 형성 테스트용 야생 형 및 돌연변이 체 긴장 실험 접시의 웰 스 입구에 600 µ L 거미 매체를 추가 합니다.
   2. Biofilm 형성 항진균 약물 (또는 관심의 다른 화합물)의 테스트를 위해 추가 RPMI 1640 매체 2 개의 우물 (부정적인 제어)의 600 µ L와 RPMI 1640 매체 암포 B (16 µ g/mL)와 보완의 600 µ L (또는 약물의 선택에서 원하는 농도) 두 개의 다른 입구 우물을.
      참고: 12 h biofilm 형성 실험에 대 한 입구 우물을 미리 데워 진된 미디어의 600 µ L를 추가 합니다. 더 이상 실험에 대 한 입구 우물을 추가 미디어 (50 µ L/h)를 추가 합니다. 잘 (1, 500 µ L)의 최대 볼륨을 초과 하지 마십시오.
2. 천천히 낮은 48 잘 미세 접시 위에 청소 인터페이스 플레이트. 인터페이스 판 약간 왼쪽 때까지 밀어 interphase 접시에 튜브 입구 및 출구 우물 위에 배치 됩니다.

레버를 잠금 위치에 인터페이스 플레이트 오른쪽 왼쪽에서 인터페이스 플레이트 설정, 실험 보장 밀폐.
참고: 인터페이스 플레이트에 튜브에서 살 균 공기의 흐름 (방향에 따라 컴퓨터에서 소프트웨어를 사용 하 여 선택), 입구 또는 출구 우물에 액체를 밀어 것입니다 입구와 출구 사이 보기 채널을 통해 흐르는 액체를 사용자 지정된 방향 및 속도 사용자에 의해 규정의 우물

기울이기 컨트롤 섹션에서 상수를 흐름 모드를 설정 하 고 최대 전단 1 다 인/c m² 로 설정 (0.1 Pa). 입구 웰 스 콘센트 웰 스 (그림 2A) 채널을 입구에서 미디어의 흐름을 시작 하는 미디어를 클릭 하십시오. 5 분 잘 플레이트 컨트롤 섹션에서 중지 버튼을 클릭 후. 인터페이스 플레이트를 제거 하 고 미세 판 우물을 관찰. 채널을 못쓰게 후만 미디어의 작은 방울은 콘센트 우물에 표시 되어야 합니다. 미디어 콘센트 우물에서의 작은 방울 표시 될 때까지 드롭 다운 표시 되지 않는 경우에, 2 분 단위로 채널 프라임.
참고: 못쓰게는 보기 채널에서 공기를 제거 하 고 채널 원하는 미디어와 함께 가득 차 있습니다 확인 합니다.

미세 접시에서 인터페이스 플레이트를 제거 하 고 살 균 표면에 옆으로 설정. 각 콘센트에 잘 (1.5 단계에서 설명) 세포 배양의 50 µ L를 추가 합니다.

1. C. albicans 테스트용 야생 형 및 돌연변이 체 긴장, 두 개의 콘센트 우물, bcr1 Δ/Δ 2 개의 콘센트 우물, 거미 미디어에서 및 efg1 Δ/Δ 2 개의 콘센트 우물 거미 미디어에서 거미 미디어에서 야생-타입 (SC5314) 세포 배양의 50 µ L을 추가 합니다. 미세 접시에 다시 인터페이스 접시를 놓고 뚜껑을 고정 (플레이트 레이아웃 그림 1 참조).
   참고: 단계 3.1.1에서에서 설명한 대로 모든 해당 입력된 우물 거미 미디어를 포함.
2. C. albicans biofilm 형성 암포 B 또는 관심의 다른 화합물의 존재를 테스트 하기 위해 4 개의 콘센트 우물을 사용 RPMI 1640 매체에 야생-타입 (SC5314) 세포 배양의 50 µ L을 추가 합니다. 미세 접시에 다시 인터페이스 접시를 놓고 뚜껑을 고정 (플레이트 레이아웃 그림 1 참조).
   참고: 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로 모든 해당 입력된 우물 RPMI 1640 미디어와 암포 B 또는 관심의 다른 화합물 없이 포함.

기울이기 컨트롤 섹션에서 상수를 흐름 모드를 설정 하 고 최대 전단 2 다 인/c m² 로 설정 (0.2 Pa). 콘센트 웰 스 콘센트 웰 스 (그림 2A) C. albicans의 뿌리기 시작에 입구에서 미디어의 흐름을 시작 하려면 셀을 클릭 하십시오. 셀 입력된 우물을 입력 하지 못하도록 잘 판 컨트롤에서 중지 단추 섹션 3 s 클릭 후.
참고: 셀 입구 우물;으로 콘센트 우물에서 이동 흐름 세포 입구 우물을 도달 하기 전에 중지 됩니다 필수적 이다. 이렇게 하면 입구 우물 세포 배양으로 오염 얻이 되지 않습니다 입구 우물에서 미디어 실험의 기간에 대 한 살 균 남아 있습니다. 필요한 시간과 전단 힘 사용 된 미디어의 점도 및 셀의 크기에 근거한 다.

초기 셀 준수에 대 한 보기 채널에 10-20 분 동안 아무 흐름 (0 다 인/cm²) 고정 남아 셀 수 있습니다. 이 10-20 분 준수 단계 카메라 무대 위치를 캡처하고 사전 플러시 이미지 (자세히 섹션 4-6에서 설명)을 취득 하는 시작 하도록 컴퓨터를 설정 합니다.

4. 미세 실험 단계 위치 설정

참고: 단계 위치와 플레이트 보정 그냥 실험을 시작 하기 전에 설정 되어야 합니다. 이 설치는 실험 기간 동안 이미지를 캡처에 대 한 각 보기 채널의 위치를 저장 하는 컴퓨터를 허용 한다. 미세 판 무대 위치를 설정한 후 방해 안 한다. 접시 이동 무대 위치 실험의 시작 하기 전에 다시 설정 해야 합니다.

1. 시각화 분석 소프트웨어를 사용 하 여 (재료의 표 참조) 무대를 설정 하려면 위치; 각 보기 채널 단계 (1-24) (그림 1D) 이며, 각 단계는 이미지 캡처 보기 채널 (그림 1C)에 따라 다른 위치에 대 한 3 개의 하위 단계 (1-3). 이미징 모듈 창에서 MDA 탭 (그림 2B)를 클릭 하 여 ' 다차원 수집 ' (MDA) 모듈을 엽니다.
2. MDA에서 모듈 (그림 2B) 왼쪽에 있는 메뉴에서 '무대' 탭을 클릭 하십시오. 무대 섹션에서 48 잘 0-20 다 인 미세 판에 대 한 마스터 단계 목록을 로드 합니다. 각 보기 채널 3 단계 이미지 수집에 대 한 있어야 합니다.
3. ' 샘플 로드 조정 ' (SRA)를 열고 ' 절대 위치로 이동 무대 ' (지도) 모듈 SRA 탭과 지도 탭 (그림 2B)를 클릭 하 여. SRA 모듈에서 십자선으로 이미지 미리 보기 '라이브' 단추를 누릅니다.
4. 잘 플레이트 위치는 조이스틱을 사용 하 여 같은 (접시에 있는) 화살표의 팁 보기 채널 4에 인접 한 소프트웨어에 십자선 정렬. 지도 메뉴에서 (그림 2B) ' 원점 설정 ' 버튼을 누릅니다. 현재 위치 0 X, Y, 및 Z 이제 읽어야 합니다.
5. SRA 모듈에서 왼쪽 메뉴 (그림 2B)에 ' 초기 참조 점을 ' 섹션을 클릭 합니다. ' 로드 설정 ' 클릭 하 고 48 잘 0-20 다 인 미세 판에 대 한 파일을 로드 합니다.
6. MDA 모듈의 무대 섹션, 두 번 클릭에 ' 무대 위치 22,2'. 이 위치는 볼의 중간 (하위 단계 2) 나타냅니다 채널 번호 22. 이 무대를 보는 현미경 고 카메라 초점에 가까운 화살표 표식 채널 22 보고 있습니다. 잘 플레이트 위치는 조이스틱을 사용 하 여 그런 (접시에 있는) 화살표의 팁 보기 채널 22에 인접 한 십자선에 맞춥니다.
7. SRA 모듈 (그림 2B)의 ' 업데이트 참조 포인트 ' 탭에 지점 2의 Y 위치에 MDA 모듈에서 Y 좌표를 복사 합니다.
8. SRA의 ' 업데이트 단계 위치 ' 탭에서 'MDA 단계 목록에 적용'을 클릭 합니다 (그림 2B).
   참고:이 업데이 트 됩니다 모든 현미경 스테이지의 특정 미세 플레이트 위치 보정을 판 (1-24)에 단계 위치 보기.

접시는 이제 이미지 수집에 대 한 준비 그리고 모든 24 채널 보기에 3 개의 위치에서 이미지를 캡처하는 동안 이동 보정된 단계 위치를 사용 합니다.

5. 이미지에 대 한 인수를 설정 캡처 미세 실험 중

1. 이미징 모듈 창에서 MDA 모듈을 사용 하 고 왼쪽 메뉴 (그림 2B)에 '저장' 탭을 클릭 합니다. 실험 및 컴퓨터에서 수집 된 이미지를 저장 하는 폴더에 대 한 파일 이름을 선택 합니다.
2. MDA 모듈에서 왼쪽 메뉴에 'Timelapse' 탭을 클릭 하 고 설정 145 총 이미지; 이미지-5 분 사이 timelapse를 설정 합니다. 이 1 개의 심상 12 h biofilm 개발 실험에 대 일 분 마다 발생 합니다.
   참고: 이미지와 이미지의 총 수 사이 시간 간격 조정할 수 있습니다 실험 요구 사항에 따라. 12 h 이상 이미징 하는 경우 추가할 추가 미디어 단계 3.1에서 입구 우물 우물 건조 실행 할 수 있도록. 더 이상 실험에 대 한 추가 추가 미디어 (50 µ L/h)을 필요에 따라 입구 우물에.
3. MDA 모듈 왼쪽 메뉴 (그림 2B)에 '파장' 탭을 클릭 하 고 1로 실험에 대 한 파장의 수를 설정 합니다. 50%와 50% 명시 잡으려고 파장 설정 카메라 12 20 ms, 0.6 이득 및 20 MHz 디지타이저의 노출 시간.
   참고: 추가 파장 사용할 수 있습니다, 형광 이미징에 대 한 파장을 포함 하 여 (예를 들어 우리는 성공적으로 시각 mCherry 및이 미세 소자를 사용 하 여 태그 GFP C. albicans 긴장). 인수의 매개 변수 또한 변경할 수 있습니다 실험 요구 사항에 따라. 예를 들어, 두 번째 파장을 설정 하 고 '각 Timepoint에 자동'을 선택 하 고 제 3 파장 '각 Timepoint에 Autoexposure' 선택 하면 것이 좋습니다 초점에 있는 이미지 획득 기회를 극대화 하기 위해 초보자를 위한.
4. MDA 모듈에서 왼쪽 메뉴의 단계 목록 탭을 선택 합니다. 단계 1, 1-24,3 표시 됩니다. 한 명씩, 각 단계에서 클릭 하 고 정밀한 초점 설정을 사용 하 여 수동으로 초점을 보기 채널의 셀에 각 단계에 대 한. 보기의 필드에 초점입니다, 일단 업데이트 하 고 각 단계에 대 한 설정을 저장 단계 목록 옆에 있는 검은색 화살표를 클릭 합니다. 컴퓨터는 모든 시간 지점에서 이미지를 이러한 수동으로 정의 위치 설정 및 초점 설정을 사용 합니다. '제거' 화살표를 사용 하 여 목록에서 모든 사용 하지 않는 단계를 제거 합니다.
   참고: MDA 모듈과 프로그램 단계 교환, 채널 보기를 참조 하 고 동일한 용어는 소프트웨어에 의해 사용 됩니다.

6. 미세 실험 실행

1. 이미징 모듈 창에서 MDA 모듈을 사용 하 여 모든 하위 단계 (그림 2B)에 대 한 준수 셀의 사전 플러시 이미지 캡처를 시작 하려면 ' 취득을'을 선택 합니다.
   참고: 이미징 모듈 창과 카메라 컨트롤 표시 됩니다 이미지 표현 되는 고 지도, SRA, 및 MDA 모듈을 더 이상 표시 됩니다. 촬영 된 이미지도 표시 됩니다 타이머 측면에서, 체포 되 고 이미지 수를 나타내는 및 시간 경과에 다음 이미지 캡처 주기 시작 하기 전에. 다음 단계로 진행 하기 전에 캡처 이미지의 한 라운드를 기다립니다.
   참고: 이미징 모듈 창 화면에 '일시 중지' 또는 ' 마크 이벤트 ' 버튼을 사용 하지 마십시오. 실험 기간 동안에이 시점에서 두 번째 컴퓨터 화면 (그림 2A)에서 제어 모듈 창 에서만 마우스를 유지. 이 이미징 모듈 창을 방해 하지 않도록 해야 합니다.
2. 에 제어 모듈 창 체재 접시 수동 모드에. 기울이기 컨트롤 섹션에서 상수를 흐름 모드를 설정 하 고 최대 전단 1 다 인/c m² 로 설정 (0.1 Pa). 콘센트 웰 스 o 1 O7, O13, O19 콘센트 웰 스 (그림 2A)에 입구에서 미디어의 흐름을 시작 비 준수 셀을 제거 하려면 클릭 합니다. 5 분 잘 플레이트 컨트롤 섹션에서 중지 버튼을 클릭 후. 수 이미지의 두 번째 라운드에 대 한 허용. 이미지를 구상 될 수 있다 고 이미징 모듈 창에서 두 번째 화면에서 시간 경과 모니터링할 수 있습니다.
3. 기울이기 컨트롤 섹션에서 조정 0.5 다 인/cm² 최대 전단 흐름 (0.5 Pa) 최대에 있는 번호를 클릭 하 여 전단 열 하 고 0.5를 입력 하는 키보드를 사용 하 여. 키보드에서 enter 키를 눌러 고 유량 제어 모듈 창 (그림 2A)에서 이벤트 로그에 있는 변화를 확인 합니다. 실험 12 h에 대 한 어둠 속에 그대로 둡니다.
   참고: 빛에 노출 및 운동/진동 심각 하 게 실험을 통해 획득 하는 이미지의 품질을 줄일 수 있습니다. 미세 실험의 끝에, 이미징 모듈 창이 어떤 이미지를 표시 되지 않습니다 하 고 SRA, 지도, 및 MDA 모듈을 보여주는 다시 되돌아갑니다. 이미지 보기, 동영상, 모이고는 biofilms 계량을 이미징 모듈 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 (아래 설명) 형성.

7. 분석 결과

1. 이미징 모듈 창에서 ' 분석 도구 ' 탭을 선택 하 고 ' 검토 다차원 데이터 클릭 ' (RMD)에서 드롭 다운 메뉴. RMD 모듈에서 ' 기본 파일 선택 '를 클릭 합니다. 이 ' 다차원 데이터 집합 유틸리티 ' 창이 열립니다.
2. ' 디렉터리 선택 ' 버튼 클릭 하 고 단계 5.1에서에서 실험을 저장 하는 데 사용 된 폴더를 선택 합니다. ' 데이터 집합 ' 목록에서 실험 파일 로그 (.nd 확장)을 선택 합니다. 로그 로드 되 면 '보기' 버튼을 클릭 합니다.
3. 왼쪽 '파장' 메뉴에서 옵션을 클릭 하 여 파장을 선택 하 고 무대 위치 드롭 다운 메뉴에서 보기를 선택 합니다. 이미지 번호를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 모듈 상단 숫자에서 로드할 이미지를 선택 합니다. 일단 선택, 이미지 로드 '이미지 로드' 버튼을 클릭 합니다. 하나의 이미지 또는 모든 이미지를 한 번에 볼 수 있습니다.
4. 시간 경과 비디오 있도록 모든 이미지를 선택 합니다. 선택 된 이미지는 새 창에서 비디오로 열 것 이다. 이미징 모듈 창에서 '파일' 탭을 클릭 하 고 선택 '다른 이름으로 저장' 드롭 다운 메뉴에서. 기본 파일 (TIFF/MetaSeries)로 동영상 결과 저장 합니다.
5. 열고 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 저장 된 비디오 파일을 로드 합니다. ImageJ, '파일' 탭을 클릭 하 고 '다른 이름으로 저장'을 클릭 합니다. 드롭 다운 메뉴에서 '.avi'를 선택 하 고 10 프레임/s로 설정 하는 JPEG 변환을 사용 하 여.avi 파일을 파일을 변환.
   참고: 비디오의 속도 초당 프레임을 변경 하 여 조정할 수 있다.
6. Biofilms 계량, 7.2, 7.3 및 7.4 단계를 반복 합니다.

마지막 이미지 (번호 144)을 선택 하 고 이미지를 로드 '이미지 로드' 버튼을 클릭 합니다. 이미지 새 창에서 열립니다. '임계값 이미지' 버튼 클릭 하 고 '포함' 임계값을 선택 합니다. Biofilm 세포는 빨간색, 표시 될 때까지 커서를 이동 하 고 셀 영역 색 하지.

측정 로그 로그 ' 열기 ' 버튼을 클릭 (버튼 ' 오픈 로그 '를 처음에 표시 됩니다; 단추를 이름을 바꿀 수 것입니다 로그 활성화 되 면 ' F9: 로그 데이터 '). ' 오픈 데이터 로그 ' 창에 ' 동적 데이터 교환 '을 선택 하 고 '좋아.' 클릭

이미징 모듈 창에서 ' 분석 도구 ' 탭을 선택 하 고 ' 지역 통계 표시 '를 클릭 합니다. 이 이미지에서 측정을 표시 하는 새로운 창이 열립니다. 사용할 수 있는 '측정' 옵션에서 ' 전체 이미지 '를 선택 하 고 클릭 ' F9: 로그 데이터.' 모든 측정 excel 파일로 표시 됩니다. '지역'과 ' Thresholded 지역 '에 대 한 값을 찾아서는 biofilm에 의해 점령 지역에 대 한 숫자 값을 가져오는 전 후자 나눕니다.
참고: 실험 기간 동안 얻은 각 이미지에 대 한 '지역'은 동일 하 고 따라서 ' Thresholded 지역 ' 측정 야생-타입 긴장과 돌연변이 체 긴장 biofilm 형성에 차이 평가 또는 평가의 효과를 사용할 수는 biofilm 형성에 마약 테스트입니다.

결과

우리 수행 미세 biofilm 분석 결과 설명 여기 야생-타입을 사용 하 여 두 미디어 조건 (RPMI 1640 그리고 거미 미디어) C. albicans 스트레인, 알려진된 항진균 약물 RPMI, 암포 B (16 µ g/mL)의 야생-타입 스트레인 그리고 2 개의 돌연변이 체 긴장 이전 거미 미디어에 biofilm 형성 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ)에서 결함을 보고.

비디?...

토론

여기에 설명 된 사용자 지정 가능한 미세 biofilm 분석 결과 수에 biofilm 형성의 시각화에 대 한 고정된 속도 층 흐름과 일정 한 온도에 노출 되 면 단일 셀 수준에 실시간으로. 그것은 야생 형 및 돌연변이 체 긴장에 biofilms의 개발 연구에 강력한 수단을 제공 하 고 생리 조건 모방 조건 하에서 biofilms에 항균 성 에이전트 처리의 효과 임상 설정에서 관찰. 대부분 체 외에서 biofilm 분석 실험와 달?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioFlux 1000z	Fluxion		Automated microfluidic device for live cell analysis
48-well plate 0-20 dyne	Fluxion	910-0047	Microfluidic plate
Montage Software	Fluxion	Version 7.8.4.0	Visualization analysis software
ImageJ Software	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Yeast Extract	Criterion	C7341
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific	D163
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P285-500
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Nutrient Broth	Criterion	C6471
Difco D-Mannitol	BD Biosciences	217020
Agar	Criterion	C5001
Amphotericin B	Corning	30-003-CF
Sterile Inoculating Loops	VWR	30002-094
Petri Dishes with Clear Lid	Fisher Scientific	FB0875712
Disposable Cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Lens Paper	VWR	52846-001
Microplate and Cuvette Spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC
Shaking Incubator	Eppendorf	M12820004