유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜

요약

간세포에서 미토콘드리아 기능에 대한 환경 유기염소농약(OCP)의 영향을 이해하는 것은 대사 장애를 일으키는 OCP의 메커니즘을 탐구하는 데 중요합니다. 이 논문은 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다.

초록

이 논문은 간세포에서 환경 유기염소 살충제 (OCP)로 인한 대사 장애의 원인을 더 잘 이해하기 위해 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다. HepG2 세포는 β-헥사클로로시클로헥산(β-HCH)에 24시간 동안 일반 집단에서 내부 노출의 동등한 용량으로 노출되었다. 간세포내의 초구조는 미토콘드리아의 손상을 나타내기 위해 전염 전자 현미경 검사(TEM)에 의해 검사되었다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 추가적으로 평가되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브에 의해 염색된 후 미토콘드리아 형광 강도는 형광 현미경검사로 관찰되었다. 루시페린 루시파라제 반응은 ATP 수준을 결정하는 데 사용되었다. MMP는 양이온염 JC-1에 의해 검출되고 유동 세포측정하에 분석되었다. OCR은 세포외 플럭스 분석기로 측정되었다. 요약하자면, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 손상을 조사하기 위해 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하는 데 사용되었습니다.

서문

생식 간섭, 면역 독성, 대사 변화 등 건강에 대한 유기염소살충제(OCP)의 효과는 이전에^1,,2,,3을연구하였다. 세포 대사를 감지하고 미토콘드리아 기능 장애를 알아내는 방법은 과학자들이 미토콘드리아기능(즉)역할을 이해할 수 있게 해 주었다. , 미토콘드리아 STAT3 수준, 젖산, 피루바테, 젖산염-피루바테 비율, 코엔자임 Q10, 미토콘드리아 양성자 누출, 생체 에너지, 생체 발생, 심혈관 기능, 암 및 안전 독성^4,,55,6,,7. 이 논문에서는 OCP에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법을 설명합니다.

우리는 HepG2 세포를 β-헥사클로로클로헥산(β-HCH)에 노출시켰다( β-HCH), 하나의 대표적인 OCP, 24h는 인간의 내부 노출에 상응하는 용량으로. 먼저, TEM은 핵, 미토콘드리아 및 내피 성 망상^8과같은 간세포의 초구조를 관찰하도록 적용되었다. 일반적인 현미경과 비교하여, TEM은 세포 및 세포 성분 (세포주 또는 조직), 형태학, 화학 조성뿐만 아니라 현대 과학 및 기술에서 중추적 인 역할을하는 천연 또는 인공 물질의 기능을 2D 및 3D 초구조를 탐구 할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 더욱 평가되었다. 미토 트래커 그린은 미토콘드리아 그린 형광 프로브로, 살아있는 세포 미토콘드리아 특이적 형광 염색에 사용할 수 있다. 간세포내의 미토콘드리아는 미토트래커 그린 용액과 미토콘드리아 형광 강도, 수 및 패턴에 의해 염색되어 공초점 현미경^9로관찰되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 살아있는 세포를 얼룩지게 하는 데 사용할 수 있습니다. 로다민 123 또는 JC-1과 비교하여 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 미토콘드리아 염색을 위한 미토콘드리아 막 잠재력에 의존하지 않습니다. ATP 수준은 루시파아제-루시페린 키트에 의해 결정되었고 단백질 농도에 의해 정상화되었다. ATP 분석 키트는 일반적인 해결책, 세포 또는 조직에서 ATP 수준을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 키트는 ATP가 에너지를 제공해야 할 때 형광을 생성하기 위해 형광에 의해 촉매된 반딧불 루시파아제를 기반으로 합니다. 반딧불이 루시파라제와 형광이 과도한 경우, 특정 농도 범위에서, 형광의 생성은 ATP의 농도에 비례한다. 또한 이 키트는 ATP의 화학 발광을 최적화하기 위해 특별히 설계되었습니다. ATP는 가장 중요한 에너지 분자로서 세포의 다양한 생리학적 또는 병리학 적 과정에 중요한 역할을합니다. ATP 수준에 있는 변경은 세포 기능에 있는 결점을 반영할 수 있습니다, 특히 미토콘드리아 에너지 생산. 일반적으로 세포 사멸, 괴사 또는 일부 독성 상태에서, 세포 ATP 수준은 ¹⁰감소. JC-1을 사용한 MmPs 분석 키트는 JC-1을 형광 프로브로 사용하여 세포, 조직 또는 정제된 MmP를 빠르고 민감하게 감지하는 키트입니다. 그것은 apoptosis의 조기 검출을 위해 사용될 수 있습니다. 양이온염액 JC-1은 녹색 및 적색 형광비의 변화에 의해 표시된 유동 세포측정하에서 분석될 수 있는 MMP를 검출하는 데 사용되는 형광 프로브이다. MMP가 높을 때, JC-1은 적색 형광을 생성하는 중합체(J-aggregates)를 형성하기 위해 미토콘드리아의 매트릭스에 응집된다. MMP가 낮으면 JC-1이 축적될 수 없으며 녹색^{형광(11)을}생성하는 단조량체를 형성한다. 따라서 적색 및 녹색 형광의 비율은 MMP의 수준을 반영할 수 있습니다. 세포의 OCR은 정상적인 세포^{기능(12)의}중요한 지표이다. 미토콘드리아 기능을 연구하기 위한 매개변수로 간주됩니다. 세포 미토 스트레스 테스트 키트는 미토콘드리아 기능의 주요 파라미터를 분석하는 안정적인 방법을 제공합니다. 이 키트는 품질 관리 및 예측 시약뿐만 아니라 세포 미토콘드리아 응력 테스트를 수행하는 표준 방법을 제공합니다. 그것은 1 차세포, 세포주, 중단된 세포를 포함하여 모든 세포 모형을 검출하기 위하여 이용될 수 있고, 또한 섬, 선충, 효모 및 고립된 미토콘드리아를 위해 이용될 수 있습니다.

OCR 측정은 세포의 생리적 상태 또는 변경에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 호흡 기준선, 양성자 누출, 최대 호흡, ATP 회전율 및 예비 용량을 검출하기 위해 세포외 플럭스 분석기로 결정되었습니다. 간단히 말해서, OCR의 기준선 측정 후, OCR은 올리고마이신(ATP 커플러), FCCP(미토콘드리아 산화 인산화 비커플기) 및 항마이신 A/로테네톤(산소 소비 억제제)에 순차적으로 첨가한 후 검출되었다.

시험관내 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 보다 구체적인 프로토콜의 개발을 용이하게 하기 위해, 우리는 미토콘드리아 손상 관련 불리한 결과를 연구하는 향후 응용 프로그램과 함께 TEM, 공초점 현미경, 발광계, 유동 세포측정및 세포외 플럭스 분석기의 실험을 여기에 제시한다.

프로토콜

모든 실험과 실험 프로토콜은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 난징 의과 대학의 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. TEM에 의한 미토콘드리아 초구조

1. HepG2 세포 수집
   1. 100mm 접시에 씨앗 HepG2 세포. 37 °C 및 5 % CO_2에저장합니다.
   2. 1.5 mLEP 튜브에서 0.25 % EDTA로 세포를 소화합니다.
   3. 실온(RT)에서 3분 동안 1000 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
   4. 4-6 x 10⁵ HepG2 셀을 수집합니다.
2. 파이펫과 함께 5% 글루타랄데히드(용매: 이중 증류수)의 1mL을 넣고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
3. 인산염 완충제 1mL의 4가지 변경 사항(Na₂HPO_4,KH₂PO_4,NaCl 및 KCl, pH 7.4 포함), 각각 15분으로 세척합니다. 파이펫으로 인산염 버퍼를 빨아.
4. 1% 오스뮴 (용매 : 이중 증류수)의 200 μm을 추가하고 검은 색 샘플에 대한 2 시간 4 ° C에서 배양.
   주의 사항: 오스뮴은 매우 독성이 높고 휘발성 물질입니다. 그것은 신중하게 약물 캐비닛에서 작동해야합니다.
5. 인산염 완충제 1mL의 2개 변경 내용으로 넣고 세척합니다. 인산염 버퍼를 빨아.
6. 2h에 대한 1.5 mL EP 튜브에서 2 % 우란 아세테이트 용액 (용매 : 이중 증류수 및 아세트산)에 스테인.
7. 탈수하고 50% 아세톤, 70% 아세톤, 90% 아세톤(용매: 이중 증류수), 절대 아세톤 2개, 각 15분으로 물에 잠급됩니다.
8. RT에서 1.5h에 2방울 아세톤(100%)/임베딩 제(1:1)로 침투합니다. Epon812 포함 제, 조리법은 다음과 같습니다 : Epon812, 62 mL 및 DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL 및 MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, 겨울), A:B=1:9 (v:v, 여름). 포함 금형에 포함 (체크 그리드부드러운 플라스틱 플레이트).
9. 12h용 37°C, 12h용 45°C, 48h의 경우 60°C로 순차적으로 배양한다.
10. 초박형 단면(가장 큰 면적은 0.5mm × 0.3mm)을 초과할 수 없음을 초박한 단면 기계 및 TEM(2 μm 및 500 nm)에 의해 준비하고 관찰합니다.

2. 미토콘드리아 형광 강도 검출

1. 종자 2x 10⁴ HepG2 셀 6 웰 플레이트. 24h에 β-HCH를 추가합니다.
2. 1 mM 미토콘드리아 녹색 형광 프로브의 최종 농도를 공식화하는 무수 DMSO를 추가합니다.
3. 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액(최종 농도: 200 nM)을 추가하고, 45분 동안 37°C에서 배양합니다.
4. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 제거하고 이미징 전에 37°C에서 갓 준비된 세포 배양 배지(DMEM)를 추가합니다.
5. 형광 현미경 (10x)에 의해 미토콘드리아 녹색 형광을 관찰한다. 검출 시 최대 흥분 파장은 490nm이고 최대 방출 파장은 516nm이다.

3. 셀룰러 ATP 수준의 분석

1. 6웰 플레이트에 종자 HepG2 세포. 24h에 β-HCH를 추가합니다.
2. 루시파아제-루시페린 ATP 분석 키트에서 200 μL의 용해 버퍼를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 12,000 x g의 원심분리기는 파이펫으로 새로운 튜브로 상류물을 수집합니다.
3. ATP 검출 버퍼로 ATP 검출 시약을 1: 5의 비율로 희석합니다.
4. 표준 곡선 결정 준비: ATP 표준 솔루션의 0.5 mM을 ATP 표준 솔루션의 0.5 mM을 ATP 리시스 버퍼에 의해 10, 5, 1, 0.5, 0.5, 0.01 μM로 희석합니다.
5. RT에서 5분 동안 96웰 플레이트에 ATP 검출 버퍼 100μL을 추가하고, 발광계(화학발광 검출기)에 의해 감지되는 100μL의 셀 을 추가합니다. 표준 곡선을 사용하지만 ATP 농도(nmol/L)를 계산합니다.
6. 멀티 모드 리더와 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 감지합니다.
   1. 표준 곡선 측정 준비: 단백질 표준 용액 5 mg/mL을 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mg/mL에 이중 증류수로 희석합니다.
   2. 96웰 플레이트에 셀 의 상체 1 μL을 추가하고 이중 증류수 19 μL을 추가합니다.
   3. 각 웰에 대해 200 μL의 BCA 검출 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 562nm의 멀티 모드 판독기에서 OD(광학 밀도) 값을 감지합니다. 표준 곡선을 사용하지만 단백질 농도(mg/mL)를 계산합니다.
7. mg 단백질 농도당 ATP 함량을 수정합니다(단위: ATP 농도/단백질 농도, nmol/mg).

4. JC-1에 의한 미토콘드리아 막 전위(MMP) 평가

1. 6웰 플레이트에 시드된 HepG2 세포를 수집합니다. 1.5mL EP 튜브에서 0.25% EDTA를 가진 세포를 소화하고, 원심분리기는 1000 x g에서 3분 동안, 상체를 버리고 세포를 수집한다.
2. JC-1(200X)의 50μL을 증류수 8mL에 넣고 소용돌이와 혼합합니다. JC-1 검출 솔루션으로 염색 염색 버퍼의 2mL을 추가합니다.
3. 세포 배양 배지의 0.5mL 및 JC-1 검출 용액의 0.5 mL의 혼합물로 세포를 37°C에서 20분 동안 배양한다.
4. 4°C에서 3분 동안 600 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
5. JC-1(1X) 염색 버퍼의 1mL의 2가지 변화에서 헹구고, 원심분리기는 600 x g에서 4°C에서 3분 동안 헹구는다. 그리고 상체를 폐기하십시오.
6. JC-1 (1X) 염색 버퍼의 0.5 mL에서 세포를 중단하고, 흐름 세포측정을 통해 분석하여 녹색 및 적색 형광을 감지합니다. JC-1 폴리머가 검출되면, 발산 광을 490 nm로 설정하고 방출 광을 530 nm로 설정합니다. JC-1 폴리머가 검출되면, 발산광을 525nm로 설정하고 방출광을 590nm로 설정한다.

5. 산소 소비율(OCR) 측정

1. 종자 HepG2 세포는 잘 당 4500 세포/100 μL의 밀도에서 96-well의 세포 배양 마이크로 플레이트에 있습니다. 24시간 이후에 각 셀이 잘 덮여 있는지 확인합니다.
2. 이전^{문헌(13)에}따라 준비된 시약의 적절한 부피를 적절한 사출 포트에 첨가한다. 포트 A: 올리고마이신의 25 μL 1 μM (ATP 커플러); 포트 B: FCCP의 25 μL 0.75 μM (전자 스로틀 제어, ETC 가속기); 포트 C: 25 μL 0.5 의 μM 항마이신 A/로테네론(미토콘드리아 억제제 A 및 미토콘드리아 억제제 B).
3. 사용할 준비가 될 때까지 CO_2가없는 37 ° C 인큐베이터에 카트리지를 저장합니다.
4. 각 웰에서 실행 매체를 제거하고 새로운 DMEM에 추가하여 세포 판의 중간 변화를 만듭니다. 각 우물의 최종 부피는 180 μL입니다.
5. 세포판은 분석 전에 1시간 동안 CO_2가 없는 37°C 인큐베이터에 보관한다.
6. 소프트웨어로 OCR을 자동으로 기록합니다.
   1. OCR 소프트웨어를 엽니다.
   2. 앱 드롭다운 메뉴에서 셀 미토 스트레스 테스트 키트를 선택합니다.
   3. 앱 시작 버튼을 클릭합니다.
   4. 스트레스 실행 테스트 버튼을 클릭합니다. 셀 스트레스 테스트 설정 화면이 나타납니다.
   5. 다음 단계를 수행합니다.
      1. 셀 시드 # 상자에 잘 시드된 셀 수를 입력합니다.
      2. 평균 기초 OCR 상자에 평균 OCR을 입력합니다.
      3. 각 시약에 대한 최종 작업 농도를 입력하고 시약을 주입합니다.
         참고: 세포 파종 농도에 최적화할 때 최적화 분석서를 실행하기 전에 셀의 평균 기초 OCR 값이 검출되어야 합니다.
      4. 다음 단추를 클릭합니다. 그룹 정보 화면이 나타납니다.
      5. 색상을 선택하고 이름을 지정한 다음 적절한 우물을 클릭하여 할당되지 않은 우물에 그룹을 할당합니다.
         참고: 다른 그룹은 세포 미토 스트레스 테스트를 실행하기 전에 다른 치료법으로 정의됩니다. 마이크로 플레이트의 모든 우물은 스트레스 테스트가 실행될 때 동일한 시약 주사를 받게됩니다.
      6. 다음 단추를 클릭합니다. 스트레스 테스트 사출 레이아웃 화면이 나타납니다.
      7. 시작을 클릭합니다. 이제 분석기에서 스트레스 테스트가 실행됩니다. 실행이 끝나면 소프트웨어의 점 s를 따라 카트리지와 셀 플레이트를 제거하고 버립니다.

결과

β-HCH에 노출된 HepG2 세포의 미토콘드리아 크리스테가 현저하게 손상되었다. 산란된 미토콘드리아는 약간 팽창하여 불규칙한 모양으로, 미토콘드리아 능선은 비교적 비정상적인 미토콘드리아아키텍처(도 1)로사라졌다.

미토콘드리아를 나타내는 평균 미토콘드리아 녹색 형광 강도는 β-HCH(도

토론

검출 프로토콜의 성공에 중요한 것은 표현형에서 메커니즘에 이르는 연구를 다루어온 다양한 실험 적 방법의 사용입니다. 이 연구에서, HepG2 세포는 페니실린과 연쇄상 구균 및 10% 태아 소 혈청으로 DMEM에서 배양되었습니다. 세포가 40-50% 합류에 도달하면 β-HCH(0, 10, 100 ng/mL)를 24시간 동안 첨가하고 배양하였다. 먼저 대표적인 OCP, β-HCH에 의한 간세포의 초구조적 변화를 보여 미토콘드리아 구조의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.