16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

요약

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

초록

인간 장 미생물 부상에서 세포를 보호, 에너지와 영양소, 처리 및 면역 증진에 중심 역할을 한다. 건강 한 microbiota 구성 (dysbiosis)으로 간주 됩니다에서 편차 pathologic 조건에 선도 하는 중요 한 기능에 악영향을 줄 수 있습니다. 최근 지속적인 연구 노력 미생물 구성 및 인류 건강 및 질병 사이 협회의 특성으로 지시 되어 있다.

높은 처리량 시퀀싱 기술의 발전 창 자 미생물 구성의 특성을 사용합니다. 이러한 방법에는 16S rRNA amplicon 시퀀싱 및 샷건 시퀀싱 포함 됩니다. 16S rRNA amplicon 시퀀싱 샷건 시퀀싱 유전자 예측 및 주석 기능에 대 한 추가 정보를 제공 하는 동안 분류학 구성, 프로 파일링 하는 데 사용 됩니다. 16S rRNA 유전자 변수 지역의 타겟된 시퀀싱 메서드를 사용 하는 이점은 샷건 시퀀싱에 비해 현저히 낮은 비용입니다. 16S rRNA 유전자에서 순서 차이 식별 하 여 다른 taxa는 개별 샘플 내에서 계량 미생물 지문으로 사용 됩니다.

주요 국제적인 노력 16S rRNA amplicon 시퀀싱에 대 한 표준 입 대 했습니다. 그러나, 몇몇 연구 보고 배치 효과 의해 발생 하는 변이의 일반적인 소스. 이 효과, 샘플 수집, 제복을 입은 프로토콜을 최소화 하기 위해 처리 및 시퀀싱을 구현 합니다. 이 프로토콜은 배설물 샘플 컬렉션에서 데이터 분석을 시작 하는 광범위 하 게 사용된 프로토콜의 통합을 제안 합니다. 이 프로토콜 열-무료, 직접 PCR 접근 동시 처리 및 v 4 지역의 PCR 증폭 함께 배설물 샘플의 많은 수의 DNA 추출 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 또한, 프로토콜 분석 파이프라인을 설명 하 고 QIIME (QIIME 2 버전 2017.7.0 및 DADA2)의 최신 버전을 사용 하 여 스크립트를 제공 합니다. 이 단계별 프로토콜 강력한, 생식, 사용 하기 쉬운, 상세한 방법에 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 사용을 시작에 관심이 안내 목적 이다.

서문

미생물 다양 성과 풍요, 건강 하 고 병 적인 조건에 개인 간의 유사성과 차이점을 캡처의 또 다른 측면으로 이해에 집중된 노력 되었습니다. 나이^2,3, 지리⁴, 라이프 스타일^5,6및 질병⁵ 창 자 미생물의 성분과 관련 된 것으로 표시 했다 하지만 많은 조건과 인구 아직 되지 않은 완전히 특징. 최근에 미생물 치료 응용 프로그램^7,,89수정할 수 있습니다 보고 되었습니다. 따라서, 다양 한 생리 적 조건 및 미생물 구성 사이의 관계에 대 한 추가 통찰력의 잠재적인 미래 수정 최적화 향한 첫 번째 단계입니다.

전통 미생물 문화 방법 낮은 수율^10,11에 의해 제한 되 고 중 박테리아가 이진 상태로 개념화에 현재의. 높은 처리량 DNA 기반 시퀀싱 미생물 생태학, 미생물 커뮤니티의 모든 구성원의 캡처 수 있도록 혁명을 했다. 그러나, 시퀀스 길이 품질 유지 정확한 분류 할당¹²중요 한 장벽을 읽기. 또한, 높은 처리량 기반된 실험 측정 비 생물학 또는 비 과학적인 변수¹³에 의해 영향을 받는 배치 효과에서 고통을 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 여러 프로그램 미국의 직감 프로젝트, 미국 (미국) 인간 Microbiome 프로젝트 및 영국 (영국) MetaHIT 프로젝트를 포함 하 여 인간의 미생물 연구 설립 되었습니다. 이 이니셔티브는 그들의 접근에 일관성의 부족으로 인해 쉽게 비교할 데이터의 방대한 생성. 다양 한 국제 인간 Microbiome 컨소시엄, 국제 인간 Microbiome 표준 프로젝트, 국립 표준 및 기술 (NIST) 같은 국제 프로젝트^{14 이러한 문제의 일부를 해결 하려고} , 신뢰할 수 있는 생식 결과의 달성을 사용 해야 미생물 측정에 대 한 표준을 개발 하 고. 여기에 설명 된 여러 광범위 하 게 사용 되는 방법^15,16 16S rRNA 높은 처리량 (16S-seq)을 시퀀싱 시작 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서에 대 한 통합 된 프로토콜이입니다. 열 무료 PCR 접근, 식물 DNA¹⁶의 직접 추출에 대 한 원래 설계 된 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 배설물의 많은 수의 동시 처리를 비교적 짧은 시간에 높은 품질의 샘플 타겟 DNA을 증폭 시퀀싱의 미생물 변수 v 4 지역의 일반적인 시퀀싱 플랫폼. 이 프로토콜 과학자 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 사용을 시작 하는 강력한, 생식, 사용 하기 쉬운, 상세한 방법에 관심이 중요 한 컨트롤을 사용 하 여 안내 하는 것을 목표로. 가이드 및 상세한 단계-의해 단계 프로토콜 배치 효과 최소화할 수 있습니다 고 따라서 연구소 사이 더 비교 시퀀싱 결과 허용할 것 이다.

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프로토콜

연구를 위한 윤리적인 승인 했다 시바 지역 연구 윤리 위원회에 의해 그리고 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 합니다. 프로토콜 받은 환자 동의 예외 지역 윤리 검토 보드에서 사용 했다 배설물 소재부터 이미 제출 했다 미생물학 코어 나이, 다른 환자 식별 정보 없이 임상 검사 결과의 일부로 서 성별와 미생물 결과 이다입니다. 작성, 동의 건강 한 지원자에서 얻은 고 기관 검토 위원회 승인 연구. 그 샘플 중 일부는 이미 이전 분석¹에 포함 되었습니다.

1. 샘플 처리

1. 수집 된 약 5 m m² 얼룩 (대략 연필 지우개의 크기) 테스트에서 멸 균 면봉으로 신선한 배설물 샘플에서 튜브 ( 재료의 표참조). 24 시간 이내-80 ° C에서 배설물 샘플을 포함 하는 모든 면봉을 저장 합니다. 지저분한 면봉 추가 처리까지 거기 남아 있을 수 있습니다.

2. DNA 추출

1. 추출 및 희석 솔루션 실 온에서 해 동 ( 재료의 표참조).
2. 이동 빈 2 mL 컬렉션에 지저분한 면봉 튜브 ( 재료의 표참조). 크기를 조정할 면봉 스틱 절단 하 여 교차 오염을 최소 관 폐쇄를 사용 하는 깨끗 한가 위를 사용 하 여. 지저분한 면봉 및 혼합 소용돌이 포함 하는 각 컬렉션 튜브를 추출 솔루션의 250 μ를 추가 합니다.
3. 끓는 물 탕에서 10 분 샘플 열 (95-100° C). 각 샘플을 소용돌이를 섞어 희석 솔루션의 250 μ를 추가 합니다.
4. 추출 된 DNA와 4 ° c.에 면봉을 포함 하는 2 mL 튜브를 저장

3. PCR 및 라이브러리 준비

3.1 및 3.2 단계, 깨끗 한, 제공 하는 PCR 워크스테이션에서 작동 템플릿과 amplicon 무료 환경.

1. 라벨 바코드에 따라 프라이 머 (표 1). 두 배 증류수 (DDW) 50 μ M 농도-20 ° c.에가을에서 각 뇌관을 희석
2. 96 잘 접시를 사용 하 여 PCR 반응에 대 한. 각 플레이트는 32 다른 인덱스 뇌관에 의해 표 32 다른 샘플을 포함할 수 있습니다. 앞으로 뇌관 및 실 온에서 32 역 뇌관 thaw 그리고 5 μ M에 그들을 희석.
3. 5 μ M 앞으로 뇌관, 1 mL 2 X PCR 마스터 믹스, 그리고 400 μ DDW의 100 μ를 혼합 하 여 100 반응 (각 잘에서 최종 볼륨 20 μ를 있을 것입니다)에 대 한 PCR 반응 혼합을 준비 합니다. 각 잘 (총 96 웰 스)이 PCR 혼합의 15 μ를 넣어. 3 다른 웰 스 (triplicates에서 32 다른 뇌관 96 웰 스의 총을 제공)을 각 5 μ M 역 인덱싱된 뇌관의 1 μ를 추가 합니다.
4. 사전-PCR 전용된 영역에서 의미는 템플릿과 amplicon 무료, 클린 벤치 추가 각 추출 된 DNA 샘플의 4 μ 반응 혼합물에 (각 추출 된 DNA 샘플 3 중에서 증폭-96 잘 접시 당 32 샘플).
5. 다음 설정으로 PCR을 실행: 3 분;에 대 한 94 ° C의 초기 변성 뒤에 1 분, 1 분, 그리고 1 분; 72 ° C에서 확장 하는 55 ° C에서 열 처리 변성 94 ° C에서의 35 주기 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
6. 게시물-PCR 전용된 영역으로 정의 됩니다, 다른 벤치에 단일 볼륨 관 (60 μ 샘플 당)으로 각 triplicate PCR 반응 결합.
7. PCR amplicons의 품질 평가, ethidium 평범한 사람 얼룩이 1 %agarose 젤에 각 결합 PCR 반응의 4 μ를 실행 합니다. 260의 UV 파장에서 nm, 긍정적인 amplicons 375-425 bp의 예상된 밴드 크기에 표시 됩니다. 이러한 amplicons만 후속 단계에 포함 됩니다.
   참고: 각 샘플은 각 샘플 3 다른 PCR 반응에서 증폭 되어 triplicate, 의미에서 증폭 된다. 확장 하지 마십시오.

4. 도서관 정량화 및 청소

1. 얻기 위해서 모든 PCR 샘플의 아데닌 농도 수영장, 두 배 좌초 된 DNA에 의해 각 amplicon 계량 (dsDNA 계량 시 약) 형광 핵 산 얼룩 ( 재료의 표참조), 큰의 동시 정량화에 적합 샘플의 크기입니다.
   참고: 이후는 amplicon의 크기 범위는 다의 적, nanograms에 실제 금액 아데닌 농도 로드 하는 데 사용 됩니다.
2. 단일, 무 균 튜브에 각 샘플의 조합 500 ng. 소용돌이를 섞어입니다.
3. Ethidium 평범한 사람 얼룩이 1 %agarose 젤에 풀링된 도서관의 200 μ를 실행 합니다. 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤에서 375-425 bp 밴드를 추출 ( 재료의 표참조) 및 80 μ DDW에서에서 풀링된 라이브러리 elute.
   참고: 풀링된 라이브러리 크기 호스트 DNA에서에서 일반적인 증폭 제품을 선택 해야 합니다.
4. 매우 민감한 dsDNA 키트 제조업체의 지침에 따라 검색을 사용 하 여 최종 라이브러리 농도 측정 ( 재료의 표참조). 제조업체의 지침에 따라 DNA 라이브러리에 대 한 매우 민감한 분리 및 분석 키트를 사용 하 여 정확한 라이브러리 크기 측정 ( 재료의 표참조).

5입니다. 시퀀싱

1. 오후 7 시에 20% 컨트롤 라이브러리의 추가 함께 풀링된 라이브러리를 희석 ( 재료의 표참조), 시퀀싱 시스템 프로토콜에 따라.
2. 시퀀싱에 대 한 사용 하 여 사용자 정의 설계 무료 v 4 증폭 뇌관 ( 표 1참조)에 뇌관 읽기.
3. 3 사용 하 여 사용자 지정 설계 된 시퀀싱 뇌관 추가에 바코드를 읽는 주기 ( 표 1참조) 하 고 제조업체의 사양에 따라 각 방향으로 길이 175 기지의 쌍 간 읽기를 생성 합니다.
4. 시퀀싱 컴퓨터를 실행 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 FASTQ 파일을 구하십시오.

6입니다. 데이터 처리

1. 함께 꿰 매 고 QIIME 2 버전 2017.7.0¹⁷에서 구현 된 데이터 큐레이터 파이프라인에서 겹치는 쌍-엔드 FASTQ 파일을 처리 합니다. 샘플 특정 바코드에 따라 읽기 demultiplex
2. DADA2¹⁸ 를 사용 하 여 품질 관리 및 시퀀스 변종 (SVs) 감지. 2 개 이상의 예상 오류 삭제 읽고 3' 끝에서 13 기지와 5' 끝에서 15 기지에서 읽기를 자릅니다. 식별 하 고 일치 메서드를 사용 하 여 키메라를 제거-키메라 샘플에서 개별적으로 검색 되 고 시퀀스에 충분 한 샘플 공상 발견 제거 됩니다.
3. SVs 분류학 분류 Naive Bayes 장착 분류자를 사용 하 여 수행, 8 월 2013에 훈련 99% 신원 Greengenes⁶, 175 데이터베이스 오래 읽기 및 설정/역회전 뇌관.
4. 2146 시퀀스의 깊이에 모든 샘플 rarefy
5. Β에 희박된 샘플 (샘플 다양성^19,20) 사이 다양성의 측정을 위한 Unweighted UniFrac를 사용 하 여 샘플 크기 효과 피하기 위해.
6. 주 좌표 분석 (PCoA) 수행 결과 거리 매트릭스를 사용 합니다.
   참고: 데이터 처리 스크립트 및 매핑 파일 (보충 자료 1 과 2) 보충 자료로 제공 됩니다.

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결과

프로토콜의 도식 적인 그림은 그림 1에 표시 됩니다.

우리는 prospectively 의심된 전염 성 설사로 입원된 환자에서 대변 샘플을 수집. 그 샘플으로는 앞에서 설명한¹시바 메디컬 센터 2 월과 5 월 2015 년 사이 임상 미생물학 실험실에 제출 했다. 대변 샘플 임상 미생물학 실험실에서 수행 하?...

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토론

16S rRNA amplicon 및 metagenomics 샷건 시퀀싱 임상 미생물학 응용 프로그램^21,22,23에서 인기를 얻고 있다. 이러한 기술은 캡처 culturable와 비 culturable taxa, 병원 성 inoculum 그리고 더 정확 하 게 polymicrobial 감염을 식별 하는 능력의 상대적 풍요에 대 한 데이터를 제공 하는 증가 기능에 유리한 ²⁴지문. 미생물 연구의 분야에서 진보는 다양 한 접근?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	Integrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solution	Sigma-Aldrich	E7526
Dilution solution	Sigma-Aldrich	D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit	Invitrogen	P7589	dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kit	Qiagen	28606
Agarose	Amresco	0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free	Biological Industries	01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kit	Molecular probes	Q32854	dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000	Agilent Technologies	Screen Tape 5067-5582	separation and analysis
Screen Tape Assay	Agilent Technologies	Reagents 5067-5583	for DNA libraries
PhiX Control v3	Illumina	15017666	control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003
Ethidium Bromide	Amresco	E406-10mL-TAM
2 mL collection tubes	SARSTEDT	72.695.400	Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tube	STERILE INTERIOR	23117
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR Machine	Applied Biosystems	2720 Thermal Cycler
Sequncing Machine	Illumina	Miseq
PCR workstation	Biosan	UV-cleaner
scissors
vortexer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2