Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

요약

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

초록

실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.

가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 10² 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.

이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.

서문

연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구^{1,2,3에에서 다른 질병을 감지} . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray⁴ 와 RNA 시퀀싱 플랫폼⁵기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식⁶의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구⁷.

위에서 언급 한 문제에 비추어 절대 정량화는 더 작은 양의 체액에서 miRNAs의 평가 적합 수 있습니다. 절대 정량화 방법은 해당 대상 미르⁸의 시퀀스와 동일한 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다. 건강과 환경 과학 연구소 (HESI) 유전체학 회 최근 여러 테스트 사이트에서 플라즈마 miRNAs의 절대 측정의 결과 비교 하는 포괄적인 연구를 실시 했다. 결과 여러 테스트 사이트⁹에서 유사한 결과 굴복 miRNAs의 절대 정량에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 보였다. 현재 연구에서 설명 하는 실시간 정량 분석 방법을 거의 여러 miRNA 표적, 및 낮은 식 miRNAs의 검색을 돕기 위해 사전 증폭의 다중화 분석 포함 HESI의 표준 프로토콜.

이 연구에서 EDTA-혈장 혈액에서 준비의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 (n = 50) 사용¹⁰. 다음과 같은 프로토콜의 추출, miRNA 및 RT-정량, 사전 증폭을 포함 하 여 플라즈마 샘플의 준비를 위한 절차를 설명 합니다. 샘플에서 대상 miRNAs의 수량 충분 한 자격이 프로세스와 함께에서 유효성을 검사할 수 있도록 더 중요 하 게는 프로토콜에 대 한 추가 기술 정보 포함 되었습니다. 첫째, 각 미르의 표준 곡선 생물학 견본에서 그것의 부 량 이전의 개별 검색 범위에 대 한 유효성을 검사 했다. 둘째, 현재 방법론의 품질 외부 컨트롤 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의해 종합적으로 평가 되었습니다. 따라서,이 플랫폼은 다른 연구 나 실험실에서 결과 비교 하기 위한 더 유익 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 합니다.

8 miRNAs의 프로필 대표 결과로이 보고서에 포함 된 시험 방법을 여기에 설명 된에서. 이러한 miRNAs (미르-1, 미르 208a, 미르-208b, 그리고 미르-499a), 심장 및 골격 근육 (133a 미르와 미르-206) 설치류와 인간^{3, 잠재적인 안전 생체 (122 미르와 미르-192), 간 조직 상해와 관련 된으로 제안 되어 11,,1213}.

프로토콜

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다이 이치 산 쿄 주식회사에 의해 승인 되었다

1. 샘플 준비

1. EDTA 2 K 포함 된 튜브에 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 혈액 (적어도 0.5 mL)를 수집 합니다.
   참고: 시트르산과 헤 파 린 허용 되지 않습니다 때문에 이러한 응고 억제 이후 PCR^14,15.
2. 즉시 얼음과 컬렉션의 2 시간 이내 플라즈마 격리 프로세스에 수집 된 샘플을 놓습니다.
3. 5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 샘플 원심
4. 2 mL microtube, 세포 파편 및 잔여 혈소판을 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 원심 분리 뒤에 상쾌한을 전송 합니다.
   참고: 정량화 miRNAs의 혈소판 오염¹⁶에 의해 크게 달라질 수 있습니다.
5. 신선한 2 mL-microtubes에 상쾌한의 200 µ L aliquots를 놓고 사용까지-80 ° C에 저장 합니다.
   참고: 각 샘플의 고정된 볼륨은 사용할 RNA 추출; 따라서,는 약 수의 볼륨 정확 해야 합니다.

2. RNA 추출

1. 냉동된 샘플 (1.5 단계)에서 얼음에 녹여
   1. 계속 샘플 차가운 얼음에 RNA 추출 하는 동안. 세포 시 약을 진정 하 고 사용 하기 전에 얼음에 클로 프롬.
2. 세포 시 약, 포함 하는 샘플 (200 µ L), 페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션의 5 볼륨 (1000 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.
3. 5 nM 합성의 5 µ L 추가 꼬마 선 충 미르 (Syn-cel-미르-238-3 p).
4. 클로 프롬의 1 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.
5. 2 ~ 3 분 동안 얼음에 유지 하 고 15 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 샘플을 원심.
6. 신중 하 게 새로운 microtube 수성 단계 전송.
   참고: 유기 단계 (빨간색) 또는 interphase (흰색)를 전송 하지 않습니다. 수집 된 수성 단계의 볼륨 증가 기술 변화에서 결과 불일치를 처리 하지 않도록 균일 해야 한다. 이 프로토콜에 수성 단계의 일반적인 금액 650 µ L 이었다.
7. 에탄올, 1.5 볼륨 (975 µ L)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합.
8. 해당 열과 어댑터, 진공 건조 진공 매니폴드를 사용 하 여 3 분 뒤에 샘플을 전송 합니다. 샘플 볼륨 이상 700 µ L 이면 나머지 솔루션을 처리 하려면이 단계를 반복 합니다.
   참고: 열 기반 RNA 격리 진공 및 원심 분리 방법와 호환 됩니다.
9. 뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.
10. 뒤에 2 분 동안 진공 건조 열 RWT 버퍼의 800 µ L를 추가 합니다.
11. RPE 버퍼의 800 µ L 뒤에 2 분 동안 진공 건조 하 여 열을 추가 합니다.
12. 2.11 단계를 반복 합니다.
13. 뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.
14. 새로운 microtube에 열을 배치 하 고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 12000 x g에서 원심.
15. 새로운 microtube에 열을 전송 하 고 nuclease 무료 물 50 µ L를 추가 합니다.
16. 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 3 분, 그리고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 8000 × g에서 원심 분리기에 대 한 서.
17. 다시는 eluate 열에 적용 됩니다.
18. 2.16, 단계를 반복 하 고 사용까지 eluate-80 ° C에서 저장.

3입니다. cDNA 합성

1. (단계 2.18)에서 냉동된 샘플 녹여
2. 대상 miRNAs에 해당 하는 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도 준비 합니다.
   1. 합성 RNA oligonucleotide를 사용 하 여 정량에서 표준 곡선을 생성 하기 위한. 1 x 10⁸ 복사 / µ L 농도의 재고 솔루션 스토리지 목적을 위해 준비가 되어 있습니다.
   2. 재고 솔루션을 1 x 10⁷ 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플) 또는 1 x 10⁵ 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 작업 솔루션 표준 곡선을 만들기 위한 가장 높은 농도 10 배 희석. 일반적으로, 표준 곡선 농도 대 한 제안된 범위는 1 x 10² 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 10⁷ 또는 1 x 10⁰ 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플)을 1 x 10⁵ .
3. 멀티플렉스 RT 뇌관 수영장 대상 miRNAs에 대 한 20 x RT 뇌관의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비 합니다.
   참고: 지금까지 그림 2에서 같이에 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. 미만 4 대상 miRNAs의 경우 20 x RT 뇌관 대신 1/10 테 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
4. RT 반응 혼합 준비: 3 µ L RT 뇌관의 dTTP와 100mm dNTPs의 0.15 µ L, 역전사 (50 U / µ L), RT 버퍼 x 1.5 µ L 10, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 0.19 µ L의 1 µ L (3.3 단계)에서 수영장 및 4.16 µ L nuclease 무료의 물.
5. RT 반응의 믹스 10 µ L pipetting, 여 (3.1 단계)에서 RNA 샘플 또는 (3.2 단계)에서 oligonucleotides의 5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.
6. 열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 16 ° C 30 분, 30 분 동안 42 ° C에 대 한 다음 5 분에 85 ° C에서 최종 역전사 비활성화 단계 저장소 역방향 베낀된 샘플-80 ° C에서 사용까지.

4입니다. preamplification (선택 사항)

참고: Cq 값 35 또는 후속 정량에 더 이상 보여 주는 miRNAs는 미리 증폭.

1. 냉동된 샘플 (3.6 단계)에서 녹여
2. 10 직렬 희석 합성 RNA oligonucleotides;에서 실시간 제품의 확인 1 x 10을 1 x 10⁰ 복사 / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위한⁵ .
3. 대상 miRNAs 200-fold 묽 게 되 고 각 분석 결과 뇌관의 최종 농도 대 한 분석 결과 뇌관 x 20의 다중 분석 결과 뇌관 풀 같은 볼륨 (5 µ L)를 혼합 하 여 준비 테 버퍼 1000 µ L의 최종 볼륨에 의해.
   참고: 해당 대상 miRNAs 사전 증폭 없이 cel-미르-238 (외부 제어)에 대 한 후속 정량에서 감지 수 분석 결과 뇌관 뇌관 수영장에는 포함 되지 않습니다.
4. 사전 증폭 반응 혼합물 준비: 2 x 준비-사용 preamplification 시 약, 분석 결과 뇌관 풀 (4.3 단계)에서 3.75 µ L nuclease 무료 물 6.25 µ L의 12.5 µ L.
5. 사전 증폭 반응의 µ L 믹스 22.5 pipetting, 여 역 베낀된 샘플 (4.1 단계) 또는 (4.2 단계)에서 oligonucleotides의 2.5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.
6. 반응 열 cycler 기구에 실행: 95 ° C 10 분; 15 s 및 4 분 동안 60 ° C까지 사용-80 ° C에 미리 증폭된 샘플을 저장 하는 동안 95 ° C의 12 주기 다음.

5. 정량 실시간 PCR (정량)

1. 냉동된 샘플 (3.6 단계 또는 단계 4.6)에서 녹여
2. 5-fold 샘플을 희석 소독 물.
3. 합성 RNA oligonucleotides;에서 파생 된 RT 제품의 10 연속 희석을 준비 1 x 10² 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 10⁷ 또는 1 x 10⁵ 1 x 10⁰ 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 표준 곡선을 생성 합니다.
4. 정량 Pcr 반응 혼합 준비: 준비-사용 증폭 시 약, 분석 시 약, 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 조사 대상 미르에 포함 된 x 20의 1 µ L과 nuclease 무료 물 7 µ L x 2의 10 µ L.
5. 정량 Pcr 반응 혼합에서 빠른 광학 96-잘 반응 판 18 µ L를 전송 하 고 우물에 (단계 5.2 또는 5.3 단계)에서 희석 샘플 2 µ L를 추가 합니다.
   참고: 샘플 및 정량에 대 한 표준을 설정 됩니다 중복에.
6. 접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.
7. 반응 실시간 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C 95 ° C의 45 주기 다음 s 1 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.

6. 데이터 분석

1. 해당 실시간 열 cycler와 함께 작동 하는 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 원시 복사본 수를 계산 합니다.
   참고: 임계값 줄 설정 됩니다 수동으로 "1.0"은 연구에 모든 접시에 그들의 Cq vales 비교해보면 재현성 확인 하. Cq에서 차단 수준 설정 > 40 주기.
2. 중복에서 각 샘플의 원시 복사본 수의 평균을 계산 합니다.
3. 해당 관의 모든 샘플에서 cel-미르-238의 복사본 수의 평균에 의해 cel-미르-238 각 샘플에서의 복사본 수를 분할 하 여 수정 계수를 계산 합니다.
   참고: 그림 2에서처럼 각 튜브 4 대상 miRNAs cel-미르-238 (외부 제어) 등까지 포함 합니다. 따라서, cel-미르-238의 해당 값을 사용 하 여 각 튜브에 대 한 수정 계수를 계산 합니다.
4. (단계 6.2)에서 각 샘플의 평균된 원시 복사본 수를 분할 하 여 각 샘플 (단계 6.3)에서 수정 계수에 의해 조정된 복사본 수를 계산 합니다.
5. 여 (단계 6.4)에서 각 샘플의 조정된 원시 복사본 수를 곱하여 절대 복사본 수를 계산는 각 샘플에 대 한 희석 비율.
   참고: 희석 요인은 단계 5.2에서 파생 되는이 프로토콜에 "5"입니다.
6. 로그 cDNA 농도 대 한 각 직렬 희석 Cq 값의 작의의 사면에서 PCR 증폭의 효율을 계산 합니다.
   참고: 수식을 계산 하는 효율성; E = (10^(-1/경사) -1) x 100%.
7. 계산 수식 E를 사용 하 여 모든 샘플에서 cel-미르-238의 Cq 값을 사용 하 여 기술 변화 = (2 x 확대 효능)^{ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq))}.
   참고: 6.5, 6.7 단계 절차의 품질 평가에 사용 됩니다.

결과

실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 워크플로 및 품질 assessment
그림 1 에서 정량¹⁰를 사용 하 여 혈액 샘플 분석 결과 miRNA의 워크플로 보여 줍니다. Cel-미르-238는 외부 컨트롤을 포함 하 여 실험의 품질을 확인할 수 있습니다. 이 RNA 추출 기술 변화를 보여줄 것입니다 및 후속 실시간 정량 Pcr 처리 합니다. 이 ...

토론

우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼¹⁸에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Microtainer tube (K2EDTA)	Becton, Dickinson and Company	365974	For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL	Eppendorf	0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL	Eppendorf	0030120094
Synthetic oligonucleotide	Hokkaido System Science	-	Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)	Nippon Gene	314-90021	TE buffer
Buffer RPE	QIAGEN	-	Contents in miRNeasy mini kit
Buffer RWT	QIAGEN	-	Contents in miRNeasy mini kit
miRNeasy Mini Kit	QIAGEN	217004
Nuclease-Free Water	QIAGEN	129114
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	-	Contents in miRNeasy mini kit
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic	QIAGEN	219600	ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters	TAIGEN Bioscience Corporation	S0120	For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System	TAIGEN Bioscience Corporation	M3610	For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific Inc.	4351405	Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700	Thermo Fisher Scientific Inc.	9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific Inc.	4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific Inc.	4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific Inc.	4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4391128
Chloroform	Wako Pure Chemicals	035-02616
Ethanol (99.5)	Wako Pure Chemicals	057-00456