Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

요약

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

초록

급성 골수성 백혈병 (AML)은 다른 유형의 그리고 치료 하지 않으면, 치명적인 질병. 그것은 성인 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 질병 차별화, 폭발 세포 백혈병의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 이 백혈병 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장,이 동적 셀 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 하는 구획 부과 시 백혈병 진행 및 치료 하는 동안. LSC 인구를 추가로 정의 하려면 CD90 추가 CD45RA CD34 + CD38-셀 구획 내에서 정상적인 HSCs multipotent 창시자의 차별 수 있습니다. 여기, 우리 multiparametric cytometry에 의해 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 여러 개의 상 상속 LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 표현 검색 프로토콜 개요. 또한, 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다. 검색의이 방법 및 상 상속 LSC의 정량화 임상 후속의 화학 요법 응답 사용할 수 있습니다 (즉., 최소 잔여 질병), 잔여 LSC AML 재발을 일으킬 수 있습니다.

서문

급성 골수성 백혈병 (AML) 백혈병 관련 된 사망의 가장 흔한 원인입니다. 처음, AML는 조 혈 줄기 세포 (HSC)의 클론 질병 차별화, 폭발 셀의 후속 축적의 체포를 특징으로하 고 기능성 조 혈 요소의 생산을 감소. 최근, 폭발 세포 인구의 클론이 차세대 시퀀싱 (NGS) 전략을 사용 하 여 종양 세포¹의 내부 클론 진화의 존재를 보여주는 본질적으로 설립 되었습니다.

이 leukemic 줄기 세포 (LSC)의 존재를 확장합니다. 그것은이 동적 셀 구획 백혈병 진행 및 치료 하는 동안에 부과 하는 다양 한 선택 압력을 극복 하기 위해 진화 가설입니다. 따라서 LSC 현재 화학요법 식이요법을 저항 하 고 깊은 임상 의미²질병 재발을 중재 하는데 있다. 다양 한 마커 CD123³, CLL-1⁴, CD97⁵ 또는⁶팀-3 같은 LSC 하 설명 했습니다. CD34 + CD38-폭발 세포의 구획 LSC⁷ 농축 간주 됩니다 하지만 또한 정상적인 HSC를 포함 합니다. CD90 CD45RA 표현 CD34 + CD38에 적용-정상 및 악성 조 혈 전⁸의 몇몇 단계를 분리 하는 허가 (P6) 구획 (그림 1). 특히, 정상적인 CD34 + CD38, CD90 + CD45RA HSCs, multipotent 창시자 (MPP) 같은 CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-세포와 CD34 + CD38-CD90-CD45RA + 림프 액 multipotent 조상 (LMPP) 셀 AML의 대부분에 결정 될 수 있는 경우^{8 ,9}. CD38의 평균 형광 강도 (MFI) CD34 + 세포 구획 내에서 고려 되어야 하는 특히 중요 하다. CD38 강도 3 개의 새로운 세포 구획 그를 정의 하기 때문에: CD38 네거티브 (P6), CD38 dim (P7)와 CD38 밝은 (P8) (그림 1). CD38 MFI를 사용 하 여 hematogones 또는 플라즈마 세포 내부 긍정적인 컨트롤로 이러한 세포는 강하게 CD38 표현으로 결정 될 수 있습니다.

Immunodeficient 끄 덕/SCID/IL2Rγc^null (NSG) 마우스 모델은 정상의 engraftment를 위해 널리 이용 된다 그리고 악성 인간 조 혈 모 세포^10,11. 직렬 xenotransplantation 분석 LSC 또는 HSC 함수를 실험적으로 확인 하는 데 사용 됩니다. 이 연구는 광범위 하 게 대규모 시퀀싱 접근에 의해 분석 되었습니다 했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 덜 AML 폭발 인구는 주요 AML (그림 2)에 비해 NSG 쥐에 engrafted LSC 및 HSC immunophenotype에 대 한 알려져 있다.

LSC의 숫자는 이렇게 본질적으로 낮은, 식별 및 LSC의 정량화는 도전 하며 여기에 설명 된 방법을 사용할 수 있습니다 흐름 cytometric 분석 결과 진단 및 임상 수행으로 (로 잔여 LSC 수 있습니다 화학 요법 응답을 평가 하 급성 골수성 백혈병 재발 발생할). LSC의 존재는 긍정적인 최소 잔여 질병 (MRD)를 나타낼 수 있습니다. 날짜 하려면, MRD 분자 방법 (즉, RT-PCR, NGS)에 의존 대부분 AML에 모니터링^10,12. 그러나,이 프로토콜에 우리 검색 여러 HSC/LSC 마커 (CD34, CD38, CD45RA, CD90)의 동시 단백질 표정 인간의 AML의 기본 폭발 셀에 multiparametric 흐름 cytometry^2,,89. 항 체의이 조합은 어떤 표준 흐름 cytometry 실험실에 적용 될 수 있습니다 그리고이 흐름 MRD 분석 결과 특히 재미 있는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 MRD 불가능 때 즉, 경우 백혈병 특정 분자 마커 진단 AML 샘플에서 감지 되지 않습니다. 또한,이 프로토콜은 더 민감한 분자 MRD 기술 보완으로 감지 하 고 비정상적인 조 혈 조상 세포를 계량 하는 것을 목표로 나타내는 기능 셀 특성 (그림 3).

우리 3 조 혈 모 조상 인구와 성숙의 다른 학위를 가진 상 상속 LSC 구획 cytometry 임상 실험실의 대부분에서 사용할 수 있는 항 체와 함께 하 여 계량 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리는 해당 환자-파생-xenografts (PDX) 이러한 셀 구획의 존재를 확인 하 고 치료에 후속.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

우리는 과학적 목적을 위한 동물의 사용에 대 한 유럽 표준을 따른다. 이 연구는 지역 윤리 위원회 (#3097-2015120414583482v3)에 의해 승인 되었다.

1. 샘플 준비

1. 골 수의 mL 당 1.8 mg의 농도에서 항 응 혈 약 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 포함 하는 튜브에 드 노 보 AML에서에서 골 (2 mL)를 수집 합니다.
2. Ficoll 분리, 뒤 붉은 세포를 granulocytes, 단 세포를 분리 하는 밀도 그라데이션 분리를 수행 합니다. 골 3 양의 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석 (PBS: NaCl 137 m m, KCl 2.7 m m, Na₂HPO₄ 10 m m, KH₂포₄ 1.8 m m). 조심 스럽게 희석된 골의 1 볼륨 1 양의 Ficoll 오버레이. 회전 브레이크 없이 300 x g에서 30 분. 새로운 무 균 튜브에 흰 버 피 코트 층의 mononucleated 세포를 전송 합니다.
3. 10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어) 오염 혈 청 성분을 제거 하기 위해 5 분 동안 300 x g에서 원심과.

2. 적혈구 (RBC)의 세포

1. 셀에 세포의 용 해 버퍼 (염화 암모늄 0.8%)의 2 개 mL를 추가 작은, 소용돌이 부드럽게 하 고 5 분 x 300g에 5 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어.
   참고: 필요한 경우이 단계를 반복 합니다.
2. 워시 셀 PBS에는 이전 (1.3)를 설명합니다.

3. 환자 xenografts 파생.

1. 폭발 세포 골 수에서 Ficoll 분리 후 가져오고 immunomagnetic를 사용 하 여 세포 고갈 후 부정적인 선택 (CD3 T-와 B-세포에 대 한 CD20). 제조업체의 지침을 따릅니다.
2. 5 x 10⁶ AML 폭발 셀 무조건된 NSG 쥐의 꼬리 정 맥에 주사. 금지 장치를 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입을 촉진 하기 위하여. 계속 마우스 기존의 조건 및 특정 병원 체 자유로운 조건에서 특히 모든 시간, 개별 환기 케이지를 사용 하 여 층 류 후드 조작. 매 2 주, 모 세관 submandibular 컬렉션 메서드는 보통을 사용 하 여 혈액의 60 µ L를 걸릴. 장소 5 mL에 모 세관 튜브 하단 라운드. 작은 멸 균 거 즈 패드를 사용 하 여 부드러운 압력을 적용 하 여 피를 중지 합니다. Expulse 깨끗 한 주사기 혈액입니다.
3. 세포의 용 해 버퍼의 1 ml을 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 5 분 동안 5 분 PBS와 300 x g에서 centrifugre 세척에 대 한 300 x g에서 원심. 상쾌한, 3 µ L 안티 인간 CD45 FITC와 1 µ L 안티 murine 10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 얼룩과 추가 100 µ L PBS를 제거 CD45 APC와 4 ° C에서 30 분 동안 품 어.
4. PBS (2 mL) 10 %BSA 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기에에서 셀 펠 릿 두 번 세척.
5. Aliquot 최대 흐름 cytometry 튜브로 PBS의 100 µ L 당 1 x 10⁶ 셀.
6. CD45 (인간의 대 murine) 식의 설문 조사 engraftment chimerism 분석 하 여 2 주마다 cytometry (그림 2A , B)를 사용합니다.
7. 희생 (주변 폭발 수가 이상 70% 또는 질병의 심각한 임상 증상)에서 수집 되 폭발 세포 골 및 분쇄 spleens에서 tibias 홍 여 하 고 PBS와 화관 앞¹³에서 설명한. 자 궁 경부 전위 국제 지침에 의해 마우스를 안락사.
8. 셀 펠 릿 RBC 있으면 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 (단계 2.1)의 세포를 수행 합니다.
9. 워시 셀 펠 릿 두 번 PBS (2 mL) 10 %BSA 300 x g에서 원심 분리기에서에서 5 분.
10. 교류 cytometry 튜브로 PBS의 100 µ L 당 1 x 10⁶ 셀에 셀과 aliquot 업을 수집 합니다.

4. 얼룩

1. 활용 된 항 체 (단계 4.2 참조)와 소용돌이 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 15 분에 대 한 셀을 품 어.
2. 인간의 기본 또는 PDX 샘플 안티-CD36-FITC의 10 µ L, 안티-CD19-ECD의 5 µ L, 안티-CD33-PC5.5의 5 µ L, 안티-CD90-APC의 5 µ L, 안티-CD34-AA700, 안티 CD45RA APC H7의 5 µ L, 안티-CD38-태평양 파랑의 5 µ L의 5 µ L의 5 µ L의 구성에 대 한 다음 패널을 사용 하 여 안티-CD45-코의 µ 한 안티-CD123-PC7 및 2.5 L
3. 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 2 ml PBS의 셀을 세척 하 여 언바운드 항 체를 제거 합니다.
4. 다시 최종 흐름 cytometric 분석에 대 한 PBS의 450 µ L에서 세포를 일시 중단 합니다.

5. 게이팅 흐름 cytometry 분석을 위한 전략

1. 빨강, 파랑, 보라색 레이저를 갖춘 교류 cytometer에서 데이터 수집 (적어도 500000 셀)을 수행 합니다. 1) 광학 정렬, 2) 유체 시스템, 3) 광학 감도 및 4) fluorospheres를 사용 하 여 표준화에 대 한 매일 cytometer 설정 확인
2. CD38 식 (그림 1)을 정의 하려면 순차 제어 전략을 따릅니다.
   1. 정상적인 골 수 샘플에서 세포를 사용 하 여 정의 하는 hematogones 또는 플라즈마 세포 CD38 식에 대 한 긍정적인 통제 될 것입니다.
      참고:이 게이트는 특히 후속 putative LSC 인구 그것의 정의에 따라 평가 해야 합니다.
   2. CD45dim/SSC (사이드 분산형) 낮은 인구 기준 (그림 1A)에 의해 생리 선구자 세포 (정상 돌풍 세포)를 정의 합니다. 이 폭발 인구 내의 정의 CD38 표시 하는 hematogones + + CD19 + 형 (그림 1B)와 마지막으로, CD36 및 CD33 식을 사용 하 여 정의 하는 myeloblasts, monoblasts, 및 erythroblasts (그림 1C). (그림 1E)와 같이 hematogones CD34 식을 결정 합니다. P6-P10 (그림 1D)로 정의 된 폭발 세포 내에서 일어나는 여러 가지 부분 모집단을 평가 합니다. P6, P7, P8 조상 모집단 미리 CD38 게이트를 기반으로 폭발 셀 CD34 구획을 구분 합니다. P8 구획 P6 CD38 기반 (FMO) 컨트롤 마이너스 CD38 형광에 있는 셀을 포함 하는 hematogones로 동일한 CD38 강도 있는 폭발을 포함 하 고 P7 셀 CD38 관련 2 개의 극치 사이 식 (그림 1D)입니다.
3. CD34 + 38-(P6)에서 문이 셀, CD90 CD45RA 표현 (그림 1 층)을 사용 하 여 상 상속 LSC에서 HSC를 구분 합니다.
   참고: HSC 형은 CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-multipotent 창시자 (MPP)는 CD34 + CD38로 정의-CD90-CD45RA-. 상 상속 LSC 형은 CD34 + CD38-CD90dimCD45RA +와 더 미 숙 다운스트림 인구는 CD34 + CD38로 정의 된 림프 액 창시자 (LMPP)-CD90-CD45RA +.

6입니다. MRD RT-PCR에 의해 모니터링

1. 앞에서 설명한¹⁴RT-PCR에 의해 모니터 MRD 수준.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

여기 우리 조상 인구 정상 및 악성 인간의 골 수 샘플을 결정 하는 방법을 제시. 우리는 성공적인 PDX에서 골 수 및 비장 수집 하 고 위에서 설명한 대로 multiparametric cytometry 수행. 우리는 폭발 세포 진단 환자 샘플 및 해당 PDX 및 특히, CD34 + CD38-조상 구획 사이 특히 putative LSC에 농축의 여러 모집단 비교. 우리는 발견 CD34 + CD38-폭발 분수에서 PDX 진단 환자 샘플 0.53%, 그림 2C,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

막 또는 세포질 마커 cytometry에 의해 정확 하 고 재현성 평가 악기 설정을 매일 광학 정렬, 적절 한 유체 시스템, 광학 감도 및 표준화의 기능에 대 한 확인 필요 교정 구슬을 사용 하 여.

AML CD90 및 CD45RA를 사용 하 여 다중 변수 흐름 cytometry 분석에서 폭발 세포 인구의 탐지는 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 분석에서 중요 한 단계는 CD34 + CD38-인구의 정확한 게?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pancoll	PAN-Biotech	P04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)	Ozyme	BLE420301	RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  mice	JACKSON LABORATORY	Stock No: 005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)	Beckman Coulter	PN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)	Beckman Coulter	B36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)	Biolegend	328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)	Beckman Coulter	A07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)	Beckman Coulter	B92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)	Beckton Dickinson	560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)	Beckman Coulter	B92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)	Beckman Coulter	B36294
Anti-CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
Anti-CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
Anti-CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
Anti-hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
Anti-mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep human PE selection kit	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  magnet	Stem Cell Technologies	18551