머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

요약

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

초록

고급 및 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에 대 한 현재의 치료 옵션은 방사선 및 항 암 치료 방사선 접근 또는 수술 없이 묶습니다. 백 금 기반의 화학요법 식이요법 현재 효능 측면에서 금 표준을 동안에 대부분의 경우, 새로운 화학요법 식이요법, 즉 immunotherapy 등장 하고있다. 그러나, 응답 속도 및 치료 저항 메커니즘 중 항 암 치료 처방에 대 한 예측 하 고 제대로 이해 남아 있습니다. 항 암 치료 및 방사선 저항 메커니즘의 광범위 한 변화는 날짜를 알려져 있습니다. 이 연구는 표준화, 높은 처리량에 생체 외에서 분석 결과의 개인된 종양에 대 한 미래의 도구로 개별 환자에서 HNSCC 셀 라인의 응답 다양 한 치료 식이요법, 그리고 잘하면 1 차 셀을 평가 하기 위해 개발을 설명 합니다. 치료입니다. 분석 결과 우리의 제 3 배려 센터; HNSCC 환자에 대 한 품질 제어 표준 알고리즘에 통합 되 고 하도록 설계 되었습니다. 그러나,이 미래 연구의 대상이 될 것입니다. 기술적 타당성 실제 환자에서 종양 생 검에서 1 차 셀에 대 한 약속 같은 데. 표본은 다음 실험실으로 전송 됩니다. Biopsies는 기계적으로 따라 효소 소화에 의해 구분 됩니다. 다음 셀에 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업의 재현, 표준 및 자발적 형성을 촉진 하는 매우 낮은 접착 셀 문화 튜브 교양. Spheroids 다음 프로토콜과 immunotherapy 프로토콜 필요에 따라 항 암 치료 방사선에 노출 될 준비가 됩니다. 마지막 셀 생존 및 회전 타원 체 크기 치료 민감성의 지표 이며 환자 들 치료 가능성이 응답을 평가 하기 위해 미래에 고려 사항으로 얻을 수 수 있습니다. 이 모델 쪽으로 머리와 목 암 맞춤된 치료 가치, 비용 효율적인 도구 수 있습니다.

서문

머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)는 여섯 번째 가장 일반적인 암 전세계 점 막 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) 감염 관련 pathogenesis, 대부분의 경우 과도 한 니코틴과 알콜으로 인 한 옆의 상승 부각 소비 ^1,2. 고급 단계와 재발 HNSCC에 대 한 치료 남아 공격적인 종양 침공으로 인해 도전 작은 종양 전 침략 적인 단계는 일반적으로 외과 절단, 일반적으로 자 궁 경부 림프절 절 개와 결합으로 잘 치료할 수 전이성 확산 및 저항 방사선 및 화학 요법 프로토콜^3,,45,6,7,8. 최근 연구 제안 세포 표현 형의 높은 가변성 및 순환의 하위 특성화 고 전파 종양 세포 막^9,10를 시작 했다. 고체, 균일 한 종양의 이전 신념 질량 과거에 최근의 연구에 비추어 수정 되어야 했다 년^11,12,13,14. 종양 특성 및 주요 돌연변이의 id에 대 한 현재 접근 여러 유전자 치료 저항에 연결할 수 있지만 비용 집약적인 접근을 유지 하는 것을 식별할 수 있는. 또한, 유전자 형의 지식 표현 형 및 치료 응답의 신뢰할 수 있는 예측을 반드시 허용 하지 않습니다.

고급 단계와 재발 성 질환에 대 한 전체 및 질병-무료 생존 개선 몇 발전 되었습니다. 니코틴-로 바이러스 관련 암, 수술 외에 현재 치료 옵션이 공격적 방사선 및 백 금 기반의 화학요법 식이요법을 묶습니다. 자 궁 부정과 긍정적인 암; 사이 다른 응답 속도 대 한 의미 되었습니다. 그러나,이 되지 않은 아직 변화를 일반적 치료 지침 이어질. 저항 방사선 및 화학 요법 광범위 한 현상에서 모든 종양 단계 이며 백 금 기반 화학 요법 또한 타겟된 치료 (안티-EGFR;에 관해서는 존재 표 피 성장 인자 수용 체) 그리고 최근 검사점 금지¹⁵신흥. 효과 없는 방사선 및 화학 요법 dysphagia, mucositis, 구강 건조와 다른 사람 사이 신장 또는 심장 기능의 감소의 위험이 큰 환자 사망률의 높은 비용에 온다. 치료 응답 사전 예측 각 개별 환자에 대 한 일반적인 치료 개념의 결정 중요 한 목표는, 불필요 한 치료 개념, 부작용 및 비용 방지 될 것으로 보인다.

우리가 현재 표준 항 암 치료-방사선 기술 서 점에서 일반 및 품질 제어 종양 치료 알고리즘에 통합 될 수을 향해 개별 환자의 치료 민감성을 테스트 하는 모델을 확립 하고자 했다. 멀리 목표 그들은 제대로 그들의 변화 없이 실제 인간 종양 세포를 대표 하 고이 프로토콜의 설립 동안 지금, 아시다시피 이루어졌다 다양 한 셀 라인에 무 겁 게 변경 하 고 세 셀 라인을 사용 하지 않고 모델을 사용 했다. 상업적으로 사용 가능한 셀 라인 에서만 독립 수, 우리 최근 성공적으로 생성 "피 카" 라는 중간 셀 라인 인간의 종양 표본에서 기본 HNSCC 세포에서 그것의 표면 및 한정 된 구절 ^{에 보존 세포 마커 16}.이 피 카 셀 라인 나중 다음 신선한 인간의 암 세포 실험에서 종양 생 검에도 모델의 개발에 대 한 준비로 봉사 해야 한다. 그것은 그 문화는 다르게 반응 하는 3 차원 셀 및 더 많은 vivo에서세포 표시 되었습니다-monolayers^{17,,1819,20에서에서 성장 보다 암 약물의 관리 같은 ,21}, 철새의 보존 때문에 주로 및 특정 셀 하위 집합^22,,2324의 하위 차별화 속성. 여기, 우리가 중간 셀 라인에서 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 모델의 프로토콜을 설명 하 고 기본 인간의 편평 세포 암 종 세포와 방법을 어떻게 통합 같은 모델 머리와 목 외과 및 종양학 ( 의 암 치료 그림 1).

프로토콜

이 원고, 즉 인간의 종양 견본의 사용에 표시 된 모든 연구는 사전 결정에서 대학 의학의 마인츠/대학 뮌헨 의료 센터 윤리 위원회의 동의 보호 됩니다. 환자는 그들의 치료 과정에서 얻은 초과 생물학 자료의 과학적인 사용에 동의 하는 국가 법률 지침에 따라 동의 주었다. 연구는 인간의 복지에 대 한 모든 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행 되었습니다.

1. 머리와 도대체 편평 세포 암 종에서 종양 생 검 복용

1. 수행 일반 (propofol 및 sevoflurane, 근육 편안한 에이전트) 또는 로컬 침투 (2 %ultracaine, 아드레날린) / (xylocaine) 마 취 수술 실 또는 이비인후과 검사의 자에 표면. 표준 계기 운영 위 소화 및 호흡 관의 구두 구멍/인 두/후 두/다른 부분에서 종양 질량 시각화 하 고, 필요한 경우, 현미경.
2. 신선한 종양 생 검 암 병 변 주변에서 무딘 또는 절단 악기 가져가 라. 때문에이 지역에 풍부한 괴 사 병 변의 중심을 하지 마십시오. 얻은 조직 isotonic 나트륨 염화 물 솔루션 무 균 용기에 넣어.
3. 생 검 후 수행 hemostasis, 예를 들어필요에 따라., 바이 폴라 또는 monopolar 응고 장치 vasoconstrictive 물질의 사용 이외에.
4. 가져 종양 생 검 인접 한 실험실으로 직접 세포 배양 실험을 위해 사용 됩니다. 다른 종양 생 검 암을 배제 하기 위해 평소 병리학 자 보내기.
5. 실험실 기술 자가 직접 표본을 처리할 준비가 있는지 확인 합니다.

2. 종양 견본 처리

1. 적합 하 고 메 마른 표면에 종양 견본을 놓고 철저 하 게 멸 균 일회용 메스와 가능한 한 작은 조각으로 그것을 잘라.
   주의: 감염 및 혈액을 매개로 질병의 상태는 잘 문서화 이며 기술자 표준 기관의 관심을 방지 하기 위해 프로토콜 바늘 막대기 또는 잠재적으로 biohazard 환자 소재 절단 부상 확인 및 가능한 부상 후 따라 프로토콜입니다.
2. 충분 한 기계적 분리의 기본 조직, 후 콜라를 포함 하는 유리병에 조직을 넣어 나 / II 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 70 µ m 팔 콘 셀 스 트레이너를 통해 체질 하십시오 그리고 행 크 스 균형 소금물 (HBSS)와 현 탁 액을 씻어.
3. 성공적인 분리 이후 세척 후에, 5% CO₂ 와 37 ° c.의 온도에 하위-confluency 성장 T75 셀 문화 플라스 (75 cm²)에 1-2 × 10⁶ 셀을 포함 하는 정지 장소 이 단계는 최대 10 일을 걸릴 수 있습니다.
   1. 다음의로 구성 된 특별 keratinocyte 문화 매체를 사용 하 여: 125 mL Dulbecco의 독수리 매체 (DMEM) Keratinocyte 보완 매체 (보완된 매체 구성 된 500 mL Keratinocyte SF 매체의 소 뇌 하 수 체의 15 mg의 250 mL 수정의 추출 (BPE), 페니실린/스, 150 ng 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF), 300mm CaCl₂의 516 µ L, 사전에 대비해 주식 혼합의 2.5 mL), F12 영양소 혼합, BPE (0.75 mL), 75 ng 재조합 인간 EGF의 10 mg의 125 mL (2 µ L) 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (자료 테이블)의 3.75 mL.

3. 낮은 접착 세포 배양 배지로 셀 시드

1. 현미경 종양 세포 성장 확인. 문화에 있는 셀의 개수 (기본 또는 세포 배양) 5000 기본 종양 세포 또는 중간 셀 라인의 1000-2000 셀 씨와 / 오목와 함께 낮은 접착 판으로 미디어 (3.2 단계.)의 200-300 µ L에서 다른 셀 라인 라운드 바닥 (96-음).
2. 1%에서 5% CO₂ 37 ° C에서와 동등한 부품 DMEM 그리고 기도 상피 세포 매체 (BEGM), 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 셀 문화 L-글루타민 (2.3 단계.). 셀 라인 사용 되 DMEM 기초 미디어 충분 하다.
   1. 미디어 변화를 매일 수행 합니다. 미디어 변경 시 피펫으로와 회전 타원 체를 발음 하지에 주의. 성장의 수준까지 문화는 spheroids로 descibed 3.3에 (약 7-10 일)에 도달.
3. 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업에 대 한 보고 현미경 자발적인 회전 타원 체 형성을 확인 합니다. 불규칙 한 또는 추가 조사에서 여러 회전 타원 체 형성 우물을 제외 합니다.
   참고: Spheroids 표시 됩니다 맨 눈으로도, 더 처리 및 아래 설명 된 대로 미디어 변화를 촉진.

4. 노출 복합 표준 또는 실험 종양 치료에 Spheroids

1. 원하는 치료 처방을 선택 합니다. 치료 spheroids 또는 spheroids만 부분 치료 regimens, 예를 들어받는 치료의 비교를 허용 하는 충분히 큰 컨트롤 그룹을 디자인 합니다. 방사선 혼자입니다. 컨트롤 그룹의 크기 그리고 실험적인 그룹 디자인에 따라 보편적으로 정의할 수 없습니다.
2. 첨가제와 함께 미디어 미디어, chemotherapeutics 및/또는 원하는 농도에서 단일 클론 항 체와 의미 미디어를 교환 합니다. 2.5/5/10 µ M 또는 5-fluoruracil (5FU) 30 µ M의 농도에서 Cisplatin를 추가 합니다.
   참고: 높은 처리량 실험 또는 큰 그룹 크기/다 수 그룹의, 하나 사용할 수 있습니다 자동된 pipetting 로봇 우리가 더 실험에서 설치 하 고 있다.
3. 또는 적합 한 방사선 시설을 사용 하 여 2 Gy에서 spheroids와 세포 배양 배지 방출.
   주의: 직원의 유해한 방사선 노출의 방지에 관한 기관의 프로토콜을 존중 합니다. 방사선 보호 지침에 따라 지정 및 훈련 된 기술자 에서만 작동 합니다. 원하는 경우, chemotherapeutics 4.2 아래 설명 된 대로 추가 합니다. 이후에.
4. 앞에서 설명한 문화 조건 (37 ° C, 3.2 단계)에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.
5. 부 화 후 미디어 변경 최소 6 일 매일 세포 배양을 계속 합니다.

5. 회전 타원 체 크기와 분석 결과 읽기에 대 한 세포질 확산의 정도 평가

1. 회전 타원 체 크기 6 일에 디지털 사진 설명서 후 지역 (10 일, 16 일) 그래픽 소프트웨어 (매개 변수 1)를 측정 합니다.
2. 접시의 2.5 분 520 x g에서 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 합니다. 1 x PBS와 접시 다시 설명, 뒤 상쾌한 (PBS)를 제거 하는 원심 분리기의 충분 한 양의 세포를 씻어.
3. 해산을 spheroids 수 있도록 각 유리병에 효소 세포 분리 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 8 분 동안 접시를 품 어
4. 성공적인 현미경 회전 타원 체의 용 해를 확인 합니다. DMEM의 100 µ L를 추가 합니다. 원심에서 520 x g 2.5 분 제거에 대 한 접시는 상쾌한 고 DMEM의 100 µ L의 세포를 중단.
5. 예를 들어 서 부 표준시-8 분석 결과 제조업체의 지침²⁵에 따라 각 유리병에 상용 색도계 확산 분석 결과 수행 합니다. 분석 결과 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 리더 (매개 변수 2)에 밖으로 읽기.

결과

우리 reproducibly 나중 Hagemann 외 에 설명 된 대로 신선한 종양 생 검에서 파생 하는 기본 인간 암 세포에서에서 독점 피 카 셀 라인을 포함 하 여 다른 셀 라인에서 먼저 단일 셀 정지에서 spheroids 생성 수 있었다 . ²⁶. 우리는 회전 타원 체 세대;에 대 한 두 가지 설립된 방법 평가 소위 교수형 되 고 두 드롭 (HD) 메서드와 매우 낮은 접착 (울 라) 메서드, ?...

토론

우리는 세포 정지, 예비 실험, 기본 인간 종양 세포에서에서 그리고 두 셀 라인에서 재현 spheroids를 생성 하는 프로토콜을 설정할 수 있었다. 우리는 먼저 앞에서 설명한 두 가지 방법으로 평가 하 고 울 라-방법, 어디 낮은 접착 표면 배양 배지는 사용 되는 방법, 일정 한 3 차원 spheroids의 생성에 대 한 안전 하 고 더 안정적인 것을 확인. 분석 결과 읽기 (크기/위치 및 세포 생존)에 대 한 두 개의 별도...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350