생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

요약

이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.

초록

잠재는 전통적으로 재조합 단백질 및 백신의 생산을 위해 사용 되었습니다. 그러나, 최근에, 잠재 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 유망한 벡터로 떠오르고 있다. 여기, 잠재 Sf9 세포의 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA (bacmid)의 과도 transfection에 의해 생산 됩니다. 원하는 볼륨을 얻을 때까지 잠재 이후에 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀에 확장 됩니다. 그것은 다음 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 표면에 뜨는 문화에서 정화. 바이러스 표면에 뜨는 잠재 봉투 당단백질에 대 한 상쾌한 덤플링의 선호도 때문에 잠재 입자를 바인딩하는 덤플링 열에 로드 됩니다. 열 오염 물질을 제거 하는 버퍼와 세척 하 고 높은 소금 버퍼 열에서 잠재는 eluted. eluate isotonic 소금 농도를 희석 하 고 잠재 입자는 더 ultracentrifugation를 사용 하 여 집중. 이 메서드를 사용 하 여 잠재 전염 성 입자의 25% 회복으로 최대 500-fold 집중 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 1 L 문화에서 생산 고는 잠재의 정화를 보여줍니다, 하지만 메서드 수 수 확장-최대 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 임상 등급 벡터를 생산 하기 위해 폐쇄 시스템 정지 문화.

서문

잠재는 lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9에서에서 백신 및 재조합 단백질의 생산을 위해 주로 사용 된다 재조합 Autographa californica multicapsid 핵 polyhedrosis 바이러스 (AcMNPV)를 사용 하 여 곤충 세포 ^{1 , 2 , 3 , 4}. 최근에, 그것은 유전자 치료 응용 프로그램⁵에 대 한 유망한 벡터로 나오고. 광범위 한 호스트 및 조직 차 있는 굴곡 운동 것으로 알려져, 무부하 및 확산 세포 감염, 비 병원 성 이며 호스트 염색체^4,,56으로 통합 하지 않습니다. 또한, 잠재 미래 임상 생산¹처리 폐쇄 시스템에 대 한 확장 가능 하 혈 청 무료 서 스 펜 션 문화에서 생산 수 있습니다.

잠재 입자의 순수성은 세포 독성^7,,89를 최소화 하면서 효과적인 변환 달성 하기 위한 중요 합니다. 잠재는 ultracentrifugation 또는 접선 교류 여과 (TFF)는 infectivity에 제한 된 영향에 의해 집중 될 수 있습니다. 그러나,이 절차는 뿐만 아니라 바이러스 입자를 집중 하지만 또한 세포 파편과 단백질 Sf9에서 문화, 독성 생체 외에서 (개인적인 관찰) 될 수 있는 염증 또는 사용 하는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있습니다 vivo에서. 이 문제를 방지, 바이러스 주식 집중 매우 사용 하는 경우에 특히 감염 잠재 정화 하 여 입자 오염에서 분리 해야 합니다.

여러 가지 방법은 정화 및 잠재 벡터^10,,1112의 농도 대 한 보고 되었습니다. 사용 가능한 접근의 덤플링을 친화성 크로마토그래피 단백질¹²오염의 낮은 농도와 정화의 한 단계 높은 수준의 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 잠재^13,14에 대 한 수용 체로 heparan 황산 염의 식별을 기반으로 합니다. 열 및 잠재의 바인딩 Sf9 셀 상쾌한 로드, 후 열 생리 (isotonic) 버퍼 언바운드 또는 바운드 느슨하게 오염 입자를 제거 하 세척 될 수 있다. 헤 파 린에 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에, 잠재 입자 삼투성 충격¹²비활성화를 방지 하기 위해 생리 (isotonic) 소금 농도를 즉시 희석 한 높은 소금 버퍼 eluted 수 있습니다. 또한,에 캡처 뿐만 아니라 잠재, 생산 및 차입 크로마토그래피 열에서 수행할 수 있습니다 현재 좋은 제조 관행 (cGMP)와 호환이 되는 폐쇄 시스템 프로세스를 사용 하 여.

여기, 우리는 제조, 정화, 및 전염 성 잠재 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 원심 분리의 농도 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 짧게, 우리 Sf9 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA와 세포의 transfection에 의해 잠재를 생산 하 고 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 전염 성 잠재 확장. 우리는 잠재 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 정화 하 고 마지막 단계로 서 ultracentrifugation를 사용 하 여 높은 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 벡터를 집중.

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프로토콜

프로토콜 요약을 그림 1 을 참조 하십시오.

1입니다. 잠재 플라스 미드 DNA의 정화

1. Baculoviral 플라스 미드 DNA (bacmid)¹⁴ 파운드 항생제; 국물의 200 ml에서를 포함 하는 세균성 문화를 성장 대 (50 µ g/mL), 항생물질 (10 µ g/mL), 그리고 gentamycin (7 µ g/mL), 300 rpm에서 궤도 통 설정에서 37 ° C에서 16 h.
2. 표준 알칼리 성 세포의 용 해 프로토콜¹⁵를 사용 하 여 세균성 문화에서 bacmid DNA를 정화 하 고 해산 테 버퍼에 bacmid.

2입니다. 잠재 생산

1. 135 rpm와 폴 리 카보 네이트 혈 청-무료 곤충 배양^1,2,3를 포함 하는 삼각 플라스 크에에서 28 ° C에서 궤도 흔드는 인큐베이터에 문화 Sf9 셀.
   참고: Sf9 세포는 냉동된 재고에서 동 하는 경우 최소 2 주 회복 하 고 성장의 지 수 단계를 입력 셀에 대 한 수 있습니다.
2. Trypan 파랑 얼룩 후 한 hemocytometer 성장 지 수 단계에서 수확 Sf9 셀을 계산 합니다. 씨앗 1 x 10⁶ 가능한 Sf9 셀 중간의 2 개 mL 6 잘 조직 문화 취급 접시에 잘 당. 셀 인큐베이터에서 28 ° C에서 1 시간에 대 한 연결을 허용 합니다.
3. 혈 청 무료 unsupplemented 그레이스의 곤충 문화 매체의 1 mL에 성장 매체를 바꿉니다.
4. 곤충 세포 transfection 시 약을 사용 하 여 Sf9 세포로 DNA bacmid transfect
   1. 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L 혼합 8 µ L 곤충 세포 transfection 시
   2. Bacmid DNA unsupplemented 곤충 매체의 100 µ L로의 2 µ g을 희석 하 고 vortexing에 의해 부드럽게 혼합.
   3. 희석된 곤충 세포 transfection 시 약 희석된 DNA를 결합 하 고 부드럽게 혼합. 실 온에서 15 ~ 30 분 동안 품 어.
   4. 셀에 dropwise DNA 지질 혼합물을 추가 합니다. 약 5 h 인큐베이터에서 28 ° C에서 품 어.
5. 셀에서 transfection 혼합물을 제거 하 고 세척 2 mL PBS의 셀.
6. 곤충 문화 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 미디어를 변경 하지 않고 문화 인큐베이터에서 28 ° C에서 진행 합니다.
   참고: 경우는 bacmid 형광 단백질을 포함, 그 식 셀 48 h 후 transfection에 검색할 수 있습니다. 잠재 transfected Sf9 세포에 의해 생산 이며 문화 매체는 이후 untransfected 세포를 감염으로 분 비 합니다. 전체 셀 인구 5 일에 잠재 감염 되 고 cytopathic 효과 라고도 하는 바이러스 성 감염의 흔적을 보여줍니다. 이러한 증가 세포 직경, 그들/과 립 세포질, 세포 성장 정지에 죽거나 lysed 세포는 세포 배양에 있습니다. 그러나, transfection 또는 감염 효율 최적 하지 않으면 문화는 분명 cytopathic 효과 표시 되지 않을 수 있습니다. Cytopathic 효과 200-400 X 배율에서 거꾸로 위상 현미경으로 구상 될 수 있다. 잠재 감염 셀 안티 gp64 항 체¹¹얼룩에 의해 감지할 수 있습니다.
7. 수확 잠재 표면에 뜨는 5 일 후 transfection 그리고 라벨 P₁ 바이러스 재고.
8. PBS에는 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 함께 어둠 속에서 빛에 민감한, 표면에 뜨는, 잠재를 저장 합니다. 또는 장기-80 ° C에서 90 일 단기 (최대) 4 ° C에서 저장 합니다.
9. 곤충 문화 매체의 10 ml에서-10cm 조직 문화 취급 접시에 종자 6 × 10⁶ Sf9 셀. 셀에 초기 잠재 표면에 뜨는 (P₁) 1 mL를 추가 합니다.
10. 잠재 표면에 뜨는 (P₂) 5^번째 하루 후 감염에서 수확.
11. 50 mL 삼각 플라스 크를 폴 리 카보 네이트는 250 mL에 곤충 문화 매체에서 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀 (3 x 10⁶ 셀/mL)와 장소는 궤도 흔드는 인큐베이터에 플라스 크의 씨. 셀에 P₂ 재고의 2 개 mL를 추가 하 고 135 rpm에서 28 ° c.의 일정 한 온도 유지 하면서 흔들어
    참고: 감염 후 3 ~ 4 일 전체 Sf9 세포 인구 cytopathic 효과, 높은 titer 잠재 생산의 표시를 보여줄 것 이다.
12. 순차적으로 증폭 하는 잠재 supernatants 원하는 볼륨 (P₃P₄,...) 얻을 때까지 각 후속 감염에 세포 배양의 50-fold 볼륨을 10 증가 시켜.
    참고: P₃ 는 감염 1 l Sf9의 500 ml는 세포 배양 감염 된 수 있습니다 표면에 뜨는; P₂ 잠재의 10 ~ 20 mL의 라운드 3^rd P₄ 에 5 ~ 10 L Sf9의 세포 배양의 P₃ 잠재 상쾌한, 100 ~ 200 mL와 함께 감염 될 수 있는 감염의 라운드 4^번째 이다. 일반적으로, Sf9 세포 3 × 10⁶ 셀/mL 혈 청-무료 곤충 문화 미디어에서에서 시드 있습니다.
13. 1000 x g 세포 파편을 제거 하 여 소화 genomic DNA와 RNA를 37 ° C에서 2 h 50 단위/mL nuclease (250 단위 / µ L 재고)와 표면에 뜨는 잠재 치료 4 ° C에서 30 분 동안에 표면에 뜨는 잠재 원심 0.45 μ m 여과 장치를 통해 supernatants 필터링.

3입니다. 크로마토그래피 시스템의 준비

1. 샘플 및 버퍼 라인 각 살 균 물, 1 N 수산화 나트륨, 물, 순차적으로 rinsing 하 여 크로마토그래피 시스템을 준비 하 고 50 mL/min의 선형 유량에 버퍼 (20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 150 m m 염화 나트륨, pH 7.0)을 세척.
2. 버퍼 (5 이력서 살 균 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 2 M 염화 나트륨, pH 7.0)을 청소 하는 열을 순차적으로 실행 하 여 준비 하는 헤 파 린 50 µ m 열 (10 × 10 cm, 7.9 mL 열 볼륨 (CV)의) 그리고 7 mL/min의 선형 흐름 속도로 이력서 워시 버퍼를 5.

4입니다. 잠재 벡터의 정화

1. 크로마토그래피 시스템을 다음과 같이 설정:
   1. 표면에 뜨는 잠재 로드 입구 포트 로드 하는 예제를 사용 합니다.
   2. 워시 버퍼를 로드 하기 위한 버퍼 입구 포트 a 1을 사용 합니다. 워시 버퍼의 적어도 500 mL 한 병 준비 고 워시 버퍼 라인 병 합니다.
   3. 버퍼 입구 포트 a 2를 사용 하 여 로드 차입 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 1.5 M 염화 나트륨, pH 8.0으로). 차입 버퍼의 적어도 500 mL 한 병을 준비 하 고 병으로 차입 버퍼 라인을 배치.
   4. 표면에 뜨는 열 통과 잠재를 수집 하는 분수 수집기, 워시 버퍼 및 eluted 잠재에 몇 50 mL 원뿔 튜브를 삽입 합니다.
2. 5 7.9 mL 열 량 (CVs) 워시 버퍼 (40 mL) 7.0 mL/min의 선형 유량에서의 헤 파 린 열 equilibrate
3. 크로마토그래피 시스템의 샘플 펌프 (입구 샘플 포트)를 사용 하 여 선형 흐름 속도 2.0 mL/min의 헤 파 린 열에 표면에 뜨는 잠재의 250 mL 로드.
4. 자외선 (UV) 흡 광도 곡선까지 2.0 mL/min의 선형 흐름 율에 헤 파 린 열 통해 10 CVs (80 mL) 워시 버퍼의 실행 (280 nm) 기준으로 돌아왔다 고 안정 된다.
5. 때 잠재 입자 덤플링 열에서 해리 4.0 mL/분 시계는 크로마에 단백질의 날카로운 차입 피크의 선형 유량에서 차입 버퍼의 5 CVs (40 mL) 7.9 mL 헤 파 린 열에서 잠재 입자 elute.
6. -차입, 즉시 eluted 잠재 상쾌한 다음 원심 분리 동안 삼투성 충격에서 잠재 입자의 비활성화를 방지 하기 위해 물에 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼를 사용 하 여 10 배 희석.
7. 분수의 각각의 100 µ L를 저장, 잠재 상쾌한, 워시 버퍼와는 eluate 로드 하는 동안 수집 열 흐름 통해 포함 한. HT1080 정화 과정 (참조 섹션 6) 평가 하에 이러한 잠재 분수를 감염.
8. 버퍼와 워시 버퍼를 청소 하는 열과 열을 청소. 마지막으로, 7.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 5 이력서 살 균 20% 에탄올에 물과 열을 린스와 4 ° c.에 저장
9. 물, 1 N 수산화 나트륨, 물로 다시와 50.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 물에 20% 에탄올 크로마토그래피 시스템을 청소 하 고 시스템 20% 에탄올에 저장.

5입니다. 잠재의 농도

1. 전 압력솥을 사용 하 여 원심 분리기 튜브 소독. 조직 문화 후드에서 각 ultracentrifuge 튜브를 표면에 뜨는 잠재의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 균형에 의해 튜브 무게를 측정 하 고 메 마른 PBS 가진 ultracentrifuge 튜브의 내용의 무게를 조정 합니다.
2. Ultracentrifuge 튜브의 각 양동이 남서 32 Ti로 터의 반대에 놓습니다.
3. 80000 × g에서 실행 하는 ultracentrifuge 4 ° c.에 90 분
4. 조직 문화 후드에서 ultracentrifuge 튜브를 열고 aseptically 잠재 펠 릿을 제거 하지 않고 액체를 발음 합니다.
5. 적극적으로 200 µ L 0.5% (w/vol) BSA 포함 하는 PBS와 아래로 pipetting으로 각 튜브의 펠 릿을 resuspend.
6. Cryovials (병 당 50 ~ 100 µ L) 집중된 잠재 전송 하 고-80 ° c.에 저장

6입니다. 잠재의 적정

1. 감염, 전날 HT1080 세포 세포 Trypan 푸른 얼룩 후 한 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다. 2 ml Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 종자 1 x 10⁵ HT1080 세포. 감염의 시간에 세포의 정확한 수를 확인할 수 씨앗 몇 가지 추가적인 우물. 37 ° C, 5% CO₂배양 기에서 세포 문화.
   참고: HT1080 세포 그들은 표현 하는 다른 셀 라인¹⁶에 비해 heparan 황산 염의 더 높은 수준으로 적정 사용 됩니다. 때문에 HT1080 세포 부착, 적정은 간단 하 고 전통적인 Sf9 기반으로 적정을 사용 하 여에 비해 적은 시간이 소요.
2. 감염의 날, 우물에서 셀을 계산 하 여 잘 당 셀의 수를 결정 합니다. 희석된 원래 잠재 되어 따로 설정 했다 열 정화, 이전 및 샘플에서 열 흐름 통해, 세척, 차입 분수를 추가 하 여 세포를 감염. 각 샘플에 대 한 희석과 실험적으로 감염 잠재 입자에 따라 볼륨을 확인 하 고 3 중에 각 잘 감염.
3. 감염 후 2 일 관심사의 유전자의 표현에 대 한 셀을 분석 합니다. 셀 경우에 그들은 형광 성 단백질 (예: GFP)¹⁷익스프레스 교류 cytometer를 사용 하 여 분석할 수 있습니다.
4. 계산 titers (전염 성 단위 mL 당) 감염, 희석 비율, 및 수식을 사용 하 여 셀에 형광 단백질의 백분율의 때에 존재 하는 셀의 수에 따라: (형광 단백질의 감염 × 비율 동안 셀 수 긍정적인 세포 × 희석 요인) / mL에 잠재의 볼륨.
   참고: 예를 들어 감염 시 잘 당 세포의 총 수는 1.2 × 10⁵, 형광 단백질의 비율 5%, 희석 비율 100, 이며 추가 희석된 잠재의 볼륨은 10 µ L는 titer 인지 6 × 10⁷ 전염 성 단위 (IU) /mL입니다.

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결과

흐름 다이어그램 (그림 1)에서 제시 하는 프로토콜이입니다. 단계는 bacmid 생산 부착 문화 접시에, 혈 청 무료 정지 문화, nuclease 치료에 원심 분리와 여과, 정화 후속 증폭에 잠재 하는 DNA와 Sf9 세포의 과도 transfection를 포함 그리고 ultracentrifugation와 농도 정화 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 다음.

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토론

여기에 제시 된 프로토콜 Sf9 셀 서 스 펜 션 문화에 잠재의 생산과 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 잠재의 정화에 설명 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 매개 변수 수익률을 극대화 하 고 잠재 감염의 비활성화를 최소화 합니다. 여기에 제공 된 프로토콜 표시 복구에 비해 잠재 입자의 크게 향상 된 복구는⁹다른 사람에 의해 달성 됩니다.

때문?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akta Avant 150	GE Healthcare	28976337	Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column	ThermoFisher Scientific	4333414	Heparin column
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	Non-catalog item	Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube	Beckman-Coulter	326823	Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator	ThermoFisher Scientific	Non-catalog item	Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks	ThermoFisher Scientific	238071	Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks	ThermoFisher Scientific	238072	Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Tissue culture treated plate
10-cm plate	ThermoFisher Scientific	08-772E	Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF	EMD-Millipore	SCHVU05RE	Filtration unit
Kanamycin	ThermoFisher Scientific	15160-054
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit	ThermoFisher Scientific	10360-014	Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell	ThermoFisher Scientific	12331-013	Competent cell for bacmid
TE buffer	In-house	Non-catalog item	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit	ThermoFisher Scientific	K2100-06	For bacmid purification
Sf9 Cells	ThermoFisher Scientific	11496-015	Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium	ThermoFisher Scientific	11605-094	Transfection medium
PBS	ThermoFisher Scientific	20012227	Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media	GE Healthcare	SH30278.02	Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA	In-house	Non-catalog item	Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II	ThermoFisher Scientific	10362	Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4737	Stabilizes Baculovirus
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	For storage of Baculovirus
HT1080 cell line	ATCC	CCL-121	Fibroblast cell line
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Growth media for cell lines
Wash buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water	In-house	Non-catalog item	For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.09137	For Akta Avant cleaning
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7073	For Akta Avant cleaning