생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

요약

여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.

초록

동물 및 식물 조직 세포의 명료한 인구로 구성 됩니다. 이러한 셀 구축 하 고 조직 유지 시간에 따라 상호 작용 하 고 질병 중단 하는 경우 발생할 수 있습니다. 과학자 들은 셀의 하위 집합에 형광 단백질을 표현 하 여 특성과 그대로 조직 내 이러한 세포의 자연 역학 조사를 영리한 기술을 개발 했습니다. 그러나, 실험 시간에 단일 셀 또는 셀 인구 방식에 때로는 조직 내의 셀의 선택 된 시각화 더 필요합니다. 하이 고 셀의 인구 내의 단일 셀을 시각화, 과학자는 형광 단백질의 단일 셀 photoconversion를 활용 하 고. 이 기법을 보여, 우리 여기 어떻게 보여 UV 빛을 지시는 그대로의 Eos 표현 셀 zebrafish 생활. 우리는 다음 그들이 어떻게 조직에 변경 확인 하 photoconverted Eos⁺ 셀 24 h 나중 이미지. 우리는 두 가지 기술을 설명: 셀 photoconversion 및 photoconversions의 세포의 인구. 이 기술은 세포 세포 상호 작용, 세포 운명 및 차별화, 그리고 셀 마이그레이션, 그건 수많은 생물학 질문에 적용 하는 기술 시각화를 사용할 수 있습니다.

서문

여러 가지 셀 구축 하 고 복잡 한 동물 및 식물 조직 유지 작용. 이 세포는 종종 삽입 하 고 조직의 고정을 필요로 하는 높은 해상도 현미경 없이 단일 세포 수준에서 이웃에서 구별 하기 어려운. 그러나, 이해 하 고 어떻게 이러한 조직 형태는 유지, 고 병 될, 그것 되었습니다 어떻게 단일 조직 내의 세포 조사 필수 상호 작용 하는 시간이 지남에. 이상적으로, 이러한 실험 정착의 요구 사항 없이 비 침략 적 방식으로 조직 내의 단일 셀의 라벨 필요 합니다. 과학자는 지금이 작업^1,2,,34를 달성 하기 위해 수많은 기술을 개발 했다.

발견과 해파리의 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구현¹조직 환경 개별 셀의 라벨에 대 한 허용 한 흥미로운 접근 했다. 셀-특정 발기인을 사용 하 여, 유전자는¹을 표시 하는 셀의 하위 집합을 선택 가능 하다.입니다. 또는, GFP의 바이러스 성 유도 식 GFP^3,4의 사용자가 선택한 식에 대 한 이용하실 수 있습니다. 꽤 유용 하지만 GFP의 유전자 중재 표현; 조직에 있는 셀의 하위 집합 내에서 사용자가 선택한 식을 허용 하지 않습니다. 바이러스 성 표현의 GFP, 유리, 수 그리고 침략. 조직 내에서 더 부족 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 Brainbow 같은 영리한 기술과 GFP 파생 상품의 출현, 그것은 단일 셀 복잡 한 조직^2, 에 그들의 사이에서 상호 작용을 시각화 수 되고있다 ^{그러나 5}., 이러한 접근 무작위 방식에서 셀 라벨. 원하는 실험 단일 셀의 시각화 또는 실험에 의해 정의 된 셀의 인구는 경우, 그들은 따라서 제한 됩니다. 이러한 실험 구분, 단일 셀 방식에서에 조작 될 수 있다 유전자 표현 형광 단백질을 것 그것은 다른 형광 비 형광 세포에서.

이 목표를 달성 하 고 단일 셀 복잡 한 살아있는 조직 내에서 세포 생물학을 시각화, 과학계에서는 고유한 형광 단백질^6,,78의 단일 셀 photoconversion을 사용 합니다. 빨간 형광 상태로 자외선에 노출 되 면 녹색에서 전환 하는 photoconvertible 단백질 (즉, eos, 단풍나무, 등)의 표현을 제어 유전자를 사용 하 여 (488 nm) 빛, 우리는 붙일 레이블에서 한 단일 셀을 구분할 수 있습니다 이웃^6,,78. 이 방법은 관심의 회절 제한 지역에 레이저 스택에서 빛을 직접 수 있는 우리의 confocal 현미경에 부착 된 기구를 이용 한다. 이 기술 우리 중 단일 셀 또는 사용자 정의 방식으로^9,,1011에 더 큰 인구 레이블을 수 있습니다. 기술은 바이러스 GFP의 단일 세포 주사에 비해 최소한 침략 적 이다. 개념의 증거로 서 우리는 우리가 신경 절 말 초 신 경계 및 척수^{9,10의 복 부 쪽에 위치한 셀 같은 photoconvert 큰 인구 내의 photoconvert 단일 셀 수 보여 11,12}. 우리 다음 그들의 운동 및 분화 발전 과정에 대 한 통찰력을 얻기 위해 이러한 photoconverted 세포 인구 24 h 나중을 시각화할 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 연구는 노 틀 담 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.

1입니다. 제 브라 견본 준비

1. 표준 절차¹³당 짝짓기 챔버로 한 성인 남자와 한 성인 여성 Tg (컨버터블 단백질)를 배치 합니다. 이 원고에서는 Tg(sox10:eos)를 물고기⁹ 액세스 하지만 photoconvertible 단백질으로 다른 유전자 변형 라인을 동등 하 게 사용 될 수 있다. 물고기 놓지 않는 경우 더 이상의 챔버를 설정 합니다. 챔버에 남아 하룻밤을 물고기 허용.
2. 다음날 아침, 100 mm 페 트리 접시에 달걀을 수집 합니다. 심사 하기 전에 24 시간 후 수정 (hpf) 성숙 계란을 허용 합니다.
3. 위의 동물 heterozygotes는 transgene에 대 한 경우, 화면 24 hpf 요리 Tg(sox10:eos) + 488 nm 광원 및 GFP 배아에 대 한 필터링 해 현미경에 세트. Tg(sox10:eos) + 배아를 분리 하 고 48 성숙 허용 hpf.
4. 바늘 또는 핀셋으로 수동으로 Dechorionate 배아
5. 준비 하 고 0.8% 낮은 녹는 포인트 agarose 용액 5 mL를 전자 렌지.
   1. Agarose 터치 멋지다, 일단 배치 3-4 마 취 안내 (sox10:eos) +48 hpf 물고기 10 m m 유리 coverslip의 센터에서 페 트리 접시 바닥.
   2. 충분히 agarose coverslip, 약 1 mL의 표면을 커버를 추가 합니다. 프로브 바늘을 사용 하 여 그들의 측면에 생선을 준비. 동물의 장착 되도록 공고히 agarose를 허용 합니다. 그것은 지속적으로 다시 정렬 하는 제 브라는 agar 굳은¹⁴까지 필요할 수 있습니다. 응고 약 2 분 걸립니다.
6. 후는 agarose는 2 분 동안 경화는, 천천히 0.02 %aminobenzoic 산 에스테 르 (Tricaine) 한 접시의 하단 표면 빠져들 때까지 접시를 포함 하는 태아 매체를 추가 합니다. 이것은 약 3 mL 이어야 한다.

2. 현미경 장착 및 사전 변환 영상

1. Confocal 소프트웨어 열고 캡처 및 초점 창 [그림 1]을 선택 합니다. 캡처 창에서 캡처 설정 드롭 다운 탭 [그림 1]에서 실험실 전용 변환 이미지 설정을 선택 합니다. 여기, 실험실 전용 설정 이라고 "물고기 이미징입니다."
2. Confocal 범위에 견본을 놓고 코스와 미세 조정 손잡이 사용 하 여 초점을 가져다 합니다.
3. 초점 창을 열고 관심 (즉 지 루트 ganglia) 원하는 영역을 찾습니다.
4. C488 레이저 필터 설정 메뉴에서 선택 합니다. 300 ms에 노출 설정, 5, 파워 레이저 고 75 [그림 2] 강화.
5. 캡처 형식 섹션에서 3D 상자를 확인 하십시오. 3D 캡처 섹션에서 현재 위치를 사용 하 여 선택 하 고 현재 주위 범위를 확인 합니다. 같은 섹션에서 35, 36, 비행기 및 1 단계 크기의 숫자 범위를 설정 합니다. 범위는 증가 하거나 이미징 영역의 깊이 맞게 감소 될 수 있습니다. 척수에 대 한 35-40 스택 사이의 범위 값은 일반적으로 충분 한 [그림 5]입니다.
6. [그림 5]의 현재 위치를 선택 합니다.
7. 클릭 이미지를 얻으려고 캡처 창의 맨 아래에서 시작 합니다.

3. 단일 셀 Photoconversion

1. Confocal 소프트웨어 열고 캡처 및 초점 창 [그림 1]을 선택 합니다. 캡처 창에서 캡처 설정 드롭 다운 탭 [그림 1]에서 실험실 전용 변환 이미지 설정을 선택 합니다. 여기, 실험실 전용 설정 이라고 "물고기 ablate 전체 칩."
2. C488 및 c541 레이저 필터 설정 메뉴에서 선택 합니다. 동일한 현미경 소프트웨어를 사용 하지 않는 경우 다른 레이저와 선택은 488 nm와 541 nm 레이저를 선택 하는 메뉴를 찾아. 300 ms에 노출 설정, 5, 파워 레이저 고 75 [그림 2] 강화. 이러한 레이저 설정은 photobleaching 또는 독성을 유발 하지 않고 충분 한 형광 신호를 생산에 따라 선택 됩니다. 독성 또는 photobleaching 시각 이다, 만약 레이저 전원 또는 노출을 줄일 수 있습니다.
3. 초점 창을 열고 초점 창에서 photomanipulation 탭을 클릭 합니다. 따라 레이저 매개 변수를 조정 합니다. 레이저 스택 전원 2로 변경 하 고 이동을 클릭 합니다. 1 래스터 블록 크기를 변경 하 고 설정을 클릭 합니다. 4를 두 번 클릭 크기를 변경 합니다. 레이저 라인 v405 변경 [그림 3].
4. 캡처 창에서 고급 캡처 설정을 엽니다. Photomanipulation 탭을 선택 하 고 2 번 반복을 변경 합니다. [그림 4] 확인을 클릭 합니다.
5. 초점 창에서 XY 탭을 선택 합니다. [그림 3, 그림 4] photomanipulation 탭에서 2 단계에서 레이저 매개 변수 확인 두 번. Photoconvert 주변 세포의 photoconversion 없이 관심의 셀 레이저 설정을 설정.
   1. Photoconversion 인접 한 셀의 경우 레이저 힘을 줄일 수 있습니다. 셀의 photoconversion 발생 하지 않으면, 레이저 능력을 늘릴 수 있습니다. 최적으로, 레이저 파워 photoconvert 관심과 하지 주변 지역에만 설정 합니다.
6. 캡처 형식아래의 timelapse 상자를 확인 하십시오. 을 클릭 [그림 6A]를 시작 합니다.
7. 일단 라이브 timelapse 창이 열리면 상단 도구 모음의 [그림 7] 원 도구를 선택
8. 셀의 centermost 지역에서 원을 그립니다. 그려진된 동그라미를 클릭 마우스 오른쪽, FRAP 지역, 선택 하 고 3 초 동안 기다립니다. 선택 된 지역 주차 될 것 [그림 8]. 캡처 중지를 클릭 합니다.
9. 개 이상의 동물을 이미징 하는 경우 다시 포커스 메뉴와 선택 위치 2에서 XY 탭으로 이동 합니다. 그런 다음 단계 4.1 4.6 반복 합니다.
10. 세포의 인구를 변환 하려면 프로토콜 및 레이저 매개 변수 관심 영역을 졸라, 선 도구를 사용 하 여 원 그리기 대신 4.1-4.4 제외 하 고 단계를 따릅니다. 관심 지역에 선을 인출 하 고 위에 나열 된 동일한 매개 변수를 사용 하 여 영역을 졸라.

4. 게시물-photoconversion 영상

1. 일단 모든 포인트 photoconverted. 실험실 관련 표준 이미지 스택 precoversion 이미징 단계 3에서에서 설명한 설정을 선택 합니다. 이 캡처 캡처 창 [그림 5]에서 드롭 다운 탭 설정에서 발견 된다.
2. C488 레이저를 선택 하 고 설정 300ms에 노출, 레이저 출력 5, 75 [그림 2] 강화.
3. C541 레이저 c488 레이저 같은 메뉴 아래를 선택 합니다. 500 ms에 노출 설정, 레이저 10, 출력 하 고 75 [그림 9] 강화.
4. 캡처 형식 섹션에서 3D 상자를 확인 하십시오. 3D 캡처 섹션에서 현재 위치를 사용 하 여 선택 하 고 현재 주위 범위를 확인 합니다. 같은 섹션에서 35, 36, 비행기 및 1 단계 크기의 숫자 범위를 설정 합니다. 범위 수 있습니다 늘리거나 원하는 이미징 깊이 [그림 5]에 맞게.
5. XY 포커스 탭에 여러 지점이 경우 캡처 창에서 멀티 목록 옵션을 선택 합니다. 그렇지 않은 경우에 현재 위치를 선택 합니다.
6. 클릭 이미지를 얻으려고 캡처 창의 맨 아래에서 시작 합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

Photoconversion 형광 단백질의 조직⁶내에서 개별 셀을 사용할 수 있습니다. 이 보여, Tg(sox10:eos) 물고기⁹ sox10의 규제 시퀀스에서 photoconvertible 단백질 Eos 표현 하 사용 되었다. 48 Tg(sox10:eos) 동물 hpf 했다 처음 탑재, 그리고 다음 발생 했을 수 있는 일반적인 photoconversion 감지 하 군데. Eos Eos photoconverted 형광 신호 작은 비전향?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

복잡 한 조직에서 다른 세포 유형 특정 도메인으로 구성합니다. 최근 기술 이러한 큰 조직 구조^1,2,3내에서 개별 셀 라벨에 이용 되어 있다. 여기 마찬가지로 단일 세포 상호 작용 및 복잡 한 조직 내의 세포 인구 상호 작용을 시각화를 활용할 수 있는 두 가지 방법을 설명 합니다. Photoconversion 기술의 장점은 분명히 셀 라벨 과학?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals			Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish	VWR	25384-302
Embryo medium			Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish	Ted Pella Inc.	14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)	Fluka analytical	A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters	Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets	3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion	405 nm laser
Slidebook software	3i
Methylene blue	Kordon