Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

요약

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

초록

유전자 조작에 특별히 크게 심장 질병 pathomechanisms 및 그들의 치료 잠재력 조사 약효. 심장 관련 유전자 배달 vivo에서 체계 또는 로컬 배달에 의해 일반적으로 이루어집니다. 꼬리 정 맥을 통해 조직의 주입은 간단 하 고 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 9 (AAV9)를 사용 하 여 심장 유전자 발현 조작에. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환에 대 한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 nontarget 기관 유전자 변환에서 발생할 수 있습니다. 여기, 우리는 간단한, 효율적, 시간 절약 방법을 intramyocardial 사출의 비보에 심장 관련 유전자 조작 생쥐에 대 한 설명. (환기) 없이 마 취, 가슴 중요 하 고 작은 근육은 퉁 명 스럽게 해 부, 그리고 마우스 심장 4 있는 공간에 작은 절 개를 통해 수동 외부화에 의해 신속 하 게 노출 되었다. 그 후, 아 데 노 바이러스 인코딩 luciferase (루크)와 비타민 D 수용 체 (VDR), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 대상으로 VDR, 심근에 해밀턴 주사기와 주입 했다. 후속 vivo에서 영상 시연 그 luciferase 성공적으로 특별히 마음에에서 overexpressed 했다. 또한, 서쪽 오 점 분석은 성공적인 overexpression 또는 마우스 마음에 VDR의 입을 확인 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 nanogels 같은 다른 물자의 주입으로 유전자 조작,이 기술을 사용할 수 있습니다.

서문

심장 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계^1,2의 주요 원인. 심근 경색, 심장 마비 등 생명이 심장 상태에 대 한 효과적인 치료 전략의 부족에는 기본 pathomechanisms의 집중 탐구와 새로운 치료 옵션³의 붐 빕니다. 이러한 과학적인 탐험에 대 한 심장 관련 유전자 조작 널리^4,5입니다. 심장 유전자 조작과 강력한 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN)를 사용 하 여 편집 하는 게놈에 의해 달성 될 수 있다 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 도구, 또는 소성 유전 물질 (예, 바이러스 벡터 관심사의 단백질을 부호화 하는 유전자를 나르는)의 전달⁶. 게놈 편집과 살아있는 생쥐에서 정확 하 고 spatiotemporal 게놈 수정 허용, 그것은 여전히 시간과 노동 집약 연습⁶. 또는, 바이러스 벡터 또는 작은 간섭 RNA (siRNA) 복잡 한 납품은 정기적으로 심장 관련 유전자 조작 수행⁶.

바이러스 벡터 배달 성인 마우스 마음에 대략 두 가지 전략에 의해 달성 된다: 조직 또는 지방 주입. Cardiotropic serotype AAVs AAV9 등의 조직의 주입은 심장 특정 유전자 조작⁷에 대 한 비 침 투. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환 및 유전자 발현에 필요한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 근육과 간⁷같은 nontarget 기관의 중요 한 변환에서 발생할 수 있습니다. 로컬 바이러스 주입 intramyocardial 주입 또는 intracoronary 배달⁷에 의해 이루어집니다. Intracoronary 납품 intramyocardial 주입에 비해 심장 내에서 바이러스의 더 동등한 배급에 지도 한다. 그러나,이 기술의 불리는 전신 순환과 nontarget 기관⁸, 그리고 작업 중 압력 측정 장치의 그 요구에 변환에 바이러스 성 벡터의 밖으로 빠른 세척. 대조적으로, intramyocardial 주입 하면 심근으로 사이트 특정 배달, 하지만 그것은 더 나은 바이러스 유지 실패 균일 하 게 배포 바이러스 성 벡터⁷. 작은 동물에 대 한 intracoronary 납품은 기술적으로 수행, 조직 AAV9 주입 intramyocardial 주입은 더 일반적으로 연습된^4,,57어렵다. 조직의 주입은 실행 하기 쉬운, 기존의 intramyocardial 주입 기계 환기 및 thoracotomy, 광범위 한 조직 손상, 원인과 많은 시간이 소요 됩니다.

이 보고서에서 우리는 intramyocardial 주입에 대 한, 시간-절약, 쉽고 효율적인 방법 설명. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase와 VDR, 또는 shRNA 대상으로 VDR, 심장 유전자 발현 조작에 주입 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 다른 재료의 사출으로 서 유전자 조작,이 메서드를 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험 실험 동물의 사용에 건강 지침의 국가 학회에 따르면 실행 했다 하 고 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 했다. (8-10 주 세) 남성 C57BL/6J 마우스는 모든 실험에 사용 되었다. 마우스는 24 ° C ± 4 ℃, 12 h 명암 주기, 물과 음식에 대 한 무료 액세스 아래에서 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.

1입니다. 아 데 노비 루스 솔루션의 준비

1. 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 도착-80 ° C 냉동 고에서 솔루션을 저장 합니다.
   참고: 아 데 노 바이러스 주입 가능한 쥐에서 수행 되었다. 아 데 노 바이러스 벡터의 무 균을 보장 하기 위해, 아 데 노 바이러스 (인코딩 luciferase, VDR, 또는 대상으로 VDR shRNA) 준비 했다 고 정화 상업적으로^9,10.
2. 작업 일에-80 ° C 냉동 고에서 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션 (3 x 10¹⁰ 플 라크 형성 단위 [pfu] /mL) 밖으로 하 고 아 데 노 바이러스 벡터 솔루션 얼음에 녹여.
3. 안 면, 멸 균 장갑, 멸 균 가운에 넣어.
4. 50 µ L를 준비 작업 전날 소독 된 해밀턴 주사기.
   참고: 살 균, 해밀턴 주사기는 거 즈에 싸서 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 배치. "고체에 대 한 살 균"의 모드를 선택 하 고 살 균 "시작" 버튼을 누르면 시작 했다.
5. 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 완전 한 녹고 후 75% 에탄올, 아 데 노 바이러스 솔루션을 포함 하는 튜브를 스프레이 하 고 층 류 살 균 후드에 아 데 노 바이러스 솔루션을 이동 합니다.
6. 층 류 살 균 후드, 30 G의 바늘의 첨부 파일 다음에 해밀턴 주사기, 바늘 없는 해밀턴 주사기를 사용 하 여 50 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 발음.
7. 30g 바늘 위쪽으로, 주사기를 누른 바늘 (바늘 끝에서 첫 번째 솔루션 상품의 외관에 의해 확인) 아 데 노 바이러스 솔루션으로 채워질 때까지 부드럽게 주사기의 플런저를 밀어.
   참고: 30g 바늘을 채우기 위해 약 45 µ L 솔루션 걸립니다 그래서 지금은 거의 없는 솔루션 주사기에 표시 됩니다.
8. 위의 준비 된 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 또 다른 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션, 발음 하 고 사용에 대 한 얼음에 느슨하게 출장된 주사기를 놓습니다.

2. 마 취와 수술 준비

1. 20 mL isoflurane isoflurane 기화 기에 추가 하 고 산소 탱크 isoflurane 기화를 연결.
2. 밸브를 열고 고 산소 isoflurane 기화 기에 산소 탱크에서 흐름. 2 L/분 isoflurane 기화 기에 산소 흐름 모니터를 통해 산소 유량을 유지 합니다.
3. 플라스틱 케이지 isoflurane 기화 기에 연결 된에서 2 분 100% 산소 (2 L/min)에서 4 %isoflurane 마우스의 마 취를 유도.
4. 플라스틱 케이지에서 마 취 마우스를 꺼내 고 층 류 살 균 후드에서 발생 하기 쉬운 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안을 코 콘을 통해 100% 산소 (2 L/min)에서 2 %isoflurane 마 취를 유지.
5. 발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.
6. 건조에서 각 막을 보호 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 크림을 적용 합니다.
7. 가슴 및 위 복 부를 면도. Depilatory 크림을 제거 하는 1 분에 대 한 면도 사이트에 상용 depilatory 크림을 적용 하 고 남은 젖은 gauzes와 모피.
8. 기반으로 요오드 액체 살 균 (예: entoiodine)의 3 스크럽으로 외과 사이트 (가슴의 왼쪽된 아래 부분)을 소독. 무 균 드 레이프와 수술 부위의 커버.

3. Intramyocardial 마우스 마음에 아 데 노 바이러스의 주입

1. 장갑에서 고 멸 균 장갑 한 켤레를 입었다.
2. 집게, 마이크로-모기 hemostat, 수술가 위를 소독 하 고 높은 작업 전에 하루에 바늘 홀더 온도/높은 압력 소독 기 (단계 1.4 참고 참조).
3. 칼과 겨드랑이 연결 하는 선 따라 0.5 cm 피부 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 가슴 주요와 집게와 마이크로-모기 hemostat 가슴 작은 근육 해 부.
4. 큰 가슴 및 가슴 작은 근육을 제거 하 여 있는 공간을 노출 합니다. 통해 피어스 하 고 마이크로-모기 hemostat로 4 번째 있는 공간 (또는 관찰 하 여 넓은 있는 공간)을 엽니다.
5. 가슴 벽의 오른쪽에 부드럽게 눌러 비 지배적인 손 검지 손가락으로 하트를 외부화 하 절 개를 향해 마음을 밀어.
6. 부드럽게 검지 손가락과 엄지손가락의 비 지배적인 손 가진 외부화 심장 보호.
7. 지배적인 손을 가진 총 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 아 데 노 바이러스 (그림 1C)로 채워진 해밀턴 주사기를 통해 3 개의 사이트 (좌 심 실의 복 부, 등, 그리고 측면 벽)에 좌 심 실 심근으로 주사.
8. 주입의 완료 후 즉시 intrathoracic 공간으로 다시 마음을 놓습니다.
9. 수동으로 부드럽게 피부 절 개 사이트 쪽으로 가슴 벽을 누르면 intrathoracic 공간에서 공기를 철수.
   참고: 성공적인 공기 피난 가슴 큰 가슴 작은 근육 퇴 학된 공기에 의해 발생의 펄 럭 여 명시 될 수 있다.
10. 수평 매트리스 5-0 비단 봉합 사로 봉합 하 여 피부를 닫습니다.
    참고: 주요 가슴 및 가슴 작은 근육 해야 하지 수 봉합, 때문에 그들은 단지 솔직 해 부 그들의 해 부 구조는 작업을 통해 그대로.

4. 수술 후 관리

1. 관리 buprenorphine (3 mg/kg) 두번 매일 작업¹¹후 첫 번째 48 h에 대 한 수술 후 통증을 줄이기 위해 피하 주사를 통해.
2. 수술 후, 완전히 복구 될 때까지 즉시 열 패드 (37 ° C)에 마우스를 유지. 그것은 완벽 하 게 복구 후 다시 감 금 소에 마우스를 놓습니다.
3. 해밀턴 주사기 사용된 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 30 G 주사기 바늘 소독 (1.4 단계 참고). 소독된 30 G 주사기 바늘은 sharps 용기에 수집 합니다.

5. 심장 Luciferase 식 측정에 대 한 Vivo에서 이미징

1. 아 데 노 바이러스 주입 후 5 일에 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)에 15 mg/mL에서 소의 신선한 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
2. Intra-peritoneally 150mg/kg 몸 무게에서 소 솔루션 깨어 쥐를 주사.
3. 이미징 시스템을 켭니다.
4. 자동 이미징 시스템의 자체 검사 후 "발광"으로 영상 모드를 선택 하 고 다음 설정을: 노출: 자동; Binning: 8; FStop: 1; 여기: 블록; 방출: 오픈.
5. 소 주사 후 10 분 chloral 하이드 레이트 주입 (300 밀리 그램/kg 체중) 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.
6. 카메라를 향해 이동 하는 가슴으로 발생 하기 쉬운 위치에 온수 이미징 단계에 마 취 쥐 보안.
7. 이미지 (1 이미지 각 마우스에 대 한)를 수집 하 고 신호 강도 가슴 주위 관심 (ROI) 동일한 원형 측정 영역을 그려서 계량.
8. 이미지의 컬렉션 후 쥐를 희생 하 고 다음 섹션에서 설명 했 듯이 조직을 수집 합니다.

6. 수확 조직

1. 다른 시간 지점에서 바이러스 주사 (그림 1B) 후, 4 %isoflurane 쥐 anesthetize 및 코 콘을 통해 2 %isoflurane 마 취를 유지 하 고 경향이 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안.
2. 앞쪽 목에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Omohyoid 및 sternocleidomastoid 근육을 제거 하 여 바로 일반적인 경 동맥을 노출 합니다.
3. 바로 일반적인 경 동맥을 transecting 하 고 혈액을 배출 하 여 쥐를 희생.
4. 복 부에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Midclavicular 라인을 따라 흉 곽의 양쪽에서 갈비뼈를 잘라내어 transect 횡 경 막.
5. 심장에 칼을 해제 하 여 노출. 오름차순 대동맥 찾아서 혈관 주위 지방 조직 제거.
6. 대동맥을 cannulate 하 고 retrogradely 30 G 바늘 4 ° C 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)의 0.5 mL 가득 1 mL 주사기에 부착 된 마음을 perfuse.
7. 관류, 후 심장, 소비 세 그리고 왼쪽 및 오른쪽 심 나눕니다. 간, 폐, 그리고 비장을 삭제할.
8. 차가운 PBS (4 ° C)에 두 세척 후 액체 질소에 극저온 튜브에 수집 된 모든 조직을 별도로 저장 합니다.

7입니다. 단백질 식의 결정

1. 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1: 100의 비율에서 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼에 추가 하 여 균질 버퍼를 준비 합니다. 샘플 처리 수의 수에 따라 총 볼륨을 계산 합니다. 이후 사용에 대 한 4 ° C에서 준비 균질 버퍼를 유지.
2. 액체 질소 탱크에서 조직을 꺼내 주세요. 조직 높은-정밀 저울 (직물의 각 조각 위한 약 60 mg)에 무게.
3. 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 조직. Microcentrifuge 튜브에 200 µ L 균질 버퍼 및 precooled 1.5 m m 강철 공 (4 ° C) 즉시 추가 합니다.
4. Precooled (4 ° C)에서 microcentrifuge 튜브 금속 홀더 연 삭 기, 자동 조직에 고 다음 설정을 사용 하 여 컴퓨터를 시작 하 여 균질을 개시: 주파수: 70hz; 시간: 120 s.
5. 균질, 후 원심 (16000 × g, 4 ° C), homogenate 하 고는 상쾌한 100 µ L 피펫으로 새로운 1.5 mL 튜브에 신중 하 게 전송 합니다.
6. 추가 로드 1: 4의 비율로 단백질 표면에 뜨는 솔루션 (5 배)를 버퍼링 하 고 5 분 동안 100 ° C에서 단백질을 변성.
7. 심장 및 기타 장기 조직에서 단백질 식 레벨은 더 서쪽 오 점 분석 (대표 결과 그림 2C 와 그림 3에 표시 됩니다)에 의해 모니터링 프로토콜에 따라 앞에서 설명한¹².

결과

실험 프로토콜 및 보고 방법에 대 한 주요 단계 중 일부는 그림 1에 표시 됩니다. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase (전진-루크)의 intramyocardial 주입 후 5 일, vivo에서 전진-뤽 주입 마우스에서 이미지 표시 했다 (그림 2A, B), 마음에 특별히 luciferase의 강력한 overexpression 서쪽 오 점 분석 (그림 2C

토론

현재 보고서가 오 외. 심근 경색 유도 하는 방법에서 수정한 심장 유전자 조작에 대 한 바이러스 성 벡터의 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 기술을 보여줍니다. ¹³ 현재, vivo에서 특성의 특정 유전자 기능 대부분 포함 녹아웃 또는 유전자 변형 쥐^3,,1415,16,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Laminar flow sterile hood	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Centrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Tissue grinding machine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizer	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isoflurane vaporizer	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS  Lumina III imaging system	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision balance	Sartorius (Göttingen, Germany)	28091873
Instruments
Eppendorf pipette (100 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000113
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020	Curved tip
Hamilton syringe	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostat	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Curved, tip width 1.3mm
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Surgical scissors	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-mL Syringe	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibody	CST (Danvers,  USA)	#2118
Anti-Luciferase antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-rabbit IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anti-VDR antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorphine	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloralic hydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic Vials	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1.8 mL
Depilatory cream	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP tube	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		Pore size 0.2 µm
Isoflurane	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Lysis buffer for western  blot	Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Without inhibitors
Ophthalmic cream	Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 silk suture	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ball	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Width 1.5 mm
Syringe needle	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 gauge
Warm mat	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW