영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

요약

지방산 영양 마커 접근, 즉, 전체 분자와 소비자 조직으로 전송으로 지방산의 동화 없이 또는 사소한 수정, 작은 토양 무척 추 동물의 지방 산 성 대사에 지식 격차에 의해 방해 된다. Isotopologue 프로 파일링 풀 영양 상호 작용 하는 귀중 한 도구로 제공 됩니다.

초록

지방산 (FAs) 식품 웹 생태에 유용한 biomarkers는 그들은 일반적으로 완전 한 분자로 동화 하 고 미성년자 또는 다른 영양 수준 사이 식이 라우팅 수 있도록 수정, 소비자 조직으로 전송 때문에. 그러나, FA 영양 마커 접근 토양 동물의 지질 대사에 한정 된 지식에 의해 아직도 방해 된다. 이 연구는 지방산 물질 대사 경로 두 개의 광범위 한 토양 Collembola, Protaphorura fimata , Heteromurus nitidus에 추적 프로그램으로 완전히 이라는 팔 미트 산 (¹³C16:0, 99 원자 %)를 사용합니다. 운명과이 전조의 대사 수정, 조사 하기 위하여 isotopologue 프로 파일링 하는 방법 제시, 단일 이온 모니터링을 사용 하는 질량 분석에 의해 수행. 또한, 업스트림 실험실 실험 먹이 추출 및 지배적인 지질 분수 (중립 지질, 인지질) 및 관련된 수식 계산의 메 틸 화 설명 되어 있습니다. Isotopologue 프로 파일링 하지만 수익률 ¹³C 전조를 분류에서 파생 된 지방산에서 전체 ¹³C 농축 않지만 isotopologues 부모 이온 (즉, FA 분자 이온의 질량 초과의 패턴 생성 M⁺) 각각의 표시 된 하나 이상의 질량 단위 (M^{+ 1}, M², M^{+ 3}, 등)에 의해 FA. 이 지식을 de novo 생 합성에 비해 완전히 소비 FA의 식이 라우팅의 비율에 결론을 수 있습니다. Isotopologue 프로 파일링은 풀 영양 상호 작용을 토양 동물에서 지방산 대사의 평가 위해 유용한 도구로 서 좋습니다.

서문

토양 등 암호 서식 지, 영양 관계 주소로 어려운 고 추가 동물군의 작은 크기에 의해 제한 됩니다. 지난 10 년간 필드 조건^1,2,3토양 동물의 먹이 전략을 정의 하기 위한 생체로 지방산의 사용에 특히 생화학 생태학, 발전을 보이고 있다. 이것은 리소스에서 지방산은 전체 분자 소비자 조직에 통합 될 수 있다는 사실에 기반, 프로세스 식이 라우팅⁴되 나. 지방산의 양도 3 영양 단계, 즉, 곰 팡이에서 Collembola⁵선 충을 통해 보고 되었습니다. 최근, 육 식 동물^6,7 여겨졌다 고 토양 음식 웹에서 영양 마커로 지방산에 대 한 첫 리뷰 게시^8,9되었습니다.

영양 상호 작용에 대 한 더 자세한 정보는 지방산 안정 동위 원소 (FA-SIP) 조사에 의해 달성 했다. ¹³C의 결정 /¹²C 비율 지방산 다이어트와 소비자에에서 돌리다 이진 링크를 관련된 탄소 흐름을 예측 하 고 지상파에 고용 되어 신선한 물, 그리고 해양 식품 거미줄^{10,11 ,,1213}. 기본 가정은 식이 라우트된 지방산 효소 프로세스; 적용 되지 않습니다. 따라서, 그들의 ¹³C 신호, 즉, ¹³C /¹²C 소비자에서 지방산의 비율은 다이어트¹에 비슷합니다. 그러나, 먹이 사슬의 ¹³C 서명의 점진적인 고갈 영양 연구^14,,1516에 FA SIP의 광범위 한 응용 프로그램을 방해 함으로써 수 중 시스템에서 보고 되었습니다. 또한, 지상파 식품 웹에서 대부분 무척 추 동물의 지질 대사에 대 한 지식을 여전히 제한 됩니다.

소비자에서 지질 물질 대사 경로의 이해 영양 마커 지방산 식품 웹 생태에 양적 탄소 흐름의 결정에 대 한 의미의 사용을 위해 필수적 이다. 이 고려해, ¹³C-isotopologue 프로 파일링, 유망한 방법은 어떤 생물 학적 시스템¹⁷, 탄소 물질 대사의 조사에 대 한 어떤에 원리를 적용할 수 있습니다. ¹³탄소 C 표시 기판, ¹³C에서 대사 네트워크의 배포의 도입에 따라 하는 것은 소비자 쇼 특정 isotopologue 배포에서에서 생성 된 대사 제품부터 추적. 이 양적 핵 대사 공명 분광학^18,19 또는 질량 분석^20,21그것의 더 높은 때문에 낮은 바이오 매스와 후자에 선호 생물 학적 샘플에 의해 평가 될 수 있다 감도입니다.

Isotopologue 프로 파일링 성공적으로 아미노산에 적용 되었으며 vivo에서 탄소 물질 대사 세균성 병원 체^17,,2223, 지방산에서 구현에 대 한 통찰력을 제공 하지만 산 뒤에 느껴 지 있다. 안정 동위 원소 표시 전조 지방산, 식이 라우팅 또는 β-산화, 토양 무척 추 동물 소비자에 통해 저하의 운명에 첫번째 상세한 분석 최근 수행한 Menzel 외. ²⁴. 여기, ¹³C 지방산 이어서 자주 토양 무척 추 동물, Collembola, 키 하위의 isotopologue 분석 분류 관 실험 방법론 기본 제공 됩니다. 이 microarthropods는 좋은 모델 그들은 중요 한 구성 요소는 잘 그들의 영양 마커 지방산^8,25에 대 한 조사를 하 고 토양 먹이 그물의 형성.

소비자에서 지질 물질 대사 경로의 이해 영양 마커 지방산 식품 웹 생태에 양적 탄소 흐름의 결정에 대 한 의미의 사용을 위해 필수적 이다. 현재 프로토콜 먹이 실험, 그리고 추출 및 지배적인 지질 분수 (중립 지질, 인지질)의 메 틸 화에 대 한 생 화 확 적인 절차 Collembola에서 실험실을 위한 설계 및 설정 제공 합니다. 그것은 isotopologue 구성 지방산의 질량 분석에 의해 분석 되는 방법을 보여 줍니다 고 관련된 수식 및 계산에 설명 합니다. 이 절차에서 결과: isotopologues 초과 하나 이상 (즉, 지방산 분자 이온 M⁺) 부모 이온의 질량의 비율 (i) 질량 단위 (M^{+ 1}, M², M^{+ 3}, 등) 및 (ii) 전체 ¹³ C 농축 지방산에서 ¹³C 이라는 전조에서 파생. 이 방법은 일반적으로 이들은 성공적인 레이블 통풍 관을 위해 제어 된 조건 하에서 충분 한 수량에 culturable 및 후속 전제에 다른 어떤 약탈자 먹이 상호 작용에 적용할 수 있습니다 Collembola 사용, 비록 확인입니다.

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프로토콜

설명된 프로토콜 동물 윤리의 경쟁력에서 떨어지지 않습니다. 그러나 때 사람들이 더 높은 동물 설명된 프로토콜 적응, 주의 기관 동물 윤리 위원회 동물 처리에 대 한 프로토콜을 승인 했다.

1입니다. 동물의 경작

참고: 모든 확고 프로토콜^26,,2728를 기반으로하는 실험 단계 설명 했다. Biotests 실험실에서 쉽게 culturable 생물의 지속적인 공급을 해야합니다. 여기, Collembola 종 Protaphorura fimata (Gisin, 1952)와 Hetermurus nitidus (템플턴, 1835) 사용 되었습니다. 두 종의 하 생산적인 실험실 문화 베이커의 효 모와 먹이로 유지 하기 위해 수 있습니다.

1. 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 microcosms에 (지름 7 c m, 높이 4.5 c m), 활성 탄, 석고의 혼합물을 추가 하 고 매우 습 한 사육 기판 (그림 1A) 제공을 증류수.
   1. 때 충분 한 기질, 예를 들어, 10 microcosms 일괄 처리에 대 한 microcosms 믹스를 준비. 석고 (225 g)의 혼합 9 부분과 건조 활성 탄 (25 g) 함께 석고 냄비에 1 일부 증류수 (250 mL)의 신중 하 게 약 10 개 부분을 추가 하 고 실 온에서 교 반 없이 5 분 동안 앉아 있게.
   2. 시계 방향으로 두꺼운 짙은 일관성 달성 될 때까지 공기 방울을 피하기 위해 적당 한 속도로 실험실 스푼으로 저 어. 즉시 microcosms 약 1 ㎝의 높이에 붓으십시오.
   3. 벤치에 두 드려서 부드럽고 소용돌이 여 석고를 부드럽게. 참고 구멍 (기포의 무작위 제품) 및 고 랑 (적극적으로 메 마른 주걱으로 추가) 산란 거기 비옥한 Collembola을 장려 수 있습니다. 이 연구는 구멍과 같은 재현할 조건 데 찬성 랑 피 했다. 그러나, 시연을 위해 그림 1B 는 일부 구멍을 선물 한다.
   4. 실내 온도;에 약 1-2 일 건조 허용 60 ° C에 외피는 1-2 h 그 시간을 줄일 수 있습니다.
   5. 기판은 약간 젖은 때까지 피 펫을 수돗물을 추가 하 여 사용 하기 전에 microcosms 축. 소 우주 Collembola 부드러운 표 피 있고 건조 쉽습니다 정기적으로 증류수를 추가 하 여 촉촉한 유지.
2. 쉽게 간단한 흡입 관, 즉, 약 25 cm 긴 실리콘 튜브를 사용 하 여 석고 베이스 Collembola 전송 튜브에 동물의 흡입을 방지 하기 위해 작은 메쉬 장착 피 펫 팁으로 오래. 또는, 작은 브러쉬 bristles에 준수 하도록 함으로써 동물을 전송.
3. (단계 1.2 참조) 전송 30 갓 Collembola 새로운 microcosms로 부 화 하 고과 립된 건조 베이커의 효 모 (칼 끝)에 대 한 음식 제공 (그림 1B); 일주일에 두 번 이상 갱신. 계획 3 독립적인 샘플링 하루; 복제 두 일 0-7과 14. 어둠 속에서 15 ° C에서 품 어. 일정 한 온도 필수 유지, 지방산으로는 변경 막 유동성에 대 한 요구 사항에 맞게 동물 물질 대사에 의하여.
4. 균질 ¹³C를 노출 실험을 시작 하기 전에 4 주 동안 Collembola 베이커의 효 모와 피드 /¹²C 신호 및 지방산에서 패턴. 흡입 튜브 또는 브러쉬를 사용 하 여 모든 계란 (그림 1C), 찌 끼 펠 릿을 제거 하 고 exuviae 정기적으로 동물 수에 대 한 피드 그들 그로 인하여 그들의 지질 프로 파일을 변경.

그림 1: Collembola의. (A) 소 사육 기판, 석고, 활성 탄 및 증류수의 말린된 혼합 가득. (B)와 (C) Protaphorura fimata 문화;의 대표적인 표본 참고 건조 베이커의 효 모 사용 음식 근원으로 또한 번 식 기판 (검은색 화살표)에 구멍으로 작은 너 겟 (B) 두 계란 (흰색 화살표) 뿐만 아니라 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 라벨 다이어트, 수확, 그리고 샘플 처리

1. 라벨
   1. Collembola 문화를 설정한 후 4 주는 30 명의 새로운 microcosms 놓고 어둠 속에서 15 ° C에서 품 어.
   2. 베이커의 효 모는 전적으로 ¹³C 라는 팔 미트 산 (¹³C16:0, 99 원자 %)는 비율 0.5:1, 예를 들어, 5 g에 주걱으로 ¹³C 라는 팔 미트 산 베이커의 효 모와 혼합 하 여 포함 된 그들을 먹이로 펄스 레이블 소개 ¹³ C16:0와 10 g 베이커의 효 모 건조. 각 축소판에 칼 팁에 대 한 놓습니다.
   3. 6 h 후 완전히 레이블이 베이커의 누 룩과 식품 표시이 대체 합니다.
2. 더 재배
   1. 실험의 과정에서 효 모 다이어트 3 일 마다 갱신 그리고 Collembola 그 기간 내에 소비 무엇 보다 높은 금액을 추가. 가장 중요 한 것은, Collembolan 계란, 찌 끼 펠 릿 및 exuviae 제공 된 음식에 동물에 의해 독점 공급을 보장 하기 위해 정기적으로 제거 하는 흡입 관 또는 브러시 사용 합니다.
3. 수확
   1. 7 일까지 매일 안전 microcosms 샘플 14 일에 각 샘플링 시간;에 3 개의 독립적인 복제를 수집 다른 샘플링 시간 수 있습니다.
   2. 테 플 론 코팅 나사 모자, 각 샘플에 대 한 하나를 갖춘 10 mL 유리 튜브를 준비 합니다. 미리 유리 세탁기에이 관을 청소 하 고 이후에 이온된 수로 두 번 씻어. 마지막으로, 소수 성의 모든 흔적을 제거 하려면 오염 물질 세척 두 번 클로 프롬 (HPLC 학년)의 2 개 mL를 추가 하 여 소용돌이 약 및 용 매를 삭제.
   3. 컨트롤 샘플 (0 일) 하루 0 샘플으로 사전 문화에서 3 30 비공개 Collembola 걸릴.
   4. 노출 된 샘플에 대 한 (1 일 및 이후), 걸릴 각 사례 3 30에에서 매일 샘플 문화에서 판매인 Collembola을 노출 ¹³C 라는 팔 미트 산 베이커의 누 룩의 믹스와 함께 먹이.
   5. 울트라-중량에 의해 Collembola 신선한 체중을 기록 합니다. 동물 배기 또는 적절 한 규모-팬을 브러시를 사용 하 여 전송 합니다. 에 무게의 규모-팬, 충격-멋진 동물 (2 h-80 ° C) 전에 동안 Collembola의 쉬운 취급을 보장 합니다. 또는, 10 분 CO₂ 스트림 수 있습니다 안전 하 게 동물을 기 절.
4. 직접 후 무게 넣어 동물 규모 팬에서 신중 하 게 10 mL 유리 시험관에. 관을 분석까지 메탄올 (HPLC 등급) 및 저장소-20 ° C에서의 1 mL에 채우십시오.
   참고:이 단계 이후부터 피하기 위해 유기 용 매 관련; 플라스틱 장비와 샘플 처리 대신 디스펜서와 유리 용기로 용 매에 대 한 적합 한 펫을 사용 합니다.

3. 동물 조직 및 Methanolysis 지질 추출

1. 3 유리 테스트-튜브 (테 플 론 코팅 스크류 캡 장착) 빈 값으로 메탄올의만 1 mL를 포함 하는 일괄 처리 당을 준비 합니다. 중요 한 것은, 또는 추가 유리 펫 이나 씻어 서 클로 프롬/메탄올 용 매 저항 분배기에 의해서만이 프로토콜에 사용 된 용 매를 전송 합니다.
2. 지질 추출 과정의 시작 부분에 저장 (또는 블랭킹) 증발;에 의해 적용 된 메탄올 감소 소형 벤치탑 회전 진공 집중 장치 (RVC) 진공 펌프와 콜드 트랩을 갖춘 것이 좋습니다. 오픈 튜브는 RVC에 전송 하 고 20 분 200 hPa의 50 ° C와 진공 압력에 드라이까지 증발.
3. 각 샘플 (공백 포함)를 단상 추출 용 매 (chloroform/methanol/0.05 M 인산 염 버퍼 1:2:0.8, pH 7.4)의 5 mL을 추가 하 고 흔들어 하룻밤 실 온에서 Collembolan 지질을 추출 (~ 200 rpm).
4. 새로운 튜브에 용 매를 전송 하 고 다시는 추가 2.5 mL 추출 용 매를 가진 3 h 동안 흔들어 하 여 샘플을 추출. 그 후, 두 단계; 추출 물 결합 유리 펫 파스퇴르를 사용 하 여 것이 좋습니다. 0.8 mL와 증류수, 0.8 mL 클로 프롬의 추가 다음 믹스 하 고 5 분 동안 20 ° C에서 2000 g에서 원심. 마지막으로, 수성의 분리에 대 일 분 동안 서 서 클로 프롬을 샘플을 수 있도록 단계.
5. 지방산 패턴 분석에 대 한 중립 지질, glycolipid, 그리고 인지질 분수 Collembola의 총 세포 지질을 나눕니다.
   1. 각 샘플에 대 한 준비는 실리 카 산 열 (0.5 g silicic 산, 메쉬 상업 열 100-200 µ m 크기, 테이블의 자료를 참조)의 클로 프롬 (늘어진) 1 mL를 추가 하 여. 이 과정을 속도를, 일반적으로 고체 상 추출 크로마토그래피에서 사용 하는 진공 블록에 열을 탑재 합니다. 나일론 바늘;를 사용 하지 마십시오 튜브 위에 스테인레스 스틸을 사용 합니다.
   2. 클로 프롬 늘어진 사용 후는 통과 열 전송 완전 한 낮은 클로 프롬 단계 각 샘플의 개별 열에. 이 절차를 단순화 하기 위해 위 수성 단계를 미리 제거할 수 있습니다. 그러나 유리의 파스퇴르 펫을 사용 하 여, 열 밖으로 건조 하지 마십시오 주의.
   3. 연속적으로 지질 분수 (포함 중립 지질 지방산, NLFAs), 클로 프롬의 5 mL와 10 mL의 아세톤 (glycolipids-이 프로젝트에서 분석 되지)와 메탄올 (를 포함 하 여 인지질 지방산, PLFAs)의 5 mL elute. 개별 유리 용기에 각 분수를 수집 합니다.
   4. 추출의 끝에, 클로 프롬 (NLFAs)과 RVC에 증발을 통해 메탄올 (PLFAs)을 줄일 수 있습니다. 오픈 튜브는 RVC 전송과 증발, 건조까지 ~ 60 ° C 및 24 hPa의 진공에서 90 분.
6. 지질 (NLFA 및 PLFA 분수) 웰 치 (1991)²⁹ (수산화 나트륨의 45 g, 메탄올, 150 mL와 증류수 150ml) 수산화 나트륨-메탄올 솔루션의 1 mL의 추가에서 프로토콜을 다음의 비 누화를 시작 하 고 100에 품 어 물 욕조에 30 분 동안 ° C. 2 분 동안 얼음 물에 샘플을 냉각 다음 샘플 다시 벤치에 넣고 실 온에서 작업을 계속.
7. 공란을 포함 하 여 각 샘플에는 내부 표준을 추가 합니다. 지방 산 성 실험 생물; 없는 일반적인 선택 또한 포화 지방산을 사용 하 여 분열 하 여 손실을 최소화 하 고 중간 체인 길이와 분자를 선택. 다양 한 용도로, 홀수 nonadecanoic 산 (19:0) 작품 잘. 그래서, isooctane에서 0.74 m m 솔루션의 30 µ L를 추가 합니다. 정확한 수량은 매우 중요 한-는 중량으로 피 펫의 정밀도 사전에 확인 해야 합니다.
8. 2 분 동안 얼음에 급속 하 게 물 욕조에 멋진 10 분 동안 80 ° C에서 품 어, 염 산-메탄올 (메탄올의 275 mL와 6.0 N 염 산의 325 mL 혼합)의 2 개 mL를 추가 합니다. 이 단계는 시간과 온도 민감한; 함께 사용 하 여 80 ± 1 ° C와 10 ± 1 분 확인 얼마나 많은 샘플 수 물 목욕으로가 서 한 번에 80 ° c.를 유지
   참고:이 절차는 지방산 메 틸 에스테 르 (FAMEs), 증발 가스 크로마토그래피에 대 한 안정 즉, 지방산 analytes에에서 발생 합니다.
9. 마지막으로, 1.25 mL의 헥 산/메 틸 제 3 부 틸 에테르 (1:1)를 추가 하 고 부드럽게 10 분 후 5 분에 대 한 2000 g에서 원심 분리기에 대 한 바위 아래 단계 및 계속 최고 단계 FAMEs;의 구성 제거 유리 펫 파스퇴르를 사용 합니다. 세척 단계에 대 한 수성 수산화 나트륨 (NaOH 900 mL의 증류수에 용 해의 10.8 g)의 3 mL를 추가 합니다.
   1. 록 하 고 다시 원심 분리기입니다.
10. 받아 완전 한 위 포함 하는 지질 단계 유리 파스퇴르 피 펫 및 전송 테 플 론 심장 장착 된 가스 크로마토그래피 샘플 유리병을 사용 하 여. 이 GC 측정에 문제가 발생할 것입니다 수성 단계의 작은 금액을 포함 하지 마십시오. 유리병을 캡슐화 하 고 분석까지-20 ° C에서 저장.

4. GC-FID, 지방산의 정량화

1. 가스 착 색 인쇄기를 사용 하 여 식별 하 고 지질 Collembola (동물)의 NFLA 및 PLFA 분수에 FAMEs 계량. 가스 크로마 토 그래프 (GC) 불꽃 이온화 검출기 (FID)를 갖추고 설립 및 검증 된 장비³⁰입니다.
2. FAMEs의 식별을 위해 명성 표준에 그 샘플에 봉우리의 보존 기간을 비교 합니다. 이들은 키 FAMEs 식품과 생물의 다양 한 취재의 질적 또는 양적 표준 혼합입니다.
3. 조사 유기 체 그룹 및 실험적인 다이어트에 대 한 대표 FAs 구성 된 명성 표준 혼합물을 사용 합니다. Collembola에서 이들은 진핵생물, 예를 들면, 아라키 돈 산 (20:4ω6) 같은 긴 사슬 불포화 지방산 지방산 특성. 다이어트로 누 룩을 사용 하는 경우 이들은 linoleic 산 (18:2ω6) 등 곰 팡이 마커입니다. 좋은 선택 37 다른 지방산 자주 동물, 곰 팡이에 구성 된 소위 명성 혼합 이며 식물 소재, 그리고 세균 산 메 틸 에스테 르 (BAME) 혼합 ( 재료의 표참조).
4. GC-FID에는 샘플을 실행 하려면 해당 소프트웨어 악기의 순서를 설정 합니다. 자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오. 시퀀스는 외부 표준 혼합물 (예: 명성 및 BAME 믹스), 뒤에 샘플으로 시작 합니다. Note는 보존 시간 변화, 즉, 약간의 지연이 GC 열 샘플을 실행 하는 동안 각각의 실행에서에서 지방산의 차입 시간에! 또한 모든 10^번째 샘플 시퀀스에서 실행 하거나 팔 미트 산 (16:0)에 대 한 잠금 보유 시간을 사용 하 여 표준 포함.
5. GC 설정 악기에 적응. 다음 프로그램은 고성능 (HP) 모 세관 칼럼에 대 한 제안 (25 m x 0.2 m m 아이디, 두께 0.33 µ m. 설정된 주입 양 splitless 모드에서 1 µ L 필름 및 캐리어 가스로 수소를 사용. (1 분 동안 개최) 50 ° C에서 온도 프로그램 시작 및 25 ° C min^-1 230 ° C (5.7 분 개최) 3 ° C min^-1 다음 175 ° C 증가 사용 합니다.
6. 다음 수식을 사용 하 여 각 지방산에 대 한 알려진된 금액 적용 각 명성 FID에 의해 얻은 응답을 사용 하 여 생물의 그램 신선한 (건조) 중 당 nmol 지방산 계산.
   
   _명성: 샘플에 각각 명성의 피크 면적
   MW_FM: µ g/µ에 해당 명성의 분자량
   C: µ g에 내부 표준의 농도
   _IS: 내부 표준의 피크 면적
   m_열: 신선한 (건조) 중량 g에서 각각 Collembola 샘플의
   1000: nmol µ에서 변환 요소
   c_BW: nmol에 해당 하는 빈 값의 평균에 각각 명성의 농도

5. Isotopologue 프로 파일링 하 여 ¹³C 분석

1. GC 시스템을 결합 하는 대량 선택적인 검출기 (MS) isotopologue 결정에 대 한 전자 이온화 (EI) 소스와 함께 제공 된 사용 합니다.
   1. 극 지 모 세관 칼럼 (예를 들어, DB 23, CP 실 88)를 사용 하 여이 추가 이중 결합의 동일한 번호와 함께 불포화 지방산의 분리 수 있습니다. GC 열의 선택이 결정 하는 지방산 분자 이온의 좋은 표현으로 결과 대 한 중요 합니다.
   2. DB 23 열 (60 m x 0.25 m m 아이디, 필름 두께 0.15 µ m), 130 ° C에 오븐 온도 시작 하 고 170 ° c 6.5 ° C/min으로 증가 203 ° C에 3 ° C/min의 증가 함께 따르고 1.9 분 230 ° C에 40 ° C/min의 증가 함께 따라 누르고 8.3 분 설정된 전송 선 온도 280 ° c.에 대 한 개최 다시, GC 메서드는 악기를 조정 합니다.
   3. 구성 된 알려진된 양의 FAMEs 모든 지방산에 대 한 양적 기준 ¹³C 법인에 대 한 조사를 사용 합니다. 시작 및 실행 하는 각 샘플 시퀀스의 끝에 이러한 표준을 넣어. 이러한 기준에서 지방산의 정체 시간을 가져가 라.
   4. 항상 레이블이 없는 샘플 이라는 프로브로 시작 하는 그 후 실험에서 샘플을 측정 합니다. 샘플 농도, 예를 들면 1:12.5.If 악기에 대 한 사용할 수 있는 적절 한 분할 비율을 적용, 나머지 analytes에서 열을 삭제 하려면 실행 하는 각 샘플 뒤 헬륨으로 backflush를 적용 합니다.
   5. SIM 수집 이동에서 고통을 하지 않습니다 고 재현성 분석 보존 시간 되도록 GC-MS 메서드를 잠금 하는 보존 기간을 적용 합니다.
2. GC/EI-MS 선택 된 이온 감시 (SIM) 악기의 모드를 사용 하 여 지방산의 분자 이온에서 ¹³C 설립을 결정 합니다. 시뮬레이션 모드에서 동작 전체 스캔 모드 기준으로 감도 증가와 특정 analytes를 감지 수 있습니다.
   1. 처음 이란 존재를 초기 스캔을 실행 하 고 적절 한 이온에 SIM를 실행 합니다. 각 지방산의 크로마 피크 시간 포괄 m/z 스캔 창 (SIM 그룹)을 선택 하 여 관심의 분자 질량에서 데이터를 취득. 일반적으로, 분석 및 시간 창 당 2 ~ 4 이온을 모니터링 합니다.
   2. 감도 증가 하기 위하여 대량 스캔 속도 조정 하 고 (시간 각 질량 보고) 시간 머물러. 최고의 품질 데이터 최저 가능한 속도로 얻을 수 있습니다 및 일반적으로 SIM에 규칙 끝났습니다 8 ~ 12 스캔 분석 피크. 악기 설정에 대 한 프록시는 9 ms의 질량 당는 평균 유지 시간 6의 주기 시간 s와 175 ms cyle^-1의 검색 시간.
   3. 각 지방산 (M^{+ 1}M^{+ 2} , 등등)의 모든 isotopologues의 분자 이온 (⁺M)를 감지 합니다. 예 대표 결과 참조 하십시오.
   4. 각 이온 조각 (isotopologue)의 풍부를 기록 합니다. 정량화의 품질과 풍부한 분자 이온과 그 isotopologues은 상대적으로 낮은 크게 MS 시스템의 성능에 따라 다릅니다. 큰 샘플 시퀀스 (실험)를 시작 하기 전에 노래를 실행 하 고 필요한 경우 이온 소스를 청소.
      참고: 첫째, 이러한 데이터를 얻을 전체 ¹³소비 전조 (여기 16:0)에 의해 각 지방산의 C 풍부.
   5. 그들의 잠복된 대응 이라는 지방산의 동위 원소 구성의 비율을 사용 하 여 영양 탄소 플럭스를 할당. 6.1 단계에서 원자 % 수식을 사용 하 여 각 지방산에서 이라는 탄소 (원자 %, 원자 %)의 비율을 계산. ¹³C 레이블이 없는 동물 (0 일) 이라는 (하루 1 이상) 사이 Collembola의 지방산의 비율을 비교 하 여 소비자에 ¹³C 다이어트에서의 흐름에 대 한 상대적인 표시로.
   6. 지방산 사슬에 ¹³C 법인의 위치를 지정 합니다. 분포에 따라는 isotopologues 풀 전체 표시 추적 지방산 (여기 16:0)의 식이 라우팅 체인 신장에서 지질 물질 대사에 의하여. M^{+ 15}, M¹⁶, ¹³C의 사용에 의해 체인 신장과 C2 표시 전체 마커 분자의 동화 isotopologues 부모 이온 (⁺M), 예를 들면에 가장 풍부 하 게 증가 하는 동안 조각 (¹³C 아 세 틸 coa) 분자 이온 가까이 isotopologues 좀 더 자주.

6. ¹³C 농축의 계산

1. isotopologues의 분포에 따라 다음 관계를 사용 하 여 각 지방산에서 이라는 탄소 (원자 %)에서 전반적인 백분율 계산: 원자 % (비율 ¹³C isotopologue 통합) = (주파수 x 각각 isotopologue)
   Kuppardt 외. 후 계산 됩니다. ³¹ 로:
   여기서 N 은 지방산, 탄소 원자의 수 J ¹³C 동위의 수, _{M + J} 는 각각 isotopologue 및 _T 모든 isotopologues 총 풍부한 풍부.
2. 계산, 합계 피크 지역 값 각각 FA 및 모든 isotopologues (M^{+ 1}, M^{+ 2}및 등)의 분자 이온 (⁺M)의 SIM-MS 분석, 감지 하 고 관계 되는 풍부 100%로 설정. 각 검색 된 isotopologue의 부분은 쉽게 3의 규칙에 따라 계산 합니다.
3. 비 셔 서 하루 0 컨트롤 값을 (자연 ¹³C 배경) 수행 외부 ¹³C 라벨만 다시 추적 하는 최종 데이터를 얻기 위해 실험 값에서 뺍니다.

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결과

Collembola의 신선한 무게와 지질 콘텐츠
설명된 실험 과정에서 NLFAs 및 PLFAs의 내용을 변화 하지 않았다 크게 시간이 지남에, 표본의 신선한 무게 하지 크게²⁴하지만 약간 증가 하는 반면. 두 매개 변수 Collembola 표본의 체력의 좋은 수준을 나타냅니다. 지방산 및 동위 원소 분석을 위한 샘플링 일에 해당 하는 실험을 통해 Collembola의 신선한 무게...

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토론

Isotopologue 프로 파일링

FAs에 ¹³C 유통에서 양적 측면의 상세한 분석 탄소 음식 거미줄에 분할 할당을 최첨단 기술이 필요로 한다. 현재 작업 고용 ¹³C를 평가 하기 위해 프로 파일링 isotopologue / 트로픽 상호 작용에 대 한 일반적인 FA biomarkers에¹²C 비율. 이 방법은 액체 크로마토그래피 (LC-MS)에 의해 아미노산 분석을 위해 잘 설립 이며, 병원 성 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
neoLab-Round jars	neoLab	2-1506	69 x 40 mm, 10 pacs/pack
Charcoal activated	Carl Roth	X865.1	p.a., powder, CAS No. 7440-44-0
Alabaster Dental	RÖHRICH-GIPSE	---	http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php
Chloroform	Carl Roth	7331.1	HPLC ≥ 99,9 %
Methanol	Carl Roth	P717.1	HPLC ≥ 99,9 %
Hexan	Carl Roth	7339.1	HPLC ≥ 98 %
tert-Butyl methyl ether (MTBE)	Carl Roth	T175.1	HPLC ≥ 99,5 %
Aceton	Carl Roth	7328.2	HPLC ≥ 99,9 %
NaOH	Carl Roth	6771.1	p.a. ≥99 %, in pellets
di-Natriumhydrogenphosphat	Carl Roth	P030.1	p.a. ≥99 % , water free
Na-dihydrogenphosphat Dihydrat	Carl Roth	T879.1	p.a. ≥99 %
Hypochloric acid (6 N)	VWR International	26,115,000	AVS TITRINORM vol. solution
Bond Elut (Columns)	Agilent Tech.	14102037	HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK
Präparatengläser Duran	Glasgerätebau Ochs	135215	Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket
Supelco 37 Component FAME Mix	Sigma-Aldrich	47885-U Supelco	10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard
FlowMesh	Carl Roth	2796.1	Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing
Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix	Sigma-Aldrich	47080-U Supelco	10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard
Methyl nonadecanoate	Sigma-Aldrich	74208	analytical standard ≥ 98.0 %
Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic)	Larodan Fine Chemicals	78-1600	GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %)
RVC 2-25 CDplus	Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen		Compact benchtop midi concentrator
Alpha 2-4 LDplus	Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen		Drying manifold
MZ 2C NT	Vacuubrand GMBH		Vacuum pump
Roto-Shake Genie	Scientific Industries		Combined rocking and rotating device
XP64 Micro Comparator	Mettler Toledo		Super high precision balance
GC-System 7890A	Agilent Tech.		Gas chromatograph
7000 GC/MS Triple Quad	Agilent Tech.		Triple Quad mass spectrometer
7683B Series Injector	Agilent Tech.		Sample injector
Heraeus Multifuge 3SR+	Thermo Scientific		Centrifuge with 10 ml tube rotor