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요약

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

초록

모 수석 신경의 분기 예측 이며 수지상 형태학 반영 시 냅 스 조직 신경 시스템의 개발. 초파리 애벌레 신경 돌기 arborization (다) 공부 morphogenesis dendrites 신경 및 신경 시스템의 개발에 유전자 기능에 대 한 이상적인 모델입니다. Da 뉴런의 4 개의 클래스가 있습니다. 클래스 IV는 거의 전체 면적 애벌레 몸 벽의 분기 패턴으로 가장 복잡 한입니다. 우리는 이전 클래스 IV 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC) 4 개의 매개 변수를 사용 하 여 SOX5 의 초파리 ortholog 침묵의 효과 특징: dendrites의 길이, 모 수석 검사의 표면적은 지점과 분기 구조의 총 수입니다. 이 프로토콜의 NDAC 정량 분석, 애벌레 해 부, confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 절차 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 구성 된 워크플로 제공 합니다. 다 신경 개발 및 그것의 근본적인 메커니즘에 더 통찰력 신경 기능에 대 한 이해를 개선 하 고 신경의 근본적인 원인에 대 한 단서를 제공 및 neurodevelopmental 장애.

서문

모 수석 신경의 분기 예상치는 다른 뉴런1,2에서 신경의 감각 및 시 냅 시스 입력을 포함 하는 필드를 커버. Dendrites 시 냅 스 형성의 중요 한 요소 이며, 시 냅 시스 입력의 통합 신경에 전기 자극을 전파에 중요 한 역할. 수지상 arborization (다)는 신경 형성 새로운 수지상 나무와 가지를 새로운 시 냅 스를 만드는 과정 이다. 개발 및 다 지점 밀도 및 그룹화 패턴 등의 형태 다단계 생물학 과정에서 발생 하 고 매우 신경 기능에 상관. 이 프로토콜의 목표 arborization 복잡 한 신경 dendritric의 정량 분석에 대 한 메서드를 제공 하는 초파리.

모 수석의 복잡 시 냅 스 종류, 연결 및 파트너 뉴런에서 입력을 결정합니다. 분기 패턴 및 모 수석의 밀도 수지상 필드3,4에 수렴 하는 신호 처리에서 포함 된다. 모 수석 개발 조정에 대 한 유연성 있습니다. 예를 들어, 발달 단계 somatosensory 신경 및 성숙한 신 경계5모 수석 조직에 영향이 있다 시 냅 스 신호. 신경 연결의 설립 morphogenesis 및 모 수석의 성숙에 의존합니다. 모 수석의 기형 장애 신경 기능으로 연결 됩니다. 연구 다 신경 morphogenesis의 이상은 여러 신경 퇴행 성 질병, Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 게 릭 병의 etiologies에 기여할 수 있습니다 / 루 경화 증 (ALS)6,,78. 시 냅 스 변경 감소와 장애 신경 기능7,8의 콘서트에서 광고의 초기 단계에 나타납니다. 그러나, 모 수석 병리학이 신경 퇴행 성 질환 병 인에 기여 하는 방법의 구체적인 애매 남아 있습니다.

모 수석의 개발은 레 귤 레이 터, 단백질9,10, 녹음 방송 요인과 세포 표면 수용 체11,12에 ligands의 Wnt 제품군 등의 복잡 한 네트워크 부호화 하는 유전자에 의해 규제 . 4 클래스 (클래스 I, II III, IV), 클래스 4의 다 신경 가장 복잡 한 분기 패턴을가지고 더 나은 이해 morphogenesis13, 강력한 실험 시스템으로 고용 되어 이루어져 초파리 다 신경 14. 초기 morphogenesis 동안 overexpression 및 RNAi 클래스 IV 다 신경 세포에서 유전자의 입을 분기 패턴 및 모 수석 정리13변경 될. 그것은 신경 돌기 arborization의 정량 분석을 위한 실용적인 방법을 개발 해야 합니다.

우리는 이전을 SOX5의 초파리 ortholog의 입을, Sox102F, 주도 다 신경 및 클래스 IV 다 신경15에서 감소 된 복잡성의 짧은 dendrites 나타났습니다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)에 대 한 정량 분석의 절차를 제시. 이전 설명한 방법론에서 적응이 프로토콜 다 감각 신경의 개발 시험 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 그것은 강력한 이미지 라벨 및 세 번째 탈피 애벌레 몸 벽16,17,,1819에 다 신경 보여 줍니다. 그것은 NDAC 및 발달 차이 vivo에서조사 하고자 하는 연구자에 대 한 귀중 한 프로토콜입니다.

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프로토콜

1. 실험 준비

  1. 다음 시 약 준비: Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS); 트라이 톤 X-100. 0.2 %PBST (PBS + 0.2% 트라이 톤 X-100); 32 %paraformaldehyde (PFA), 사용; 하기 전에 4%로 희석 실리콘 고무 베이스와 치료 대리인; antifade 장착 매체 (예를 들어, 연장 금); 그리고 손톱 폴란드어입니다.
  2. 다음 장비 준비: 해 부 현미경, 2 개의 날카로운 집게와가 위 서, 기정, 해 부 접시, 현미경 슬라이드 및 coverslips, confocal 현미경을 만들기 위한 배양 접시 핀의 수에 대 한 고 피지 ImageJ 소프트웨어가 설치 된 컴퓨터.

2. 애벌레 컬렉션

  1. 각각 UAS GFP, ppk 권총 GAL4 또는 W1118 야생 타입 파리, UAS-Sox102F-RNAi 파리 친구. 25 ° c.에 표준 조건에서 문화 파리
  2. 5 ~ 6 일, UAS-Sox102F-RNAi의 세 번째 탈피 애벌레를 수집 / ppk 권총 GAL4, UAS GFP 또는 UAS-GFP와 ppk 권총 GAL4 / + 집게 해 부에 대 한 신중 하 게 제어.

3입니다. 애벌레의 해 부

참고:이 섹션의 모든 절차 서 현미경으로 운영 한다. 배율을 조사입니다. 최적의 광경 보기를 조정 하려고 합니다. 4 ~ 6 배 확대 것이 좋습니다.

  1. 실리콘 엘라 스토 머로 만든 기본 해 부 접시와 조직 문화 배양 접시에 유 충을 놓습니다.
  2. 등 면, 얼굴을 수 있도록 유 충 입 고리를 고정 하 고 유 충의 꼬리를 핀 다음. 장소 가능한 노출 오픈 업 표시 됩니다 중간 중간에 등 쪽 쪽.
  3. 몸에 수 분을 유지 하기 위해 유 충을 PBS의 200 µ L를 추가 합니다.
  4. Rostral에 꼬리에서 2 개의 tracheas 사이 등 쪽 정중 선 따라가 위로 잘라 만들. 각 유 충 시체의 네 모퉁이에 작은 상처를 확인 하십시오.
  5. 그래서 본문 거짓말 플랫 핀 각 본문의 네 모퉁이에 배치 합니다.
  6. 4%에서 유 충 몸 벽을 수정 PFA 실 온에서 25 분.
  7. 5 분 두 번 더 반복에 대 한 PBST에서 씻어.
  8. 조직에서 핀을 제거 합니다. 조직 전송 유리 슬라이드에 antifade 설치 매체와 함께 커버 하 고 커버 슬립을 탑재. 1 h 동안 건조 공기와 손톱 폴란드어로 가장자리를 밀봉.

4. 영상 처리

참고: 이미지를 거꾸로 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 찍은. 사용자는 20 X 목표 (권장)를 사용 하 여 샘플을 사진 수 있습니다.

  1. 부터 Z-시리즈 이미지를 캡처하십시오. 공초점 현미경 소프트웨어에서 "캡처부터 Z-시리즈" 대화 상자를 엽니다. Z 시리즈 이미지 캡처에 대 한 범위를 결정 합니다.
    1. "상단 및 하단" 버튼을 클릭 합니다. 위쪽 및 아래쪽 위치와 입력 값을 확인 "아래:" 및 "위쪽:" 상자. 0.5 µ m로 "부터 Z-시리즈 캡처" 대화 상자에서 "단계"를 설정 합니다. 다음부터 Z-시리즈 이미지 "지금 실행" 버튼을 클릭 합니다.
  2. *.Tiff 또는 *.nd2 파일으로 얻은 이미지를 저장 합니다.
  3. 영상 후 4 ° C에서 어두운 홀더에 슬라이드를 저장 합니다.

5. 모 수석 평가

참고: GFP 단백질 UAS GFP에 공동 overexpressed 이었고 ppk 권총 GAL4 GFP 형광 이미징 분석에 대 한 da 뉴런에 파리. 길이, 분기, 및 세 번째 탈피 애벌레에 da 뉴런의 구조를 측정할 수 있었다. 분석 매개 변수 길이 dendrites (µ m), 면적 (µ m2), 분기, 및 분기 구조 (%)의 총 수를 포함합니다. 그림 1 에서는 자세히 분석 매개 변수를 보여 줍니다.

  1. 모 수석의 길이
    참고: dendrites의 길이 추적 플러그인에 표시 된 모든 모 수석의 합계입니다.
    1. 설치 하 고 피지 ImageJ (https://fiji.sc/)20 소프트웨어를 실행 합니다. 다음 분할 이미지 별도 채널, 여러 채널 이미지의 경우.
      참고:이 프로토콜에 이미지 GFP의 한 채널에만 있다.
    2. 실행 "이미지 | 스택 | Z 프로젝트"Z 프로젝션;를 새 창 이름 ' Z 프로젝션 '으로 나타납니다. "최대 강도" 투영 유형을 클릭 하 고 시작 조각과 중지 슬라이스 따라 사이의 구성 개별 환경 설정에 따라. "확인"을 클릭 합니다 Z-프로젝션 이미지를 명확 하 게 제시 하는 모 수석 투영 표시 됩니다.
    3. neurites 추적.
      1. 선택 "플러그인 | 세그먼트화 | 간단한 Neurites 추적 프로그램 "창에는 dendrites 추적. 신경 소마를 찾아서 다음에 모 수석 세포 몸, 그리고이 모 수석의 끝에 또 다른 지점에서 출발 한 시점을 클릭 합니다.
        참고: 프로그램 두 점 파란색 선으로 연결 됩니다.
      2. 경로가 분명; 경우 플러그인 창에서 "Y"를 누릅니다 모 수석 경로 표시 이미지에서 선택 된 경로의 끝점까지 추적 됩니다. 같은 플러그인 창;에 "전체 경로"를 클릭 세그먼트가 완료 되 면 (그림 2).
        참고: 일부 dendrites 통로 더 작은 세그먼트로 분할 되었다 시작 포인트에서 끝났다. 세그먼트는 추적기에 대 한 전체 경로 제공 하기 위해 결합 했다.
    4. 경로 완료 한 후 가지는 새로운 위치로 다시 이동 합니다. 새로운 경로; 건축 될 수 있다 "모든 경로" 창 상자 모든 경로 (그림 3)의 길이 값을 표시 됩니다. 추적 파일을 저장 하 고 그림 2와 같이 미완성된 추적 계속.
    5. 클릭 하 여, 모 수석 길이 데이터를 내보내기 "파일 | 로 수출 *.cvs "'플러그인' 창에서. 다음 모든 경로 길이, 요약 하 고 데이터 분석/스프레드시트 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다. (그림 3)입니다.
  2. 다 신경 세포의 표면적
    1. ' 피지 ImageJ' 창에서 프리 핸드 그리기 도구를 선택 합니다. 경로 추적 하 고 끝점을 연결 합니다. '분석' 메뉴에서 선택 "설정된 측정 | 지역입니다. " '분석' 메뉴에서 "측정"을 클릭 합니다. 결과 (그림 4) 선정 지역에 대 한 값으로 새로운 상자에 나타납니다. 데이터 분석 소프트웨어에 그것을 복사 합니다.
  3. 총 수의 지점과 다 신경의 분기 구조
    1. "분석"을 열어 분기의 총 수를 계산 그리고 "렌더링 | 분석 Skeletonized 경로 "플러그인 창에서 (그림 5)를 추적 합니다.
      참고:는 식 목의 구조 분 지의 레벨의 합계입니다. 경로 셀 바디와 모 수석 팁 사이의 정의 된 그리고 주 버는 dendrites 신경 세포 체에서와 같은 하나의 경로 포함할 수 있습니다. 보조 아 버 등 3 차, 4 급, 그리고 오진법 아 버와 기본에서 있습니다. 모 수석 분기의 구조 분 지의 수준에 따라 구분 됩니다. 예를 들어, 기본 % 분기, 분기의 총 수로 나누어 고 수입니다.

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결과

Da 뉴런의 dendrites 했다 공동 overexpressing GFP (UAS GFP, ppk 권총 GAL4) 다 신경 소마에 GFP 형광 이미징 분석에 대 한 수지상 아 버에 표시 됩니다. 다 신경 dendrites의 형태는 거꾸로 confocal 현미경 (그림 2)에 의해 몇 군데.

Da 뉴런의 dendrites 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 추적 했다. 파일 모 수석 길이 (

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토론

Dendrites 표 피를 자극 하는 뉴런의 입력된 영역 하 고 그들의 형태학 정보 접수 및 개별 뉴런에 의해 처리 방법을 결정 합니다. 개발 모 수석 형태 모 수석 조직의 유전자 변조를 반영합니다. 초파리 애벌레 다 신경의 말 초 신 경계는 모 수석 개발 때문에 공부에 대 한 중요 한 모델: 1) 포유류11,12; 기능적 유사성 모 수석 구조11...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 윌리엄 A. Eimer 이미징 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 [하 R.E.T], 치료 질병의 기금에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 건강 [R01AG014713 및 R01MH60009 R.E.T;에 R03AR063271 및 R15EB019704 앨 러 배 마에], 그리고 국립 과학 재단 [앨 러 배 마에 NSF1455613].

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

참고문헌

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