빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

요약

여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

초록

간단한 순서 반복 (SSR) 식물과 동물 유전자 연구 및 분자 breeding 프로그램에서 사용 하는 가장 효과적인 마커 중 하나입니다. 실버 얼룩 polyacrylamide 젤에 SSR 마커 검출에 대 한 널리 사용 되는 방법입니다. 그러나, 실버 얼룩에 대 한 전통적인 프로토콜은 기술적으로 요구 하 고 시간이 많이 걸리는. 다른 많은 생물학 실험실 처럼 기법, 프로토콜을 얼룩이 지 실버는 검출 효율 향상을 위해 꾸준히 최적화 되었습니다. 여기, 우리 보고 단순화 된 실버 얼룩 메서드를 크게 시 약 비용 감지 해상도 사진 선명도 향상 시킵니다. 새로운 메서드는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 대 한 두 가지 주요 단계 (임신 및 개발) 및 3 개의 시 약 (실버 질산염, 수산화 나트륨, 그리고 포름알데히드), 그리고 처리의 불과 7 분을 필요합니다. 이전에 보고 된 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 쉽습니다, 빨리 그리고 SSR 탐지에 대 한 더 적은 화학 시 약을 사용 하 여. 따라서,이 간단 하 고, 낮은-비용, 고 효과적인 실버 프로토콜을 얼룩이 지는 유전 매핑 및 SSR 마커 데이터의 빠른 세대 번 식 마커 기반 도움이 됩니다.

서문

PCR 기반 마커의 개발 식물 유전학 및 번 식¹의 과학을 혁명을 했다. 간단한 순서 반복 (SSR) 마커는 가장 일반적으로 사용 되 고 가장 다재 다능 한 DNA 마커 중입니다. 그들의 게놈을 광범위 한 범위, 풍부, 게놈 특이성 및 반복성 heterozygous genotypes²의 검출에 대 한 그들의 codominant 상속 뿐만 아니라 SSR 마커의 장점 중 일부입니다. 여러 연구 결과 유전적 다양성 조사, 가계를 추적, 유전 결합 지도, 구성 및 경제적으로 중요 한 특성^3,4에 대 한 유전자 지도를 SSR 마커를 사용 했습니다.

SSR 마커의 PCR 제품 agarose 또는 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 및 다음 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 후 또는 UV 빛은 얼룩과 시각에 일반적으로 구분 됩니다. Polyacrylamide 젤에서 DNA 파편의 얼룩은 다른 착 색 방법^5,6 보다 더 민감한 이며 SSR 마커⁷같은 DNA 파편을 검출 하기 위하여 널리 이용 되는.

많은 생물학 실험실 기술 처럼 polyacrylamide 젤의 얼룩은 꾸준히 그것의 처음 보고 되 고 1979⁸조각 시각화 기술로 개선 했다. 기술은 처음 Bassam 외. 여 DNA 파편의 탐지에 대 한 수정 ⁶ 1991 년에 1994 년에 Sanguinetti와 동료⁹ 을 향상. 메서드는 더는 지난 몇 년간^{6,7,9,10,11,12,13,14} 에서 최적화 되었습니다. ^{, 그러나 15}., 프로토콜의 업데이트 된 버전의 대부분 아직도 이러한 프로토콜^{7의 응용 프로그램을 제한 하는 등 기술 수요 및 긴 처리 시간이 고정을 위한 장착6, 몇 가지 단점이 있다 11}. DNA 조각 검출의 높은 효율성과 낮은 비용을 결합 하는 최적의 프로토콜은 생물학 연구에서 얼룩의 일상적인 응용 프로그램 긴급 하 게 필요 합니다.

또한, polyacrylamide 젤 변성 및 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤으로 분할 될 수 있다 그리고 둘 다 SSR 마커 얼룩 방법 실버를 사용 하 여 검색에 사용할 수 있습니다. 효과 해상도는 크게 차이가 없습니다, 하지만 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 프로세스를 쉽게 하 고 적은 시간¹⁶.

이전 연구¹⁵기준 현재 연구의 목표는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 SSR 마커, 쉽고 빠르고 저렴 한 비용 검색 상세에서 프로토콜을 얼룩이 지는 최적화 된 실버를 설명 하기 위해입니다.

프로토콜

1. SSR 마커의 PCR 제품의 준비

1. 서식 파일 DNA를 포함 하 여 PCR 반응을 위한 모든 화학 제품 및 시 약 준비 (30 ng / µ L), 2 × PCR 마스터 믹스 (0.4 m m 각 dNTP, MgCl₂, Taq DNA 중 합 효소와 염료의 0.1 U / µ L의 3 m m의 2 × PCR 버퍼를 포함 하는), 각 10 µ M 앞으로 반전 뇌관 증 류 및 저온 (dH₂O).
   참고: 현재 연구에 사용 된 SSR 마커 했다 PT51333 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' 및 역방향 뇌관 순서: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3') 및 PT50903 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3'와 뇌관 순서를 반대로: AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3-5' ') 담배, 및 CX-43 (뇌관 순서 앞으로: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' 반전 뇌관 순서: 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3')와 CX-157 (뇌관 순서 앞으로: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' 뇌관 순서를 반대로: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3') 꽃 배 추에 대 한.
2. 템플릿 DNA, 2 × PCR 마스터 믹스, 각 앞으로 뇌관 및 역방향 뇌관의 0.2 µ L, dH₂오의 2.6 µ L의 5 µ L의 2 µ L을 추가 하 여 10 µ L PCR 믹스의 확대를 위한 준비
3. 5 분 동안 94 ° C의 초기 단계로 thermocycler의 PCR 증폭 반응 수행, 45의 38 주기 여 변성, 45 94 ° C에서 s s 뇌관 어 닐 링 55 ° C에서 확장, 72 ° C에서 1 분 및 72 °에서 10 분의 최종 확장 단계 C; 그런 다음 나중에 사용할 4 ° C에서 PCR 제품 저장.

2. 준비 솔루션의 Polyacrylamide 젤 캐스팅

1. 기본 트리 및 dH₂O 27.5 g 붕의 54 g 용 해, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mL를 추가 하 고 솔루션 1, dH₂o. 000 mL의 최종 볼륨을 조정 하 여 5 × TBE 버퍼 1 리터를 준비
   참고: TBE 버퍼 저장할 수 있습니다 실 온에서 몇 달 동안.
2. DH₂O 2 L의 최종 볼륨을 5 × TBE 버퍼의 200 mL를 추가 하 여 0.5 × TBE 버퍼의 2 리터를 준비 하 고 상 온에서 저장.
3. 29 g 분자 생물학 급료 아크릴의와 분자 생물학 급 N, N 1 g을 용 해 하 여 6% 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 솔루션 준비 '-500 mL의 최종 볼륨을 0.5 × TBE 버퍼에 methylenebisacrylamide. 커버 알루미늄 호 일 및 나중에 사용할 4 ° C에서 저장소 솔루션 병.
   주의: 아크릴 강력한 neurotoxin 간주 됩니다 하 고 신중 하 게 처리 되어야 한다. 분말 및 그것을 포함 하는 처리 솔루션 무게 때 항상 장갑을 착용 하십시오.
4. DH₂O 10 mL의 최종 볼륨을 APS의 2 세대를 용 해 하 여 20% 염화 persulfate (AP) 솔루션을 준비 합니다. 그것은 몇 달 동안-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
   참고: 편의 위해 20 %APS 솔루션의 10 mL 수 1.5 mL 또는-20 ° c.에 스토리지에 대 한 원심 분리기 튜브의 2 mL aliquoted 해 동 하 고 사용 하기 전에 잘 섞어.
5. 아세트산의 0.5%를 포함 하는 95% 에탄올 0.997 mL에 bind silane의 3 µ L를 용 해 하 여 희석된 바인딩-실 란 솔루션을 준비 합니다. 그것은 4 ° C에서 주 저장할 수 있습니다.
   주의: 바인딩 silane 독성, 솔루션을 취급할 때 장갑을 착용 이며 룸 통풍 유지.

3입니다. Polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 대 한 준비

1. 1 세트의 유리 접시와 스페이서 수돗물, dH₂오 어 완전 한 rinsing 하 여 다음 세제로 세척 접시 건조 선반에에서 그들을 설정 하 여 판 건조.
2. 그리고 5 분 동안 건조 직사각형 유리 접시의 안쪽 표면에 bind silane 솔루션의 1 mL를 분산.
   참고: 경우 bind silane 솔루션은 접시의 표면에 균일 하 게 확산 되지, 젤 수 있습니다 얼룩 동안 분리할 고 결과 불만족 얼룩 효과.
3. 면봉으로 금이 낸된 유리 접시의 안쪽 표면에 격퇴 silane의 1 mL에 분산, 초과 격퇴-silane 티슈 종이로 닦아 하 고 5 분 동안 건조 한 공기.
   참고: 반발 silane 균일 하 게 유리 접시의 표면 코트 하지 않습니다, 그것은 손상 될 수 젤 부분적으로 벗 겨 서.
4. 위에, 노치 플레이트 스페이서가 유리 접시를 조립 하 고 클램프 클램프 주조와 어셈블리의 양쪽.
5. 1.5 m m의 33 cm 폭 × 10 cm 높이 두께의 플레이트 세트에 대 한 비 커에 6% 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 솔루션의 적절 한 금액 (40 mL)을 부 어, tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 µ L와 200 µLfresh 20% 추가 AP 부드럽게 섞는다.
   참고: 젤 솔루션의 적절 한 금액 (40 mL) 스페이서 (30 cm × 8.5 c m × 0.15 cm)의 간격을 가진 2 개의 격판덮개의 내부 볼륨에서 계산 했다. 젤의 중 합에 대 한 APS와 TEMED의 금액에 대해서는 참조¹⁷에 따라 APS와 TEMED 젤 솔루션의 표준 비율. 위에서 설명한 젤 솔루션 4 ° c.에 저장 됩니다. 젤 솔루션 TEMED의 20 µ L와 AP를 사용 해야 하는 20%의 100 µ L, 실내 온도에 저장 됩니다. 부드럽게 솔루션에 공기 방울을 피하기 위해 유리 막대기로 젤 솔루션의 혼합물을 저 어.
6. 즉시 솔루션을 부 어 하 고 신중 하 게 노치 플레이트의 가장자리를 따라 조립된 유리 접시로 가기로 거의 공간을 채우는 빗을 삽입. 빗에 젤 솔루션의 작은 볼륨을 추가 합니다.
   참고: 유리 접시 젤 유출 하지 않도록 수평 유지. 필요한 경우 버블 걸이로 모든 거품을 제거 합니다.
7. 실 온에서 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다.
   참고: 중 합에 대 한 시간 젤 솔루션 및 환경 온도를 변경할 수 있습니다.
8. 젤 완전히 중 합 후, 캐스팅 클램프를 제거 하 고 접시 세트 전기 탱크 단위에 위 버퍼 저수지 쪽으로 직면 하는 노치 플레이트 놓고 큰 클램프를 사용 하 여 연결 플레이트 탱크 단위로 설정.
9. 상단의 각 0.5 × TBE 버퍼와 낮은 챔버의 1 L를 붓는 다. 빗을 제거 하 고 피 펫 또는 주사기를 사용 하 여 버퍼와 모든 우물을 철저 하 게 플러시.
   참고: 젤 샌드위치 접시의 바닥에 어떤 거품 없이 버퍼에 완전히 젖 었 확인 합니다.

4. 실행 젤

1. 각 잘 polyacrylamide 젤에 PCR 제품의 대략 1 µ L를 로드 합니다. PCR 제품의 샘플 함께 젤의 양쪽에 DNA 크기 사다리를 로드 합니다. 위 버퍼 약 실에 안전 덮개를 해결.
2. 리드 레드 레드와 블랙 하는 색 일치 하는 전원 공급 장치에 연결 합니다. 염료 ~ 70 분 동안 일반적으로 정의 된 위치에 도달할 때까지 110 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다.
   참고: 전압 및 실행 시간 PCR 제품의 크기에 따라 조정할 수 있습니다.

5. 실버 감지 SSR 마커를 비 Polyacrylamide 젤에 대 한 얼룩

1. 전기 이동 법, 후 위 상공에서 버퍼는 큰 비 커를 통해 밸브에 배수 하십시오. 사이드 클램프를 분리, 제거 판 기구에서 신중 하 게, 주걱으로 한쪽을 따라 금이 낸된 유리 접시를 분리 하 고 다른 유리 접시에 부착 된 젤 남아 바인딩 silane로 입힌 다는 것을 확인.
2. DH₂O 900 mL에 NaOH의 10 g을 용 해 하 여 AgNO₃ dH₂O. 준비 1 L 신선한 개발 솔루션의 1 리터에서 1.5 g을 용 해 하 여 신선한 임신 솔루션의 1 리터, 37% 포름알데히드의 1 mL을 추가 dH₂o.를 사용 하 여 1 L의 최종 볼륨을 조정 하 고
   참고: 장갑을 착용 하 고 위의 화학 물질 및 주의 솔루션을 처리 합니다. 솔루션 및 해당 솔루션 단계 어둠 속에서 유지 하는 필요는 없습니다.
3. 신중 하 게 충분 한 dH₂O 전기 이동 법 버퍼 제거 다음 접시 젤 플라스틱 쟁반에 향하도록 놓고 잠수함 침 솔루션의 1 리터에 젤 젤과 유리 접시를 헹 구 십시오. 통에 트레이 넣어.
4. 트레이 부드럽게 흔들어 분 60 r/3-4 분.
   참고: 젤 두께 임신 솔루션에서 실버 질산염의 농도 따라 조정할 수 있습니다 시간을 떨고.
5. 임신 솔루션에서 격판덮개를 이동 하 고 다른 쟁반에 그것을 넣어. 접시와 두 번 3-5 s에 대 한 충분 한 dH₂O를 사용 하 여 젤의 표면에서 떨어져 잔여 임신 솔루션 린스.
6. 다른 트레이에 향하도록 젤 접시를 놓고, 접시 개발 솔루션의 1 리터에 잠수함 그리고 50 r/분 ~ 3 분 DNA의 모양을 조각 하는 모니터에 대 한 트레이 부드럽게 흔들어 때 DNA의 신호의 높은 비율 조각 개발을 중지 배경 잡음을 관찰 (이 단계는 3 분 소요).
7. 두 번, 접시와 충분 한 dH₂O 젤을 헹 구 고 건조 한 티슈 페이퍼와 젤 접시.
8. 적절 한 스캐너를 사용 하 여 젤 스캔. 300 dpi의 해상도 DNA 파편의 명확한 시각화를 제공합니다. 또한 카메라를 사용 하는 젤에 촬영 수 있습니다.
9. SSR 마커 밴딩 패턴 기반 이미지에 DNA 파편에 득점 수 있습니다.

결과

PCR amplicons 꽃 배 추와 담배에 해당 SSR 뇌관 쌍을 사용 하 여 생산 되었다. 전기 이동 법, 후 polyacrylamide 젤 SSR 마커 (그림 1)의 밴딩 패턴을 명확 하 게 감지 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 위의 실버를 사용 하 여 얼룩이 있었다.

프로토콜을 얼룩이 지는 다른 실버의 검색 효율성 비교를 SSR 마커 담배와 꽃 배 ...

토론

임신 후 젤의 세척은 중요 한 단계 이다. 부족 세척 시간 및 물 볼륨 접시와 젤의 표면에 침 솔루션의 불완전 한 제거 발생 하 고 어두운 배경에서 발생할 수 있습니다. 적절 한 개발에 또 다른 핵심 단계 이다,-개발 DNA 파편의 낮은 콘트라스트 이미지와 함께 어두운 갈색 배경에서 발생할 수 있습니다. 또한, 임신 단계 DNA 파편의 착 효율을 크게 영향을 줍니다. 임신 시간 5 분 이상 확장 또는 증가 임...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-