혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

요약

메서드는 효율적인 decellularization와 혀 세포 외 매트릭스 (가장)의 준비에 대 한 여기 표시 됩니다. 가장 정적 또는 흔들 문화 조건 하에서 혀 편평 세포 암 종 (TSCC) 모델의 재구성 기능 건설 기계로 사용할 수 있습니다.

초록

혀 편평 세포 암 (TSCC) 시험관에대 한 효과적이 고 현실적인 모델을 생성 하기 위해 방법은 생산 decellularized 혀 기질 (가장) TSCC 건설 기능 건설 기계를 제공 하 게 만들어졌습니다. 가장 세포 성장, 감 별 법 및 셀 마이그레이션에 대 한 생체 외에서 틈새를 제공합니다. 원시 세포 외 기질 (ECM) 및 decellularized 매트릭스에 유지 하는 생 화 확 적인 작곡의 마이크로 구조 정박 하는 셀에 대 한 조직의 특정 틈새를 제공 합니다. 가장의 제조 deoxyribonuclease (DNase) 소화 유기 또는 무기 전처리의 심각한 동반에 의해 실현 될 수 있다. 이 프로토콜은 운영 하 게 쉬운 하 고는 decellularization에 대 한 높은 효율을 보장. 가장 TSCC 모델의 건설을 가능 하 게 TSCC 셀 정적 또는 흔들 문화 조건에 대 한 유리한 cytocompatibility를 보여주었다. 스스로 만든된 생물 세포 배양에 대 한 영구 촉발된 조건 또한 사용 되었다. 가장을 사용 하 여 복원된 TSCC 보여주었다 임상 TSCC histopathology, 닮은 속성과 특성 TSCC 연구 잠재력을 제안.

서문

혀는 deglutition, 조음, 시음 등 다양 한 중요 한 기능이 있다. 따라서, 혀 기능 장애 환자 들의 삶의 질¹에 큰 영향을가지고. 구강에서 가장 일반적인 악성 종양은 혀 편평 세포 암 종 (TSCC), 일반적으로 알코올 음료 또는 담배²를 연기 하는 사람에서 생기는.

최근 몇 년 동안, 작은 진행 TSCC에 기초 연구에 달성 되었습니다. 효율적인 생체 외에서 연구의 부족 모델 가장 큰 문제 중 하나 남아 있다. 따라서, 기질 (ECM) 잠재적인 솔루션으로 밖으로 변합니다. ECM 고도로 조직된 매트릭스 구성 요소 구성 하는 복잡 한 네트워크 프레임 이기 때문에, 비 계 재료는 ECM 같은 구조와 구성 암 연구에 대 한 능력이 될 것 이다. Decellularized ECM는 같은 기원에 생체 외에서ECM의 가장 중요 한 이점을 밝혀에서 셀에 대 한 완벽 하 게 틈새를 제공할 수 있습니다.

ECM 세제와 효소를 사용 하 여 decellularization 통해 조직에서 제거 되는 세포 구성 성분으로 유지 될 수 있습니다. Decellularized 매트릭스의 콜라겐, fibronectin, 및 laminin를 포함 하 여 다양 한 ECM 구성 요소, 배양된 세포 생존, 확산, 그리고 셀³의 홍보에 대 한 기본-조직-같은 microenvironment을 제공 합니다. 또한,이 식 위한 immunogenicity ECM에 세포 구성 성분의 부재와 함께 최소한의 수준으로 줄일 수 있습니다.

지금까지, decellularized ECM에 대 한 제작 방법은 다른 조직 및 장기 심장^4,5,,67년 간^{8,9,10 등에서 시도 되었습니다. ,11}, 폐^{12,13,14,15,,1617}및 신장^{18,19 , 그러나 20}., 관련 연구 우리의 지식 최선 다 해 혀에서 비슷한 작품에서 찾을 수 있다.

이 연구에서는 decellularized 혀 기질 (가장) 물리, 화학, 및 효소 치료의 일련에 의해 효율적으로 그리고 싸게 조작 했다. 다음은 가장 TSCC 동작 및 개발에 대 한 적절 한 시뮬레이션을 보여주는 TSCC에서 생체 외에서정리에 사용 되었다. 가장 좋은 생체 적합성으로 가장 TSCC 연구³큰 잠재력을 가질 수 있음을 나타내는 조직-특정 틈새에 셀 가이드 수 있다. 여기에 표시 된 프로토콜 연구자 중 병 또는 TSCC의 임상 치료에 대 한 선택을 제공 합니다.

프로토콜

모든 동물 작업 동물 복지 행위, 기관 지침에 따라 수행 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회, 썬 얏-센 대학교에 의해 승인.

1입니다. 준비 편

1. 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 실행 하 고 방언 무 균 수술가 위 핀셋을 사용 하 여 제거.
2. 3 분, 75% 에탄올에 방언 담가 다음 1.5 mL으로 각 혀를 넣어 10 mM 멸 균 인산 염의 1 mL Eppendorf (EP) 튜브 버퍼링 솔루션 (PBS).
   참고: 다음의 모든 단계에서 PBS의 농도이 단계에서 농도와 동일.
3. 동결 해 동 하 여 세포를 세포: 1 h-80 ° C에서 EP 튜브에 혀를 동결 하 고 다음 3 사이클에 대 일 분 동안 실내 온도에 혀를 녹여.
4. 수술 봉합 수술 바늘을 사용 하 여의 조각에 각 혀를 로드 하 고 메 마른 은박지의 작은 조각으로 봉합의 끝을 포장. 무 균 조건에서 75% 에탄올을 포함 하는 3.5 cm 또는 6 cm 문화 접시에 작업을 수행 합니다.
   참고: 외과 봉합의 각 작품의 적절 한 길이 약 20cm, 그리고 각 조각의 은박지의 적절 한 크기에 대해 0.3 cm² (1 c m × 0.3 c m). 혀는 은박지 근처 로드 합니다.
5. 30 미 수행 무 균 조건에서이 작업에 대 한 살 균 PBS의 3 mL와 함께 각 혀 3.5 cm 또는 6 cm 문화 접시에 린스.
6. 씻어 초순와 방언: 90 µ g/mL의 최종 농도에 불 임 초순의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가. 방언을 저 어 bar가 포함 된 병에 넣습니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
   참고: 5 방언까지 놓일 수 있다 봉합의 twining 고려 같은 병에. 석 박 혀 떨어져 미 끄 러에서 방지 하기 위해 병에 봉합의 끝 이다. 혀는 병 안에 남아 있는 봉합의 길이 조정 하 여 2cm 높은 병의 하단에서 배치 되어야 합니다. 이 노트 1.8, 1.10, 1.12, 및 1.16 단계 이기도합니다.
7. 12 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
8. NaCl와 방언 세척: 살 균 1의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가 M NaCl 90 µ g/mL의 최종 농도에. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
9. 24 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
10. 트라이 톤 X-100 여 세포 세포: 살 균 2%의 250 mL와 함께 넓은 입 병에 90 µ g/mL의 최종 농도에 ampicilin를 추가 PBS에 트라이 톤 X-100. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
11. 48 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
12. 씻어 CaCl₂/MgCl₂방언: 90 µ g/mL의 최종 농도에 살 균 5 m m CaCl₂/MgCl₂ 의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
13. 24 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
14. 소화 DNase에 의해: 행 크의의 1 mL 균형 소금물 (HBSS) 각 EP 튜브를 추가. 각각 300의 최종 농도에 DNase HBSS로 추가 µ M.에 각 EP 튜브는 튜브 외부 봉합 부분의 각 혀 이동. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
    참고: 이전 단계에서 병 안에 남아 있는 봉합의 일부도이 단계에서 EP 튜브 안에 남아 있는지 확인 하 고 이전 단계에서 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부도이 단계에서 EP 튜브 밖에 남아 있다 다는 것을 확인 한다.
15. 24 h에 대 한 37 ° C에서 EP 튜브에 혀를 품 어.
16. 씻어 PBS 가진 방언: 90 µ g/mL의 최종 농도에 살 균 PBS의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
17. 24 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
18. 사용까지 준비 편 4 ° C에서 살 균 PBS에 저장 합니다.

2. TSCC의 3 차원 (3D) 재구성

1. 정적 TSCC 모델 건설
   1. 씨 1.0 x 10⁶ 단일 TSCC 셀 (Cal27) 3.5 c m 문화 접시에. Dulbecco의의 3 mL 수정 독수리의 매체/F12 (DF12) 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 90 µ g/mL ampicilin, 및 90 µ g/mL 대 추가 합니다.
   2. 2 ~ 3 일 동안 37 ° C에서 Cal27 셀 문화. 셀 60% 이상 커버 있는지 확인 접시 바닥의 지역.
   3. 문화 접시에 Cal27 단층에 가장을 로드 합니다.
   4. 28 일 동안 37 ° C에서 CO₂ 인큐베이터에 접시를 넣어.
   5. 셀 문화 과정 매일 문화 매체를 새로 고칩니다. 인큐베이터에서 CO₂ 농도 5% 이다.
2. 흔들된 TSCC 모델 건설
   1. 성가 냈다 minibioreactor의 준비
      1. 10 mL 주사기에서 플런저를 꺼내.
      2. 막대의 낮은 터미널 근처 구멍 (직경 1 ㎝)를 파고 및 구멍에 저 어 바 로드.
      3. 플라스틱 넓은 입 병의 병 뚜껑의 중앙에 구멍 (직경 0.5 c m)를 파고 및 뚜껑을 통해 피스톤 막대를 넣어.
      4. 50 mL 원심 분리기 튜브의 절반을 잘라 고 병 뚜껑의 외부 측면에 용접.
      5. fishhooks에 묶여있다는 낚시 라인 막대 여 fishhooks 막대를 연결 합니다.
         참고: 4 fishhooks까지 장착할 수 막대에.
      6. 압력솥 사용 하기 전에 스스로 만든된 복잡 한입니다.
         참고: 플라스틱 넓은 입 병 압력솥 하지를 않습니다. 새로운 살 균 플라스틱 넓은 입 병을 사용 하 여 세포를 배양 하는 동안.
3. 동적 세포 배양
   1. 씨 1.0 x 10⁶ 단일 Cal27 셀 성가 minibioreactor에. 10 %FBS, 90 µ g/mL ampicilin, 및 90 µ g/mL 대 포함 된 DF12 매체의 150 mL를 추가 합니다.
   2. 막대에 연결 된 fishhooks를 사용 하 여 minibioreactor에 가장을 로드 합니다.
   3. 병 뚜껑을 강화 하 고는 자력에 minibioreactor를 넣어. 7 ~ 14 일 동안 37 ° C에서 CO₂ 배양 기에서 200 rpm에서 minibioreactor를 활성화 합니다.
      참고: CO₂ 배양 기에서 CO₂ 의 농도 5%.

결과

이 프로토콜의 가장 준비에 대 한 효율적이 고 적절 한 것으로 판명. 가장 완벽 한 decellularization 국어 조직 비교 했다. Decellularization의 효능 hematoxylin-오신 (그) (그림 1A-B) 얼룩에 의해 확인 되었다. 그 결과 얼룩 가장 (그림 1B)에서 핵 얼룩의 완전 한 실종을 밝혔다. 또한, 이전 작품에서 DNA 콘텐츠 정량화?...

토론

Decellularized ECM 제조에 잘 설립 프로토콜 조직에서 세포 구성 요소를 제거 하는 동안 네이티브 ECM 구성 유지 한다 거의 완전 하 게²¹. 현재 보고 된 decellularization 프로토콜 대류 수송에 의해 세포 물질을 제거 하는 맥 관 구조를 통해 관류를 요구 하는에 불구 하 고 기계적인 동요 채택 되었다 여기, 전통적인 간단 하 고 저렴 한 방법²² 로 알려진 ^,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805