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요약

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초록

냄새 소스 쪽으로 이동 하는 곤충의 능력은 그들의 1 차 후 각 수용 체 신경 (ORNs)의 활동을 기반으로 합니다. Odorants 온 응답에 대 한 상당한 양의 정보를 생성 하는 동안 운전 행동 응답에 특정 ORNs의 역할 제대로 이해 남아 있습니다. 개별 ORNs, 여러 ORNs 단일 odorants, 그리고 어려움을 자연스럽 게 관찰된 시간적 변화 후 각 자극을 사용 하 여 복제에 의해 활성화 활성화 하는 odorants의 다른 volatilities 인해 발생 하는 동작 분석에 합병증 실험실에서 기존의 냄새 배달 방법입니다. 여기, 우리는 분석 초파리 애벌레 동작의 ORNs의 동시 optogenetic 자극에 응답에서 하는 프로토콜을 설명 합니다. 여기에 사용 된 optogenetic 기술 ORN 활성화의 특이성 ORN 활성화의 시간적 패턴의 정밀 하 게 제어 가능 합니다. 해당 애벌레 움직임 추적, 디지털 기록, 및 사용자 정의 작성 된 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 가벼운 자극으로 냄새 자극을 대체 하 여이 메서드 애벌레 행동에 미치는 영향을 연구 하기 위해 개별 ORN 활성화 더 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 우리의 방법은 애벌레 행동에 로컬 뉴런 (LNs) 뿐만 아니라 2 차 프로젝션 뉴런 (PNs)의 영향을 공부 더 연장 될 수 있습니다. 이 방법은 따라서 후 각 회로 기능의 포괄적인 절 개 하면 그리고 어떻게 후 각 신경 활동에 대 한 보완 연구에 행동 반응 번역.

서문

초파리 애벌레의 환경에서 후 각 정보는 궁극적으로 애벌레 동작1,2,3,4결정만 21 기능적으로 뚜렷한 ORNs, 활동에 의해 감지입니다. 그러나, 상대적으로 작은 논리는 감각 정보를 인코딩하는이 21 ORNs의 활동에 대 한 알려져 있다. 따라서 실험적으로 측정 하는 동작을 각 애벌레 ORN의 기능적 기여 필요가 있다.

하지만 초파리 애벌레 ORNs의 전체 레 퍼 토리의 감각 응답 프로필 세부1,,45, 후 각 회로 하 고 그로 인하여 개별 ORNs의 기여에서에서 공부 하고있다 탐색 동작 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 애벌레 행동 연구에 어려움 공간 및 일시적으로 활성화 한 ORNs 하는 무 능력 때문에 지금까지 발생 한다. 특히 21 초파리 애벌레 ORNs의 19를 활성화 하는 odorants의 패널이 했다 최근 설명된1. 낮은 농도에서 패널에서 각 odorant 그것의 동족 온 에서만에서 생리 응답 elicits. 그러나, 기존의 행동 분석에 일반적으로 사용 되는 높은 농도에서 각 odorant 여러 ORNs1,,56생리 응답 elicits. 또한,이 패널에서 odorants volatilities 안정적인 냄새 그라디언트7,8의 형성에 의존 하는 행동 연구의 해석을 복잡 하 게 하는 다양 한 있다. 마지막으로, 자연스럽 게 발생 냄새 자극 실험실 조건 하에서 복제 하기 어려운 일시적인 구성 요소가 있다. 그것은 따라서 동시에 공간 및 시간적으로 개별 ORNs를 활성화 하는 동안 애벌레 동작을 측정할 수 있는 방법을 개발 하는 것이 중요.

여기, 우리는 앞에서 설명한 애벌레 추적 이점이 메서드 분석 실험1,8보여 줍니다. Gershow 외 에 설명 된 추적 분석 결과 동작 경기장8에서 냄새의 안정 그라디언트를 유지 하기 위해 전자 제어 밸브를 사용 합니다. 그러나, 냄새 자극 설정 구축에 관련 된 복잡 한 엔지니어링의 수준 때문에이 메서드는 다른 실험실에서 복제 어렵다. 또한, 특히 단일 ORNs를 활성화 하기 위해 odorants를 사용 하 여 관련 문제는 해결 되지 않은 남아 있습니다. 매튜 외 에 설명 된 추적 분석 결과 간단 하 게 냄새 배달 시스템을 사용 하지만 결과 냄새 그라데이션 테스트 odorant의 변동에 따라 달라 집니다1분석 결과 긴 기간에 대 한 안정적입니다. 따라서, 가벼운 자극으로 냄새 자극을 대체 하 여 우리의 방법은 특이성의 장점과 온 활성화의 정확한 시간 제어 하 고 다른 힘의 기온 변화도 냄새의 형성에 종속 되지 않습니다.

우리의 방법은 쉽게 설정 이며 연구자 초파리 애벌레 탐색의 측면을 측정 하는 데 관심이 대 한 적절 한입니다. 이 기술은 연구원은 드라이브 선택의 그들의 마음에 드는 시스템의 neuron(s)에서 CsChrimson 의 식 수는 다른 모델 시스템에 적응 될 수 있습니다. CsChrimson 채널 rhodopsin의 빨간색 이동 버전입니다. 그것은 애벌레의 phototaxis 시스템에 표시 되지 않는 파장에서 활성화 됩니다. 따라서 특이성, 안정성 및 재현성9뉴런의 활동을 조작할 수 있습니다. 계정 과목의 크기 변화에 대 한 소프트웨어를 작성 하는 사용자 정의 수정 하 여이 방법을 쉽게 다른 곤충 종의 크롤링 애벌레에 맞게 수 있습니다.

프로토콜

1. 동작 경기장 건물과 행동 분야에서 Optogenetic 자극 수 있도록 하드웨어 준비

  1. 빛을 박탈 행동 경기장을 구축, 66 cm3 x 61 x 89의 차원으로 상자를 만들 (35"L x 24" W x 26"H) 블랙 컬러 플 렉 시 글라스 아크릴 시트 (두께 3 m m) ( 재료의 표참조)의 만든. 이러한 상자를 만들려고 재료 로컬 하드웨어 매장에서 사용할 수 있어야. (그림 1A) 동작 방에 테이블 탑에이 상자를 배치 합니다.
  2. 흑백 USB 3.0 CCD 카메라는 IR 긴 통과 830 nm 필터와 8 m m F1.4 C 마운트 렌즈를 장착 하는 마운트 ( 재료의 표참조) 블랙 박스 천장의 센터에. 장소 2 개의 적외선 LED 스트립 ( 재료의 표참조) 테이블 위에 어두운 경기장 (그림 1A)에서 애벌레를 조명 하기 위하여.
  3. LED 플랫폼 구축, 22 c m × 22 c m 평방 알루미늄 접시 (선호 그린 매트 블랙으로 마무리 한 반사를 제거 하는 스프레이)를 얻을. 격판덮개의 센터에서 CCD 카메라 주위에 맞게 충분히 큰 구멍을 뚫고 금속 커터를 사용 하 여.
  4. 빨간색 LED 스트립 조명 ( 재료의 표참조)와 금속 플레이트 커버. 시리즈에서 LED 빛 스트립 와이어 솔더와 라즈베리 파이 2B 마이크로프로세서에 의해 제어 되는 커플러 릴레이에 스트립 와이어 피드 ( 재료의 표참조) (그림 1B 와 2).
  5. 설치 하 고 LED 스트립 광 커플러 릴레이 연결 하기 전에 라즈베리 파이 프로세서에 우분투 친구/Raspian 제시/리눅스 기반의 운영 체제를 구성 합니다. 전원 공급 장치 LED 스트립 및 커플러 (그림 2)를 연결 ( 재료의 표참조). (그림 1B) CCD 카메라는 LED 플랫폼을 탑재 합니다.
    참고: 우분투 메이 트 v16.04 운영 체제는 자유롭게 사용할 수 있습니다. 간단한 파이썬 기반 명령 집합 LED 가벼운 자극 (구문 파일 참조)의 프로그램 패턴을 쉽게 적용할 수 있습니다.
  6. 행동 분야에서 여러 지점에서 동질적인 irradiance를 확인 합니다. 계의 도움으로 경기장의 표면에 절대 방사를 측정 하 고 경기장의 표면에 걸쳐 ~1.3 W/m2 로 그것을 결정 합니다.
    참고:이 강도에서 더 중대 한 변화에서에서 관찰 되었다 온도 실험의 과정을 통해. 또 다른 연구10 ~1.9 W/m2 의 높은 방사를 사용 하 고 실험의 과정을 통해 온도에 아무런 변화를 관찰.

2. 동작 분석 초파리 애벌레의 준비

  1. 표준 비행 거리 음식에 파리를 유지 ( 재료의 표참조) 25 ° C, 50-60 %RH, 그리고 12 h/12 h 명암 주기에서.
  2. 한 쌍의 ORNs에서 CsChrimson 을 표현 하기 위하여 처녀 여성에서에서 교차 UAS-벨트-CsChrimson 선 OrX Gal4 선에서 남성 (21 애벌레 냄새 수용 체 중 하나에 해당 하는 'X' (또는) 각 고유 하 게 표현 되는 유전자 ORNs의 21 쌍)의9,11.
    1. 또는, 모든 21 애벌레 ORNs에서 CsChrimson 을 표현 하기 위하여 UAS-벨트-CsChrimson 에서 처녀 여성 크로스 라인 남성에 게는 Orco Gal4 선 ('Orco'는 모든 21 ORNs에 표현 되는 공동 수용 체)에서.
    2. 이 실험에서 컨트롤로 자체로 UAS-벨트-CsChrimson 라인을 사용 합니다.
      참고: 여기에 나열 된 비행 주식 모두에서 사용할 수 있습니다 블루밍턴 초파리 재고 센터 ( 재료의 표참조).
  3. 십자가에서 남성과 여성의 파리 친구 및 48 h에 대 한 알 수 있습니다, 일단 성인 신선한 유리병에 전송.
    1. 계란을 포함 하는 식품 유리병의 표면에 400 µ M, 모든 trans 망막 (ATR) 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해 및 89 m m 자당 증류수에 용 해를 포함 하는 혼합물의 400 µ L를 추가 합니다.
      참고: 작은 양의 자당 ATR 솔루션의 애벌레 먹이 촉진 합니다. ATR은 CsChrimson 식9,10upregulating에 필요한 공동 인자 이다. ATR은 빛에 민감한.
    2. ATR 계란을 포함 하는 음식 튜브에 추가 되 면 추가 72 h에 대 한 어둠 속에서 튜브를 품 어.
      참고:이 연구 및 위의 두 연구 ATR 먹이 인 애벌레 행동에 효과 관찰 하지, 하는 동안 제어 ATR ATR를 포함 하지 않는 위의 혼합물의 동일한 금액을 테스트 라인을 쓰는 하 여 먹이의 효과 대 한 것이 좋습니다.
  4. 높은 밀도 (15%) 자당 솔루션을 사용 하 여 부유 하 여 제 3 탈피 애벌레 (달걀 누워 후 ~ 120 h) 비행 식품의 표면에서 추출. 한 P1000 사용 micropipette 1000 mL 유리 비 커에 자당 솔루션의 표면에 떠 있는 애벌레를 구분 합니다.
  5. 워시 애벌레 때마다 유리 비 커에 800 mL 신선한 증류수를 교환 하 여 3-4 회. 애벌레 동작 분석 결과를 그들을 복종 하기 전에 10 분 동안 휴식을 하실 수 있습니다.

3. 동작 분석 결과

  1. (22-25 ° C) 사이 일관 된 온도 유지 및 동작 방에 습도 (50와 60 %RH) 사이.
  2. 22 cm x 22 cm 광장 페 트리 접시에 녹은 agarose (1.5%)의 따르는 150 mL로 애벌레 크롤링 매체를 준비 합니다. 1 페 트리 접시의 분석 결과, 실험 당 8-10 시험의 각 재판 부 어 있다. 응고 및 동작 분석 결과에서 그들을 사용 하기 전에 접시에 1-2 시간 기다린 agarose를 허용 합니다.
    1. 전송 준비 3-탈피 애벌레의 20 개 이상 하는 센터의 페 트리 접시 (그림 1C). 페 트리 접시의 뚜껑을 커버. CCD 카메라 아래 행동 분야에서 페 트리 접시를 놓습니다.
      참고: 실험에 따라 동작 분석 실험 일반적으로 수행 됩니다 3-5 분. odorant 지도 단서를 제공 하는 분석 결과에 사용 되 면 그것은 관찰 되었다 결과 냄새 그라데이션 약 5 분의1에 대 한 안정적인 유지. 긴 시험 시간은 권장 하지 않습니다. 탈수 또는 장기간된 630 nm 빨간불을 노출에서 애벌레에 해로운 효과 하지이 시간 포인트 내에서 관찰 되었습니다.
  3. 설정에 850 nm 적외선 LED 가벼운 소스 동영상에 애벌레를 시각화. 애벌레 움직임을 기록 하는 CCD 카메라를 시작 합니다.
  4. 라즈베리 파이 프로세서, 프로그램 레드 빛 자극의 적절 한 패턴을 관리 하는 절차와 관련 된 소프트웨어를 사용 하 여.
    참고: 일련의 간단한 파이썬 기반 명령 (구문 파일 참조) LED 가벼운 자극의 프로그램 패턴을 쉽게 적용할 수 있습니다.

4. 데이터 처리 및 분석

  1. Matlab 같은 모든 사용 가능한 프로그래밍 소프트웨어에 각 재판의 녹화 된 비디오를 가져옵니다.
  2. 시간의 기능으로 동영상에 있는 모든 애벌레의 XY 좌표를 가져옵니다. 추적 소프트웨어의 한계에 따라 15-20 제 3 탈피 애벌레 단일 영화1,8에서 추적할 수 있습니다.
    참고: 세트 (구문 파일 참조) 적절 한 조건에 맞게 쉽게 적응 될 수 있는 간단한 Matlab 코드 ('Tracklarva')이 제공 됩니다. 이 실험에서 모든 시험을 결합 하 여 프로그램과 분석 결과의 전체 기간에 대 한 모든 유 충의 XY 좌표를 출력 (아래 코드 구문 참조). 또는, 한 연구자에 자유롭게 사용할 수 있는 여러 가지 오픈 소스 기반된 프로그램을 사용할 수 있습니다. 예: JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. 생성 된 XY 좌표를 사용 하 여 애벌레 궤적 플롯을 추가 애벌레 운동 분석.
    1. 행동 분석에 대 한 시퀀스 실행의 교류로 개별 애벌레 궤적 세그먼트 속도, 경로 곡률, 제목 각도, 탐색 통계를 사용 합니다.
    2. 실행은 앞으로 운동의 연속 기간으로 정의 됩니다. 회전 연속 실행을 구분합니다. 궤적 방향 각도 변경 했다 회전 표시 > 45 ° (구문 파일 참조).
  4. 필요에 따라 길이, 실행된 방향 및 다른 매개 변수를 실행 하는 실행된 속도 대 한 평균 값을 계산 합니다.
    참고: 애벌레 궤도에서 '실행' 하 고 '중지'를 추출 하는 간단한 구문 집합이 제공 됩니다 (구문 파일 참조). 간단한 Matlab 또는 Excel 기반된 함수 '실행된 속도'에 대 한 값을 계산 실행' 길이'를 추출 된 데이터에 적용할 수 있는 등.
  5. ± SEM. 의미 각 행동 메트릭에 대 한 데이터를 나타내는

결과

ORN 활성화의 특이성을 보여 우리의 방법 성공적으로 두 다른 온 (ORN::7a & ORN::42a)의 영향을 결정 하기 위해 적용 된 애벌레 동작 (그림 3)에 (ORNs Or7a 또는 Or42a을 표현) 활성화. 최근 연구는 개별 일치 애벌레 ORNs 기능적으로 뚜렷한1,10,13, 우리의 대표적인 데이터 표현 CsChrimson ORN::7a ?...

토론

여기, 우리가 초파리 애벌레 동작 동시 optogenetic 후 각 뉴런의 활성화에 대 한 응답에서의 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 앞에서 설명한 방법1,를 추적 애벌레8 기술을 사용 하 여 다른 냄새 배달 ORNs를 활성화. 그러나, 이러한 방법은 특이성 또는 온 활성화의 시간적 패턴에 대해 제어할 수 없습니다. 우리의 방법은 온 활성화의 더 정밀 하 ...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 네바다, Reno의 대학에서에서 시작 자금 및 NIGMS 부여 번호 P20 GM103650 건강의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Video camera to capture larval movement
CCD Camera Edmund Optics106215
M52 to M55 Filter Thread AdapterEdmund Optics59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass FilterEdmund Optics46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supplynewegg.com9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relayamazon.com6454319
630nm Quad-row LED strip lightsenvironmentallights.comred3528-450-reel
850nm LED stripsenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylicHome DepotMC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly foodGenesee Scientific66-112
Agarose powderGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm square petri-dishVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SucroseSigma-Aldrich84097
All trans-retinalSigma-AldrichR2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

참고문헌

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

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