간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

요약

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

초록

감염의 항 체 의존 향상 뎅기열 바이러스 성 병 인에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 허용 되지 않는 세포에 감염을 강화 하기 위하여 항 체 또는 혈 청의 용량을 측정 하는 전통적인 분석 패 분석 실험에 의해 다음 미디어에 바이러스 출력을 사용 하 여 감염을 계량에 의존 했습니다. 더 최근에, 이러한 분석 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 셀 라인에서 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염을 검사 있다. 이러한 두 방법 모두 이러한 기술의 광범위 한 사용을 제한 하는 제한 사항이 있습니다. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 체 외에서 분석 결과 사용 하 여 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자 (RVPs) 녹색 형광 성 단백질 및 항 체 의존 향상 (ADE) 붉은 털에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 DENV 감염의 검사 K562 셀을 나타내는 원숭이 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 후 16 주. 이 기술은 신뢰할 수 있는, 포함 하는 셀의 최소한의 조작, 라이브 복제 유능한 바이러스의 사용을 포함 하지 않습니다 이며 cytometry 사용 하 여 양적 판독을 얻으려면 높은 처리량 형태로 수행할 수 있습니다. 또한이 분석 결과 항 체 의존 향상 (ADE) 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs를 사용할 수 있는 등 다른 flavivirus 감염의 검사에 쉽게 적응 될 수 있다. 분석 결과 설정의 용이성, 데이터를 분석 하 고 결과 해석 하면 높은 대부분의 실험실 설정 의무가 있습니다.

서문

감염의 항 체 의존 향상 (ADE) 그것에 의하여 부분적으로 cross-reactive 항 체 응답 바이러스의 serotype에 의해 유도 된 향상 증가 바이러스 성 복제 및 니 바이러스의 다른 serotype의 과정 이다. 에이드는 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 4 주요 serotypes는 유행에서 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 환자의 하위 집합에서 ADE 뎅 그 열 출혈 성 열 (DHF)와 연결 됩니다. 우리는 최근에 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 에이드의 DENV 체 외 발생 가능성이 DENV 니 vivo에서¹ 의 향상에 기여 하는 DENV cross-reactive 항 체 응답의 상당히 높은 수준의 유도 나타났습니다. ^{, 2}. 항 체 의존 향상 분석 실험은 관련 바이러스 2 차 감염을 강화 flavivirus 감염의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하 고 알려주는 항 체의 능력을 평가 하는 유용한 도구는 백신의 개발입니다.

분석 결과 설명 여기 감염을 일반적으로 허용 하지 않은 K562 셀 함께 DENV RVPs를 사용 합니다. RVPs는 구조적으로 그대로 복제 무능 한 DENV 바이러스 성 입자를 복제³의 단일 라운드 후 표현 되는 하위 게놈 녹색 형광 단백질 (GFP) replicon 인코딩. 이와 같이, RVPs에 감염 되는 세포 형광 녹색 및 cytometry 또는 현미경을 사용 하 여 쉽게 감지가 가능. 이 분석 결과에서 사용 하는 RVPs 상용 소스 로부터 얻은 했다. 그러나 그들은,, 수 다른 바이러스에 대 한 생성 하 고이 원고에서 설명 하는 분석에 사용. 한편, K562 세포는 FcγIII 수용 체 표현 하는 백혈병 세포 선 항 체의 Fc 지역에 바인딩할 하 고 하위 중화 항 체^4,5의 농도 존재 감염 될 있습니다.

에이드 분석 심한 뎅기열 및 생체 외에서 ADE의 메커니즘을 나타내는 위험 요인 조사 연구에서 광범위 하 게 사용 된^6,,78. 여기에 설명 된 에이드 분석 결과 신속 하 고 쉽게 사용할 수 RVPs를 사용 하 여 체 외에서 감염을 강화 하 고 flow cytometry, 현재 사용 중 하나 필요로 하는 다른 분석에 비해 플 라크 형성의 결정에 대 한 혈 청의 용량을 확인 Vero 세포 또는 항 체의 얼룩에 (pfu) 단위 세포^{6,7,,89,10,11}, 둘 다 시간이 소요 되며 노동 감염 집중.

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프로토콜

여기에 설명 된 프로토콜을 설명 하는 데 사용 하는 혈 청 샘플 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회에서 지 내게 및 지역, 주에 대 한 신경 및 연방 정책 이었던 붉은 털 원숭이에서 가져온 국제 (AAALAC)-시설 인가. 모든 동물 실험 했다 검토 하 고 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 샘플 공유 프로토콜 조직을 통해 인수 했다.

1. 주 1

참고: BSL-2 실험실에서 조직 문화에 사용 되는 살 균 층 류 biosafety 캐비닛에 아래 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.

1. 혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 무 균 튜브에 각 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송. 열 물 목욕 또는 온도 조정 가능한 thermomixer 56 ° C에서 30 분 동안 비활성화. 1:1,000 찬 RPMI-10 (10% 태아 둔감 한 혈 청와 RPMI)를 사용 하 여 1: 1에서 배열 하는 혈 청 샘플의 10 연속 희석을 확인 합니다.
2. 살 균 96 잘 V-하단 플레이트의 각 음을 순차적으로 희석된 혈 청 샘플의 10 µ L를 전송 합니다. 고 하지 않고 혈 청 견본과 RPMI-10만 RVPs와 혈 청 샘플 없이 제어 웰 스, RVPs와 RPMI-10의 두 세트를 포함 합니다. 각 혈 청 샘플 및 triplicates RPMI-10 컨트롤을 설정 합니다.
3. -80 ° C 냉동 및 해 동에서 뎅기열 1, 2, 3, 4 RVPs를 제거 37 ° C 물 목욕에서 그들. 해 동된 RVPs 얼음을 즉시 전송 합니다. 각 혈 청 샘플 약 170 µ L RVPs를 얻기 (각 혈 청 희석에 대 한 RVPs x 3 우물의 10 µ L (1:1, 1시 10분, 1: 100, 1:1, 000) 및 10 µ L 각 RVP와 RPMI-10 RVPs x 3 우물의 우물을 제어).
4. 각 잘 96 잘 V-바닥판 혈 청 샘플을 포함 하 고 RVPs (혈 청) 제어 웰 스와 RPMI-10 RVPs의 10 µ L 플라스틱 RVPs RPMI-10만 (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 우물을 추가 하지 마십시오. 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 10 µ L 찬 추가 RPMI-10 대신 각 냉 RPMI-10 RVPs (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 제어 우물만.
5. 인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO₂의 37 ° C에서 1 시간 동안 접시를 품 어. 96-잘 V-바닥판 잠복기 동안 biosafety 70% 에탄올과 캐비닛의 표면을 청소 하 고 15 분 동안 자외선을 실행 합니다.
6. 인큐베이터에서 K562 셀의 완전 confluent T75 플라스 크를 제거 하 고 잘 사용 하 여 살 균 5 mL 피펫으로 세포를 섞어 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 5 mL을 전송.
   참고: K562 셀 RPMI-10에서 유지 되며 1 x 10⁶/mL에서 subcultured.
7. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에서 10 µ L 세포를 제거 하 여 세포의 수를 계산 하 고 10 µ L tryphan 블루 믹스. 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 총 수를 결정 하는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
8. 15 mL 원뿔 세포 ~ 1200 x g에서 10 분간 원심, 상쾌한, 가만히 따르다와 미디어 (10⁶ 세포 /mL x 2.66)의 80, 000 셀/30 µ L의 농도에서 따뜻한 RPMI-10 셀 resuspend.
9. 인큐베이터 (단계 1.6)에서 96 잘 V-바닥판을 제거, 96-잘 V-하단 플레이트의 각 잘 K562 셀 30 µ L 전송 및 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO₂의 37 ° C에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.
10. 1 시간 배양 후 5 분 동안 인큐베이터와 ~ 1200 x g에서 원심 분리기에서 96 잘 V-바닥판을 제거 합니다. 원심, 후 거꾸로 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 접시를 켜서 우물에서 미디어를 가만히 따르다.
11. 따뜻한 RPMI-10의 125 µ L에서 resuspending에 의해 각 잘에서 셀을 세척 하 고 피 펫, 철저 하 게 믹스 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 거꾸로 접시 여 ~ 1200 x g 5 분 Decant 미디어에서 격판덮개 원심. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.
12. 세척, 후 RPMI-10 각, 믹스를 위아래로 피펫으로, 따뜻한 100 µ L을 추가 하 고 5% CO₂의 37 ° C에서 48 h에 대 한 접시를 품 어.

2. 주 3

1. 96-잘 V-바닥판 포함 하는 셀의와 미디어/잘 인큐베이터에서 100 µ L을 제거 하 고 biosafety 캐비닛으로 이동. 멀티 채널 피 펫, 믹스를 사용 하 여 각각의 내용을 잘 셀을 전송 하 고 96 잘 U 아래 미디어 접시 또는에 미리 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 표시.
2. 1%의 100 µ L 96 잘 V-하단 플레이트에 각 잘 린스 Paraformaldehyde (PFA) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 단계 2.1에서에서 96 잘 U-바닥판 또는 레이블된 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 각각 웰 스 전송 최종 수익률 x 1 0.5%의 농도 PFA/잘 또는 튜브. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 믹스, 알루미늄 호 일, 플레이트 커버와 셀을 해결 하기 위해 30 분 동안 인큐베이터에 앉아 보자.
3. 교류 cytometer 준비 (예를 들어 테이블의 자료 를 참조) 흠 없는 K562 셀 측면과 앞으로 분산형 형광 설정 함께 보정을 실행 하 여. 필요한 유일한 형광 채널은 FL1, GFP는 유일한 형광 세포에서 방출. 취득 ~ 30, 000-50000 각 샘플에서 세포.
   참고: 단일 형광을 읽을 수 있는 모든 교류 cytometer로 셀 RVPs 감염 것입니다만, GFP의 존재 때문에 녹색 형광을 방출 하 고 다른 형광 채널 필요 데이터를 위해 사용할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

1. 어떤 흐름 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 교류 cytometer에서 수집한 데이터를 분석 (재료의 표 참조).
   1. 첫 번째 문 집합 기반으로 FSC-A (앞으로 분산형-지역) vs FSC-H (앞으로 분산형-높이) 단일 세포를 포함 분석¹²자동 형광 남자를 제외 하. 다음, SSC에 기반 내의 문이 셀 게이트 (사이드 분산형-지역) vs FSC-A 모든 autofluorescent 파편을 제외 하.
   2. GFP의 표현 SSC A 대 대 한 SSC A vs FSC-A 문이 세포 분석 GFP-. GFP + 셀 주위는 게이트를 설정 하 여 GFP + 혈 청 및 제어 샘플의 각 희석에 대 한 셀의 비율을 결정 합니다.
2. 3 triplicate 우물에 GFP + 셀의 총 비율을 분할 하 여 각 혈 청 샘플 희석 및 제어 우물 GFP + 셀의 평균 비율을 결정 합니다.
3. 감염의 배 향상 GFP + 셀 GFP + RVPs (혈 청 샘플) 제어 웰 스와 RPMI-10에서 셀의 평균 비율을 나눈 각 희석에 대 한 혈 청 샘플의 평균 비율을 나누어 계산 합니다.
4. 희석 (x 축), 대 배 향상 (y 축) 그래프와 Tukey의 다중 비교에 대 한 게시물-특별 테스트 뒤 ANOVA를 사용 하 여 통계 분석을 수행.

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결과

4 붉은 털 원숭이 ZIKV 감염 후 수집 된 16 주 및 DENV-1을 향상 시키기 위해 그들의 잠재력에 대 한 테스트에서 세라, K562 셀에 2, 3, 4 감염. 동물 감염 후 7 일에 의해 탐지의 제한 된 수준에 거부 하는 감염 후 3 일 ~ 10⁵ 부 ZIKV 플라즈마의 RNA/mL의 x 1의 피크 니를 했다. 아니 니 16 주 후 감염에서 플라즈마에서 발견 되었다. 그리고, RVP 분석 결과 수행 위의 프로토콜에 설명 ...

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토론

DENV 및 ZIKV 같은 Flaviviruses 상 동^13,14서로와 cross-react 항 체를 생성 하는 그들의 둘 다 구조와 비 구조 단백질의 중요 한 증거를 공유 합니다. 이러한 cross-reactive 항 체 응답을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 분리 serotype 또는 다른 관련 flaviviruses^1,2. 교차 감염?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348